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Summary

Este protocolo analiza comportamiento navegación de larva de Drosophila en respuesta a la estimulación simultánea de la optogenetic de sus neuronas olfativas. Luz de longitud de onda de 630 nm se usa para activar las neuronas olfativas individuales expresando una rodopsina canal rojo-cambiado de puesto. Movimiento de larvas al mismo tiempo se realiza un seguimiento grabado digitalmente y analizados utilizando el software de medida.

Abstract

La capacidad de navegar hacia fuentes de olor de insectos se basa en la actividad de sus neuronas receptoras olfatorias de primer orden (ORNs). Mientras que se ha generado una cantidad considerable de información sobre respuestas ORN a los aceites, el papel de ORNs específicos en las respuestas del comportamiento de conducción sigue siendo mal entendido. Complicaciones en el análisis de comportamiento se presentan debido a diferentes volatilidades de odorantes que activan las ORNs individuales, múltiples ORNs activados solo olores, y la dificultad en reproducir naturalmente observadas variaciones temporales en estímulos olfativos utilizando métodos convencionales de olor-entrega en el laboratorio. Aquí, describimos un protocolo que analiza la conducta de larvas de Drosophila en respuesta a la estimulación simultánea de la optogenetic de sus ORNs. La tecnología optogenetic utilizada aquí permite la especificidad de la activación de la ORN y control preciso de los patrones temporales de la activación de la ORN. Correspondiente movimiento de larvas se realiza un seguimiento, grabados digitalmente y analizados usando custom software por escrito. Mediante la sustitución de estímulos de olor con estímulos de luz, este método permite un control más preciso de la activación individual de ORN para estudiar su impacto en el comportamiento larval. Nuestro método podría ampliarse aún más para estudiar el impacto de las neuronas de proyección de segundo orden (PNs) además de las neuronas locales (LNs) en comportamiento larval. Este método permitirá así a una disección completa de la función olfativa circuito y complemento de estudios sobre actividades de neurona olfativa cómo traducen en respuestas de comportamiento.

Introduction

Información olfativa en el entorno de una larva de Drosophila es detectada por solamente 21 ORNs funcionalmente diferentes, las actividades de las cuales en última instancia determinar comportamiento larval^1,2,3,4. Sin embargo, relativamente poco se sabe acerca de la lógica por la que está codificada información sensorial en las actividades de estos 21 ORNs. Por lo tanto es necesario medir experimentalmente la contribución funcional de cada larva ORN a comportamiento.

Aunque el perfil de la respuesta sensorial del repertorio entero de ORNs larvas de Drosophila se ha estudiado en detalle^1,4,5, las contribuciones de ORNs individuales al circuito olfatorio y de tal modo a comportamiento de navegación siguen siendo en gran parte desconocidos. En estudios de comportamiento larval, hasta el momento, dificultades debido a la incapacidad de espacial y temporal activar solo ORNs. Un panel de olores que se activan específicamente 19 de los 21 ORNs larvas de Drosophila fue descrito recientemente¹. Cada olor en el panel, en bajas concentraciones, provoca una respuesta fisiológica de su cognado ORN. Sin embargo, en concentraciones más altas que se utilizan normalmente para los ensayos de comportamiento convencional, cada olor provoca respuestas fisiológicas de múltiples ORNs^1,5,6. Además, los olores en este panel han variado volatilidades que complican la interpretación de los estudios de comportamiento que dependen de la formación de gradientes de olor estable^7,8. Por último, naturalmente que ocurren estímulos de olor tienen un componente temporal que es difícil de reproducir en condiciones de laboratorio. Por lo tanto es importante desarrollar un método que puede medir el comportamiento larval mientras que simultáneamente activar ORNs individuales de una manera espacial y temporal.

