Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia

Peter B. Rogers; Elizabeth Hiltbold Schwartz

doi:10.3791/57365

Artículo de método

Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia

DOI:

10.3791/57365

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10 de agosto de 2018

Peter B. Rogers¹ , Elizabeth Hiltbold Schwartz¹

¹Department of Biological Sciences, Auburn University

En este artículo

Resumen

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Aquí proporcionamos un método para la identificación y aislamiento de grandes cantidades de GM-CSF por células mieloides con clasificación de celda de alta velocidad. Pueden identificarse cinco poblaciones distintas (progenitores mieloides comunes, progenitores de granulocitos/macrófagos, monocitos, macrófagos derivados de monocitos y DCs derivados de monocitos) basado en la expresión Ly6C y CD115.

Resumen

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Cultivos de células dendríticas derivadas de monocitos (moDC) generadas a partir de médula ósea de ratón usando Factor de estimulante de Colonia del Granulocyte-macrófago (GM-CSF) han sido reconocidos recientemente para ser más heterogéneos que apreciado previamente. Estas culturas habitualmente contienen moDC derivados de monocitos y macrófagos (moMac) e incluso algunas menos desarrolladas células tales como monocitos. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método coherente para la identificación y separación de los diversos tipos de células presentes en estas culturas que se desarrollan, por lo que sus funciones específicas pueden ser investigada más a fondo. La estrategia de clasificación presentada aquí separa las células primero en cuatro poblaciones basadas en expresión de Ly6C y CD115, los cuales se expresan transitoriamente por las células que se desarrollan en la cultura impulsada por el GM-CSF. Estas cuatro poblaciones incluyen comunes progenitores mieloides o CMP (Ly6C, CD115), progenitores de granulocitos/macrófagos o GMP (Ly6C +, CD115), monocitos (Ly6C +, CD115 +) y macrófagos derivados de monocitos o moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c se agrega también a la estrategia de clasificación para distinguir dos poblaciones dentro del Ly6C, CD115-población: CMP (CD11c-) y moDC (CD11c +). Finalmente, dos poblaciones pueden ser distinguidas más lejos dentro del Ly6C, CD115 + población basado en el nivel de expresión II de la clase de MHC. MoMacs expresan bajos niveles de MHC de clase II, mientras que un precursor DC derivados de monocitos (moDP) expresa mayor MHC de clase II. Este método permite el aislamiento fiable de varias poblaciones con distinta en números suficiente para una variedad de análisis funcionales y de desarrollo. Destacamos una tal lectura funcional, la respuesta diferencial de estos tipos celulares a la estimulación con patrones moleculares Pathogen-Associated (PAMPs).

Introducción

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Cultivo de células de médula ósea murina con la citoquina Factor de estimulante de Colonia del Granulocyte-macrófago (GM-CSF) es ampliamente utilizado como un método para generar células dendríticas derivadas de monocitos (moDC; también conocido como DC inflamatoria) en gran número ¹^, ²^,³^,⁴^,⁵. Estas células han sido extremadamente útiles en una variedad de estudios de la función de células dendríticas (DC) ⁶^,⁷^,⁸. ....

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Protocolo

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Todo trabajo animal fue aprobado por la Auburn University institucional Animal Care y uso según las recomendaciones indicadas en la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud.

1. preparación para la recolección de médula ósea

Preparar medios completo 250 mL mediante la adición de una solución de medio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con suero de ternera fetal 10%, glutamina 2 mM y 50 μm 2-Mercaptoetanol en la parte superior de una unidad de matraz 0.22 μm filtro de vacío y aplicar vacío.
Nota: Medio completo puede conservarse a 4 ° C hasta 2 meses.

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Resultados

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En un esfuerzo por mantener tantos canales disponibles para el análisis como posibles, viables las células habitualmente fueron seleccionados basados en la dispersión hacia delante y lateral, excluyendo eventos muy pequeños y muy granulares (una puerta típica se aplica a todos lo punto parcelas en figura 1A). Para determinar si esta estrategia bloquea excluye confiablemente las células muertas, manchó con 7-Amino actinomicina D (7-AAD) (f.......

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Discusión

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Este protocolo facilita el aislamiento de GM-CSF-conducido progenitoras y precursoras tipos celulares en una cantidad suficiente para varios tipos de análisis incluyendo ensayos bioquímicos, análisis de la función celular in vitro, o la instilación in vivo. Este método representa un avance significativo en el campo del desarrollo de células dendríticas derivadas de monocitos, lo que permite el aislamiento fiable e identificación de células en esta vía de desarrollo, así como los tipos de células diferen.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen de revelar los conflictos.

Agradecimientos

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Estamos muy agradecidos por la asistencia técnica de Alison iglesia Bird en el Auburn Universidad de medicina veterinaria de flujo citometría de planteles escolares, para la financiación de los NIH para EHS R15 R15 AI107773 y al programa de Biología Molecular en la Universidad de Auburn y celular para la financiación de investigación de verano para PBR.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
Suero fetal para terneros (FCS)	HyClone	SV30014.04	para complementar el medio completo y FWB
GlutaMAX	Gibco	35050	para complementar el medio completo
2-mercaptoetanol (2-ME)	MP Biomedical	190242	para complementar el medio completo
75 mM Filtro de vacío Thermo	Scientific	156-4045	para esterilizar medios completos
Tampón de lisis ACK	Lonza	10-548E	para lisar glóbulos rojos
Tampón HBSS	Corning	21-020-CM	para rescatar leucocitos después de la lisis de glóbulos rojos
Solución salina tamponada con fosfato (PBS),	Lonza	17-512F	debe estar libre de endotoxinas; enfriado a 4 & grados; C
35 y micro; m Filtro de células	Falcon	352235	para separar los grumos antes de pasar por el citómetro.
GM-CSF	Biosource	PMC2011	concentración utilizable de 10 ng/mL
Placa tratada con cultivo de tejidos	VWR	10062-896	para células de médula ósea después
Anti-Ly6C, clon HK1.4	Biolegend	128018
Anti-CD115, clon AFS98	Tonbo Bioscience	20-1152-U100
Anti-CD11c, clon HL3	BD Biosciences	557400	para diferenciar CMP y MoDCs
Citómetro de flujo MoFlo XPD	Beckman Coulter	ML99030
BD Accuri C6	BD Biosciences	660517
100% etanol	Pharmco-Aaper	111000200CSPP
Placa de Petri de 60 mm	Corning, Inc
50 mL Tubo cónico	VWR	21008-242
C57BL/6 Ratones	The Jackson Laboratory		000664 Mujer; 10-20 semanas de edad
Campana de bioseguridad	Thermo Scientific	8354-30-0011
Jeringa de 10 mL	BD Biosciences	301604
Aguja de 23 G	BD Biosciences
Centrífuga 5810 R	eppendorf	22625501
FlowJo Software v10	BD Biosciences	Versión 10	flowjo.com

de Dulbecco de la recolección 353002 305145

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
Zhan, Y., et al.

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Etiquetas

Expresi n de Ly6C y CD115 CD11c y MHC Clase II An lisis por Citometr a de Flujo Cultivo con GM CSF Lavado de M dula sea Tamp n de Lavado FACS

Generación de un gran número de progenitores mieloides y células dendríticas precursores de médula Murine usando una célula nueva clasificación estrategia

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