El aislamiento y cultivo de células epicárdicas principales derivan de ejemplares de corazón humano adulto y Fetal

Resumen

El epicardio desempeña un papel crucial en el desarrollo y la reparación del corazón células y factores de crecimiento para la pared miocardio. Aquí, describimos un método para las células epicárdicas primaria humanas cultura que permite el estudio y comparación de sus características de desarrollo y adultos.

Resumen

El epicardio, un capa de células epiteliales que cubre el miocardio, tiene un papel fundamental durante el desarrollo cardíaco, así como en la respuesta de reparación del corazón después de lesión isquémica. Cuando se activa, las células epicárdicas se someten a un proceso conocido como epitelial de transición mesenquimal (EMT) para proporcionar a las células para regenerar miocardio. Además, el epicardio contribuye mediante la secreción de factores paracrinos esencial. Para apreciar el potencial regenerativo del epicardio, se requiere un modelo de célula humana. Aquí esbozamos un modelo de cultura de célula novela para derivar las células derivadas epicárdicas primarias (EPDCs) del tejido cardiaco adulto y fetal humano. Para aislar EPDCs, el epicardio es disecado desde el exterior de la pieza de corazón y transformar en una suspensión unicelular. A continuación, EPDCs son plateados y cultivadas en medio de la CDEP que contiene el inhibidor de la 5-quinasa ALK SB431542 mantener su fenotipo epitelial. EMT es inducida por la estimulación con TGFβ. Este método permite, por primera vez, el estudio del proceso de EMT epicárdico humano en un ambiente controlado y facilita el obtener una visión más clara en el secretoma de EPDCs que puede ayudar a la regeneración del corazón. Además, este enfoque uniforme permite la comparación directa de la conducta humana adulta y fetal epicárdico.

Introducción

El epicardio, un capa epitelial unicelular que sobres el corazón, es de vital importancia para el desarrollo cardíaco y reparación (revisado en Smits et al. ¹). retraso mental, el epicardio deriva el órgano proepicárdicas, una pequeña estructura situada en la base del corazón en desarrollo. Desarrollo día E9.5 en Concepción después de 4 semanas en ser humano y el ratón, las células comienzan a migrar desde esta estructura de coliflor y cubrir el desarrollo del miocardio². Una vez que se forma una capa única de células epiteliales, una porción de las células epicárdicas sufre epitelial de transición mesenquimal (....

Protocolo

Todos los experimentos con muestras de tejido humano fueron aprobados por el Comité de ética de la Leiden University Medical Center y se ajusta a la declaración de Helsinki. Todas las medidas se realizan con equipo estéril en un flujo de la cultura de célula gabinete.

1. preparaciones

1. Preparar medio de DAPC mezcla de Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM low-glucosa) y medio 199 (M199) en una proporción 1:1. Agregar 10% calor inactiva el suero bovino fetal (FBS, calor inactivada durante 25 minutos a 56 ° C) y completar con 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 mg/mL. Caliente previamente el medio de DAPC en un baño ....

Resultados

Aquí, describimos un protocolo sencillo para aislar EPDCs de tejido humano adulto y fetal cardiaco (figura 1). Este protocolo aprovecha la ubicación fácilmente accesible del epicardio en la parte exterior del corazón (figura 1A). La coloración de la aurícula del corazón después de disección demuestra que el WT1 + epicardio se retira mientras que la subyacente subepicárdico matriz extracelular y tejido miocárdico permanecen intact.......

Discusión

Aquí describimos un protocolo detallado para aislar y la cultura primarias epicárdicas células derivadas de los corazones humanos adultos y fetales. Amplia caracterización de estas células ha sido previamente publicado¹⁷. Hemos demostrado que se pueden mantener ambos tipos de células como las células epiteliales de adoquines-como cuando se cultivan con el inhibidor de la cinasa del ALK5 SB431542. EMT es una parte integral de activación epicárdica en vivo durante el desarrollo y la respues.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dulbecco' Águila modificada' s medio + GlutaMAX	Gibco	21885-025
Medio 199	Gibco	31150-022
Suero fetal bovino	Gibco	10270-106
Tripsina 0.25%	Invitrogen	25200-056
Penicilina G sal sódica	Roth	HP48
Sulfato de estreptomicina	Roth	HP66
Tripsina 1:250 de páncreas bovino	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
Gelatina de piel porcina	Sigma-Aldrich	G1890
Placas de cultivo de 6 pocillos	Greiner bio-one	657160
Placas de cultivo de 12 pocillos	Corning	3512
Placas de cultivo de 24 pocillos	Greiner bio-one	662160
SB 431542	Tocris	1614
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Merck	102931
100-1000y micro; L Puntas de pipeta filtradas	Corning	4809
de 10 ml	Greiner bio-one	607180
pipeta de 5 ml	Greiner bio-one	606180
Placa de cultivo celular 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	caseros y esterilizados
1,5 mL	Eppendorf
Tubos de centrífuga de 15 ml	Greiner bio-one	188271
Tubos de centrífuga de 50 ml Jeringa	Greiner bio-one	227261
Calibre 19	Becton Dickinson	301700
Agujas Calibre 21	Becton Dickinson	304432
Tamices celulares EASYstrainer, 100 µ m	Greiner bio-one	542000
TGFβ 3	R& D systems	243-B3
Antiactina monoclonal, α-Músculo liso	Sigma	A2547
Anti-Ratón Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Equipment
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Pipeta P1.000	Gilson	F123602
Controlador de pipetas	Integra	155 015
Microscopio estereoscópico	Leica	M80
Microscopio de luz invertida	Olympus	CK2
Centrífuga	Eppendorf	5702
Baño de agua	GFL	1083

pipeta O tubos Eppendorf 0030120086 10 mL Becton Dickinson Agujas 305959