Aquí, demostramos un método que tiene ventajas sobre el seguimiento de larvas previamente descrito ensayos^1,8. El seguimiento se describe en Gershow et al. emplea válvulas controladas electrónicamente para mantener un gradiente estable de olor en la arena de comportamiento⁸. Sin embargo, debido a la compleja ingeniería para construir la configuración de estímulos de olor, este método es difícil de replicar en otros laboratorios. Además, siguen sin resolverse los problemas relacionados con el uso de aceites para activar específicamente solo ORNs. El seguimiento se describe en Mateo et al. emplea un sistema más simple de olor, pero el gradiente de olor resultante depende de la volatilidad de la prueba de olor y es inestable para las duraciones largas del ensayo¹. Así, mediante la sustitución de estímulos de olor con estímulos de luz, nuestro método tiene las ventajas de especificidad y un control temporal de la activación ORN y no es dependiente en la formación de gradientes de olor de diferentes potencias.

Nuestro método es fácil de configurar y es apropiado para los investigadores interesados en la medición de aspectos de la navegación de larvas de Drosophila . Esta técnica podría adaptarse a otros sistemas de modelo siempre y cuando el investigador es capaz de conducir la expresión de CsChrimson en neuron(s) de su sistema favorito de la elección. CsChrimson es una versión rojo-cambiado de puesto de la rodopsina de la canal. Se activa en longitudes de onda que son invisibles al sistema de phototaxis de la larva. Por lo tanto somos capaces de manipular la actividad de las neuronas con especificidad, confiabilidad y reproducibilidad⁹. Modificando la costumbre escrita software para tener en cuenta para los cambios de tamaño de los sujetos, este método podría ser fácilmente adaptado para reptantes larvas de otras especies de insectos.

