Artículo de método

Construcción de Thioether/sulfuro de vinilo-atado Hydrothiolation de péptidos helicoidales mediante foto-inducida tiol-eno/Ino

DOI:

10.3791/57356

⸱

1 de agosto de 2018

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Presentamos un protocolo para la construcción de vinilo thioether sulfuro atado helicoidales péptidos mediante foto-inducida tiol-ene/tiol-Ino hydrothiolation.

Resumen

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Aquí, describimos un protocolo detallado para la preparación de péptidos thioether atado con hydrothiolation en resina intramolecular/intermoleculares tiol-ene. Además, este protocolo describe la preparación de péptidos vinilo-sulfuro-atado con hydrothiolation en solución tiol-Ino intramolecular entre residuos de cisteína y producto que poseen cadenas laterales de alkene/alquino en i, i + 4 posiciones. Péptidos lineales fueron sintetizados usando una síntesis de péptidos de fase sólida basado en el Fmoc estándar (SPPS). Tiol-ene hydrothiolation se lleva a cabo mediante una reacción intramolecular de thio-ene o una reacción intermolecular thio-ene, dependiendo de la longitud del péptido. En esta investigación se lleva a cabo una reacción intramolecular de thio-ene en el caso de péptidos más cortos utilizando en resina de desprotección de los grupos del trityl de después de la completa síntesis del péptido lineal de residuos de cisteína. La resina entonces se fija a la irradiación UV con fotoiniciador 4-methoxyacetophenone (mapa) y 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). La reacción intermolecular tiol-ene se lleva a cabo por Fmoc-Cys-OH se disuelve en un solvente de N, N- dimetilformamida (DMF). Esto es entonces reaccionó con el péptido utilizando el residuo de alkene-rodamiento en la resina. Después de eso, la macrolactamization se lleva a cabo utilizando hexafluorofosfato de benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (TOHB) y 4-Methylmorpholine (NMM) como reactivos de activación en la resina. Después de la macrolactamization, se continúa la síntesis de péptidos mediante SPPS estándar. En el caso de la hydrothiolation de thio-Ino, el péptido lineal es hendido de la resina, secado y posteriormente se disuelve en DMF desgasificada. Esto entonces se irradia con luz UV de fotoiniciador 2,2-dimetoxi-2-Fenilacetofenona (DMPA). Después de la reacción, DMF se evapora y el residuo crudo se precipita y purificado utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Estos métodos podrían funcionar para simplificar la generación de péptidos cíclicos thioether atado debido al uso de la química click thio-eno/Ino que posee grupo funcional superior tolerancia y buen rendimiento. La introducción de bonos thioether péptidos aprovecha la naturaleza nucleofílica de residuos de cisteína y es redox inertes con respecto a enlaces de disulfuro.

Introducción

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El desarrollo de ligandos para modular las interacciones proteína-proteína (IBP) proporciona un enfoque atractivo para el descubrimiento de medicamentos modernos. Así, se ha invertido mucho esfuerzo en estudiar modalidades química novedosas que eficientemente podrían modular los IBP1,2,3. Protones generalmente consisten en superficies de interacción superficiales, grandes o descontinuadas, y pequeñas moléculas típicamente se consideran ligandos inadecuados para la modulación de los IBP4,5. Con una conveniente expuesta....

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Protocolo

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1. preparación de equipo

  1. Para el aparato de síntesis de péptidos manual, coloque un colector de vacío (Tabla de materiales) en una eficiente campana extractora. A continuación, colocar llaves de tres vías sobre el colector de vacío y conectar a una tubería de gas nitrógeno o argón. Todas las entradas no utilizadas mediante tabiques de goma de la tapa.
  2. Conectar columnas llenas de resina (0,8 x 4 cm, depósito de 10 mL, ver Tabla de materiales) al colector utilizando las llaves de tres vías (figura 1). Utilice una bomba conectada a un sistema de vacío como filtración de vacío o un bulbo d....

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Resultados

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Los espectros de HPLC y MS del péptido Ac-y más5AAAC-NH2 y su producto ciclizados CA - Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] - NH2 que se generaron con la fotoreducción en resina intramolecular tiol-ene se representan en figura 6B. péptido cíclico fue encontrado para tener un peso molecular idéntico con respecto a su precursor lineal. Sin embargo, su tiempo de retención HPLC se observó que aproximadamente 2 minutos antes que el d.......

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Discusión

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En la ciclización de la resina en intramolecular thio-ene descrita en la figura 3, la eliminación del grupo trityl de un residuo de cisteína fue encontrada para ser un paso crítico para la fotoreducción posterior. Además, el peso molecular de péptidos antes y tras que la reacción fue encontrada para ser idéntico como representan en la Figura 6B. Por lo tanto, el uso de una identificación de HPLC o un ensayo DTNB es necesaria para el seguimiento de la reacción. E.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores reconocen el apoyo financiero de la Fundación de subvenciones de China de Ciencias naturales (no. 21372023, 21778009 y 81701818); el Ministerio de ciencia y tecnología de la República Popular de China (Nº 2015DFA31590); el Shenzhen Ciencia y tecnología Comité de innovación (no. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 y GJHS20170310093122365); y la Fundación de ciencia Postdoctoral de China (no. 2017 M 610704).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Resina MBHA de Rink Amide (0,53 mmol/g)HECHENGGRM50407
Aminoácidos estándar protegidos con FmocGL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-metil-2-pirrolidinonaShenzhen endi Biotechnology Co.Ltd.3230
N,N-dimetil formamida dañina para laEnergíaB020051la piel
dañina DiclorometanoEnergíaW330229la piel dañina
N,N-DiisoproiletilaminaAldrich9578irritante
Ácido trifluoroacéticoJ& K101398corrosivo
TriisopropilsilanoJ& K973821
1,2-EthanedithiolJ& K248897hedor
2-(6-cloro-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio hexafluorofosfato GL Biochem (Shanghái) Ltd.
MorfolinaAldrichM109062 irritante
Éter dietílicoAldrich673811inflamable
AcetonitriloAldrich9758toxicidad Metanol
Aldrich9758toxicidad
2-hidroxi-1-[4-(2-hidroxietoxi)-fenil]-2-metil-1-propanonaEnergíaA050035
4-metoxiacetofenonaEnergíaA050098
2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenonaEnergíaD070132
5,5'-Dithiobis-(2-ácido nitrobenzoico)J& K281281
benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonato de hexafluorofosfatoEnergíaE020172
1-hidroxibenzotriazolEnergíaD050256
4-metilmorfolinaEnergíaW320038
cromatografía líquida de alta resoluciónSHIMADZULC-30AD
Masa de ionización por electrospraySHIMADZULCMS-8030
LiofilizadorLabconcoFreeZone
Sistema de concentración SpeedVacColectorSavant
PromegaA7231
llaves de paso de tres víasBio-Rad7328107
columnas de cromatografía de poli-preparación Bio-Rad7311550
piel 851012 de vacío Thermo

Referencias

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  1. Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
  2. Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H.

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