Artículo de método

Eléctricamente conductivo andamio modular y entregar las células madre

DOI:

10.3791/57367

⸱

13 de abril de 2018

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1Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University School of Medicine, 2Stanford Stroke Center and Stanford University School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe la fabricación de un sistema de cultivo celular para permitir la siembra de células madre en un andamio de polímero conductor en vitro la estimulación eléctrica y posterior en vivo la implantación del andamio sembrado de células madre usando un técnica mínimamente invasiva.

Resumen

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Terapia de células madre se ha convertido en una carrera emocionante terapéutica, pero el método óptimo de entrega es incierto. Mientras que la técnica de microinyección se ha utilizado durante décadas para proporcionar células madre en modelos de ictus, esta técnica está limitada por la falta de capacidad para manipular las células madre antes de la inyección. Este artículo detalla un método de usar un andamio de polímero conductivo para la entrega de la célula de vástago. Estimulación eléctrica de las células madre utilizando un andamio de polímero conductor altera la supervivencia celular, respuesta inflamatoria y remodelación sináptica en los genes de la célula de vástago. Después de preacondicionamiento eléctricos, las células madre en el andamio se trasplantan intracranially en un modelo de rata de oclusión distal de la arteria cerebral media. Este protocolo describe una técnica poderosa para manipular las células madre a través de un andamio de polímero conductor y crea una nueva herramienta para desarrollar terapia basada en células madre.

Introducción

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Accidente cerebrovascular es la segunda causa de muerte en el mundo y la quinta causa de muerte en los Estados Unidos. A pesar de estas tasas de mortalidad altas, tratamientos para la recuperación del derrame cerebral en la actualidad siguen siendo un desafío no viables opciones médicas disponibles en la actualidad1. Hay actualmente sobre 300 ensayos clínicos relacionados con accidentes cerebrovasculares isquémicos, de los cuales sólo 40 utilizar células madre. Estudios previos han demostrado que terapias con células madre tienen un efecto beneficioso sobre tiempos reparación2,3. Factor....

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Protocolo

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Todas las células y procedimientos animales fueron aprobados por el Comité de supervisión de investigación de la célula de vástago de Stanford y por el Panel administrativo de la Universidad de Stanford en laboratorio Animal Care (SCRO-616 y APLAC-31909).

1. de la aguafuerte del vidrio de ITO

  1. Preparar el óxido de estaño indio (ITO)-portaobjeto cubierto mediante la colocación de un agente de enmascaramiento sobre el lado del conductor del vidrio.
    Nota: Cintas transparentes más comerciales pueden utilizarse como un agente de enmascaramiento.
    1. Quitar la máscara exceso usando una hoja, dejando solamente la forma deseada del ....

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Resultados

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El esquema que se muestra en la figura 1 representa el flujo de trabajo general de la estimulación eléctrica de hNPCs y posibles aplicaciones posteriores. Una limitación actual en terapia de células madre es que las células madre están expuestas a un ambiente áspero de poste-trasplante incluyendo inflamación y condiciones isquémicas. Estas difíciles condiciones que puedan limitan su eficacia terapéutica14,1.......

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Discusión

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Creciente evidencia ha demostrado la promesa de las células madre como terapia de movimiento nuevo. Esta promesa ha dado lugar a un importante esfuerzo para avanzar en la terapéutica de células madre a la cabecera del paciente con al menos 40 ensayos clínicos completados o en curso. Patología cerebrovascular ofrece un único trastorno neurológico que se presta a la terapia de células madre porque después de la injuria aguda, no existe ningún proceso de neurodegenerativas prevención recuperación. El mecanismo exacto de la .......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses con este trabajo.

Agradecimientos

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Agradecemos a Dr. Kati Andreasson (Departamento de Neurología y ciencias neurológicas, Universidad de Stanford) para el uso de la máquina de qRT-PCR. El trabajo fue financiado por institutos nacionales de salud subvenciones K08NS098876 (a P.M.G.) y Beca Postdoctoral del Decano de la Facultad de medicina de Stanford (en B.O.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
FGF-BasicInvitrogenCTP026120 ng/mL para medios de trabajo
MatrigelCorningcb40234adilución 1:200
LIF Protein, Recom. Hum. (10 µ g/mL)EMD MilliporeLIF101010 ng/mL para medios de trabajo
Sylgard 184 silicona 3,9 kgFisherbrandNC0162601
Ácido clorhídricoFisherbrandSA56-4
Concentrado de ácido nítrico (certificado) ACS, Fisher ChemicalFisherbrandSA95
ITO GlassDelta TechnologiesCG-40IN-0115
Dodecilbencenosulfonato de sodioSigma289957-1KG
PyrroleSigma131709-500MLProteja la solución de pirrol de la luz y la temperatura ambiente
8 cámaras de deslizamiento de vidrio de pocillosThermo Sci Nuc 125658Separe la cámara de la celda y manténgala en condiciones esterilizadas
Soporte de superficie plana, 3"x1"McMaster-Carr 1030A4
PINTURA PLATEADA DE DOS PARTES 14GCiencias de Microscopía Electrónica 1264214Mezcle dos partes (1:1) en una placa de plástico
DPBS, 1x, con Ca y Mg, sin Phenol RedGenesse 25-508C
AB2 ArunA Kit de medios de cultivo de células neuronalesAruna Biomedical ABNS7013.2
hNP1 Kit de expansión de progenitores neurales humanosAruna Biomedical   hNP7013.1
Válvula de ajuste de flujo sin contacto, latón niquelado, para tubo de 3/32" a 5/8" de diámetro exteriorMcMaster-Carr 5330K22
MultímetroKeysight E3641A Generador de
espuma de ondaKeysight33210A-10MHz
Mallas PtSigma-Aldrich 298107-425MGElectrodo de referencia con dimensiones, 1x1 cm
VIVO/MUERTO Kit de Viabilidad/Citotoxicidad, para células de mamíferosThermo Fisher Scientific L3224
BDNFThermo Fisher Scientific 
THBS1Thermo Fisher Scientific 
GAPDHThermo Fisher Scientific 
Mini Kit RNeasy (250)Qiagen74106
QIAtrituradora (250)Qiagen79656
Juego de DNasa sin RNasa (50)QIAGEN79254
iScript Kit de síntesis de ADNc, 100 x 20 y micro; L rxnsBIORAD1708891
TaqMan Gene Expression Master MixThermo Fisher Scientific 
7-8 semanas de edad, macho, ratas RNUNCI-Frederick
4-0 Ethicon Sutura de sedaeSutures.com683G
IsofluranoHenry Schein29405
V-1 Sistema de anestesia de mesa para animales de laboratorioVetEquip901806
Surgicel Original Hemostático AbsorbibleEthicon1952
Instrumento estereotáxico estándar de laboratorio, RatStoelting51600
Kimberly-Clark Professional  Safeskin Guantes de examen estériles de nitrilo púrpuraFisherbrand19-063-130
Cortina estérilMedlineDYNJSD1092
Thermo Scientific  Mango de hoja de bisturí de acero inoxidable Shandon, sostiene n.º 20-25 hojasFisherbrand53-34
Walter Stern Hoja de bisturí serie 300Fisherbrand17-654-456
QuantStudio 6 Flex Sistema de PCR en tiempo realThermo Fisher Scientific4484642
Frazier Micro Seccionador AparatoHarvard52-2706
Hs02718934_s1Hs00962908_m1Hs02758991_g14369510

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  2. George, P. M., et al. Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery....

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