Protocol

1. construcción de un estadio de comportamiento y preparación de Hardware para permitir la estimulación Optogenetic en la Arena de comportamiento Para construir una arena de comportamiento privado de luz, construir una caja con una dimensión de 89 x 61 x 66 cm3 (35″ L x 24″ W x 26″ H) hecha de plexiglás color negra las hojas de acrílico (espesor 3 mm) (véase Tabla de materiales). Materiales para construir una caja de esa deben estar disponibles en las ferreterías locales. Colocar esta caja en una mesa en la sala de comportamiento (figura 1A). Monte una cámara monocromática USB 3.0 CCD equipado con un filtro IR largo-paso de 830 nm y una lente de 8 mm F1.4 C-mount (véase Tabla de materiales) al centro del techo de la caja negra. Lugar dos infrarrojos tiras de LED (véase Tabla de materiales) sobre la mesa para iluminar las larvas en el arena oscuro (figura 1A). Para construir la plataforma de LED, obtener una placa de aluminio cuadrada de 22 cm x 22 cm (preferentemente aerosol pintado con un acabado negro mate para eliminar cualquier reflexiones). En el centro de la placa, usando un cortador de metal, corte un agujero lo suficientemente grande como para caber alrededor de la cámara CCD. Cubrir la placa metálica con luces de tira de LED rojo (véase Tabla de materiales). Soldar cables de tira de luz LED en serie y pase los cables de la tira en un relé óptico controlado por un microprocesador de 2B de frambuesa Pi (véase Tabla de materiales) (figura 1B y 2). Instalar y configurar el sistema operativo Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux basado en el procesador de frambuesa Pi antes de conectar el relé óptico a las tiras de LED. Adjuntar una fuente de alimentación para alimentar las tiras de LED y el optoacoplador (figura 2) (véase Tabla de materiales). Montaje de la plataforma de LED alrededor de la cámara de CCD (figura 1B).Nota: Sistema operativo de Ubuntu Mate v16.04 está disponible. Un conjunto de comandos de Python basado en simples puede ser fácilmente adaptado a los patrones del programa de estímulos de luz LED (véase archivo de sintaxis). Asegúrese de irradiación homogénea en varios puntos en el ámbito del comportamiento. Medir la irradiancia absoluta en la superficie de la arena con la ayuda de un espectrómetro y determinar que ~1.3 W/m2 a lo largo de la superficie de la arena.Nota: En esta intensidad, no se observaron cambios significativos de temperatura a lo largo de los experimentos. Otro estudio10 utiliza una mayor irradiancia de ~1.9 W/m2 y había observado sin cambios de temperatura a lo largo de los experimentos. 2. preparación de las larvas de Drosophila para análisis de comportamiento Mantener las moscas en la comida de mosca estándar (véase Tabla de materiales) a 25 ° C, 50-60% de humedad relativa y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h. Para expresar el CsChrimson en un solo par de ORNs, cruzar hembras vírgenes desde la línea de UAS-IVS-CsChrimson a los machos de una línea OrX-Gal4 (‘X’ corresponde a una de 21 receptores de olor larvas (o) genes que se expresan únicamente en cada uno de 21 pares de ORNs)9,11. Alternativamente, para expresar el CsChrimson en todas ORNs larvas 21, cruzar hembras vírgenes de un UAS-IVS-CsChrimson línea machos de una línea de Orco-Gal4 (‘Orco’ es el correceptor que se expresa en todas las 21 ORNs). Utilice línea de UAS-IVS-CsChrimson por sí mismo como un control en estos experimentos.Nota: Las poblaciones de mosca enumeradas aquí están disponibles en el Bloomington Drosophila Stock Center (véase Tabla de materiales). Una vez que las moscas machos y hembras en una cruz se les permite aparearse y poner huevos durante 48 h, transferencia de adultos a un vial nuevo. A la superficie de la cubeta de alimentos que contengan huevos, añadir 400 μL de una mezcla que contiene retinal todo-trans-μm 400 (ATR) disuelto en dimetil sulfóxido (DMSO) y 89 mM sacarosa disuelta en agua destilada.Nota: La pequeña cantidad de sacarosa promueve la alimentación larval de la solución ATR. ATR es un cofactor requerido para regular de CsChrimson expresión9,10. ATR es sensible a la luz. Una vez que ATR se agrega a los frascos de alimentos que contengan huevos, incubar los frascos en la oscuridad por un adicional 72 h.Nota: Mientras que este estudio y los dos estudios anteriores no han observado efectos en la conducta larval por ATR de alimentación, se recomienda controlar los efectos de ATR alimentación sometiendo líneas de prueba a la misma cantidad de la mezcla anterior que no contenga ATR. Extracto de larvas de tercer estadio (~ 120 h después de la puesta de huevos) de la superficie del alimento mosca flotando a través de una solución de sacarosa de alta densidad (15%). Usando una P1000 micropipeta separar las larvas flotan en la superficie de la solución de sacarosa en un vaso de vidrio de 1000 mL. Lave las larvas 3 – 4 veces intercambiando agua destilada 800 mL en el vaso de vidrio cada vez. Permitir que las larvas a reposar 10 min antes de someterlos a la prueba de comportamiento. 3. ensayo de comportamiento Mantener una temperatura constante (entre 22 y 25 ° C) y humedad (entre 50 y 60% HR) en la habitación de comportamiento. Preparar medio reptante larvas vertiendo 150 mL de agarosa fundida (1.5%) en un cuadrado de 22 cm x 22 cm plato de Petri. Una placa de Petri se vierte para cada ensayo de ensayo, ensayos de 8 a 10 por experimento. Permiten agarosa solidificar y enfriar durante 1 – 2 h en los platos de Petri antes de usarlos en el análisis del comportamiento. La transferencia de no más de 20 de las larvas de tercer estadio preparadas para el centro del plato de Petri (figura 1C). Cubrir la placa de Petri con su tapa. Coloque el plato Petri en la arena de comportamiento bajo la cámara CCD.Nota: Dependiendo de la experiencia, ensayos de comportamiento típicamente llevan a cabo 3-5 minutos. Si un olor se utiliza en el ensayo para proporcionar señales de orientación, se ha observado que el gradiente de olor resultante permanece estable durante aproximadamente 5 min1. Tiempos de ensayo más largos no son recomendables. No se han observado efectos deletéreos sobre las larvas debido a la deshidratación o de 630 nm rojo una exposición prolongada en estos momentos. Gire en el 850 nm infrarrojo LED fuente de luz para visualizar las larvas en el video. Iniciar la cámara CCD para grabar movimiento de larvas. Utilizando el software asociado con el procesador del Raspberry Pi, programa el procedimiento para administrar patrones adecuados de estimulación de luz roja.Nota: Un conjunto de comandos de Python basado en simples puede ser fácilmente adaptado a los patrones del programa de estímulos de luz LED (véase archivo de sintaxis). 4. procesamiento de datos y análisis Importar el vídeo grabado de cada ensayo a cualquier software disponible de programación como Matlab. Obtener coordenadas XY de cada larva en una película como una función del tiempo. En límites de software de seguimiento de la base, 15-20 larvas de tercer estadio pueden ser rastreadas en la película solo1,8.Nota: Se proporciona un conjunto de simples códigos de Matlab (‘Tracklarva’) que puede ser fácilmente adaptado a las condiciones apropiadas (véase archivo de sintaxis). Este programa combina todos los ensayos en un experimento y salidas de las coordenadas XY de cada larva para toda la duración del ensayo (ver sintaxis de código a continuación). Alternativamente, uno puede utilizar varios programas basados en código abierto que están libremente disponibles para los investigadores. Por ejemplo JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12. Utilizar las coordenadas XY generadas para trazar trayectorias larvales y más análisis larval locomoción. Para análisis de comportamiento, usar estadísticas de navegación como la velocidad, la curvatura de la trayectoria, ángulo de partida, para segmentar trayectorias individuales de larvas en alterna secuencias de carreras y vueltas. Carreras se definen como períodos continuos de movimiento hacia adelante. Vueltas separan las ejecuciones. Vueltas se marcan cuando los cambios a los ángulos de orientación de la trayectoria fueron > 45° (véase archivo de sintaxis). Calcular los valores promedio de velocidad de ejecución, ejecutar la longitud, dirección ejecución y otros parámetros como sea necesario.Nota: Se proporciona un conjunto de sintaxis simple para extraer larvas trayectorias ‘funciona’ y ‘para’ (véase archivo de sintaxis). Simple Matlab o Excel funciones base pueden aplicarse a los datos extraídos se calcular valores para ‘speed run’, ‘ longitud ‘ etcetera. Representar datos para cada métrica de comportamiento como media ± SEM.

Representative Results

Para demostrar la especificidad de la activación de la ORN, nuestro método se aplicó con éxito para determinar el impacto de dos diferentes ORN (ORN::7a y ORN::42a) activación (ORNs manifieste su Or7a o Or42a) en el comportamiento larval (figura 3). Consistente con estudios recientes que individuales ORNs larvas son funcionalmente distintos1,10,13, nuestros dato…

Discussion

Aquí, describimos un método que permite la medición de la conducta de larvas de Drosophila en respuesta a la activación de la optogenetic simultánea de neuronas olfativas. Descrito larvas seguimiento métodos^1,8 utilizan la tecnología de entrega diferente olor para activar ORNs. Sin embargo, estos métodos no pueden controlar la especificidad o patrones temporales de la activación de la ORN. Nuestro método supera estos déficits mediante estímul…

Materials

Video camera to capture larval movement
CCD Camera	Edmund Optics	106215
M52 to M55 Filter Thread Adapter	Edmund Optics	59-446
2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses	Edmund Optics	59-445
RG-715, 2" Sq. Longpass Filter	Edmund Optics	46-066
Electronics for optogenetic setup
Raspberry Pi 2B	RASPBERRY-PI.org	RPI2-MODB-V1.2
3 Channel programmable power supply	newegg.com	9SIA3C62037092
8 Channel optocoupler relay	amazon.com	6454319
630nm Quad-row LED strip lights	environmentallights.com	red3528-450-reel
850nm LED strips	environmentallights.com	wp-4000K-CC5050-60×2-kit
Software
Matlab	Mathworks Inc.
Ubuntu MATE v16.04	Nubuntu	https://github.com/yslo/nubuntu
Other items
Plexiglass black acrylic	Home Depot	MC1184848bl
Fly food and other reagents
Nutrifly fly food	Genesee Scientific	66-112
Agarose powder	Genesee Scientific	20-102
22cm X 22cm square petri-dish	VWR Inc.	25382-327
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097
All trans-retinal	Sigma-Aldrich	R2500
Flies
UAS-IVS-CsChrimson	Bloomington Drosophila Stock Center	55134
Orco-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	26818
Or42a-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	9970
Or7a-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	23907