Proyección de SiRNA de alto rendimiento para lesión de célula epitelial cloropicrina y córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno

Resumen

Pequeña proyección inhibitoria de RNA alto rendimiento es una herramienta importante que podría ayudar a aclarar más rápidamente los mecanismos moleculares de la lesión epitelial córnea química. Adjunto, presentamos el desarrollo y validación de modelos de exposición y métodos para el cribado de alto rendimiento de lesiones epiteliales de córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno y la cloropicrina.

Resumen

Lesión ocular inducido por la sustancia tóxica es una verdadera emergencia ocular debido a productos químicos tienen el potencial para causar rápidamente daño tisular significativo. Tratamientos para la lesión corneal inducida por tóxicos son generalmente apoyo como no terapéutica específica existen para tratar estas lesiones. En los esfuerzos para el desarrollo de tratamientos y terapias para cuidar de la exposición, puede ser importante comprender los mecanismos moleculares y celulares de estas lesiones. Proponemos que utilización de la detección de RNA (siRNA) inhibitorio pequeño alto rendimiento puede ser una importante herramienta que podría ayudar a aclarar más rápidamente los mecanismos moleculares de la lesión epitelial córnea química. siRNA son doble trenzadas moléculas de ARN que son 19-25 nucleotides largos y utilizan el vía para degradar el mRNA de silenciamiento del gen postranscripcional que tienen homología con el siRNA. La reducción resultante de la expresión del gen específico entonces se puede estudiar en células expuestas sustancias tóxicas para determinar la función de ese gene en la respuesta celular a los tóxicos. El desarrollo y validación de modelos de exposición en vitro y métodos para el alto rendimiento (HTS) de detección de fluoruro de hidrógeno (HF) y cloropicrina-(CP) inducida por lesión ocular se presentan en este artículo. Aunque hemos seleccionado estas dos sustancias tóxicas, nuestros métodos son aplicables al estudio de otras sustancias tóxicas, con pequeñas modificaciones en el protocolo de la exposición de sustancias tóxicas. El antígeno T grande de SV40 inmortalizó HCEC SV40 fue seleccionado para el estudio de línea de células epiteliales corneales humanas. Viabilidad celular y la producción de IL-8 fueron seleccionados como puntos finales en el protocolo de investigación. Varios problemas asociaron con el desarrollo de la exposición de sustancias tóxicas y se presentan métodos de cultivo celular adecuados para estudios HTS. El establecimiento de modelos HTS para estas sustancias tóxicas permite estudios adicionales entender mejor el mecanismo de lesión y pantalla para terapéutica potencial para lesión ocular química.

Introducción

Lesión ocular inducido por la sustancia tóxica es una verdadera emergencia ocular debido a productos químicos tienen el potencial para causar rápidamente daño tisular significativo. Desafortunadamente, tratamientos para la lesión corneal inducida por tóxicos sólo son generalmente apoyo no terapéutica específica existen para tratar estas lesiones. La estrategia actual de tratamiento es inespecífica e incluye principalmente los tratamientos terapéuticos tópicos tales como lubricantes, antibióticos, y ciclopléjicos seguida de antiinflamatorios (por ejemplo, esteroides) una vez la córnea ha re-epithelialized^{1 ,}

Protocolo

1. célula cultura mantenimiento

1. Crecer la línea celular SV40 HCEC a 37 ° C, 5% CO₂y 90% de humedad en DMEM F-12 con 15% de suero bovino fetal (FBS), 1% L-glutamina, μg/L 10 factor de crecimiento epidérmico (EGF) y la insulina de 5 mg/L.
2. Paso de la línea celular cada 3 a 4 días (dependiendo de la densidad de siembra) para asegurar que confluencia nunca supera el 80% durante el mantenimiento de la cultura.
3. Separar las células de matraces con un desprendimiento (solución 14 mL por cada frasco de 150 cm² ) e incubación a 37 ° C durante no más de 8 minutos.
4. Neutralizar la solución de separación con un volumen ig....

Resultados

Desarrollo de métodos de exposición

Había refinado y evaluar la idoneidad de la línea de células epiteliales corneales humanas SV40 HCEC para su uso en estudios HTS. SV40-HCEC se inmortalizó con el antígeno T grande de SV-40 y fueron un regalo de Dhanajay Pal²³. Había demasiadas variables exploradas en el desarrollo de la metodología de exposición para presentar concisamente aquí, y por l.......

Discusión

Adjunto describimos nuestros métodos y resultados en el desarrollo de una célula epitelial de la córnea de alto rendimiento modelo para el estudio de lesiones en HF y CP de detección. También se presentan los resultados de la pantalla de siRNA primario para lesiones de HF. Hubo muchos desafíos para el desarrollo de modelos HTS para el estudio de las lesiones TIC. Métodos que podríamos encontrar en la literatura relacionada con el estudio de HF, HFA o CP en modelos de cultivo celular fueron de poca ayuda. Mayoría en v.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Plataforma de manipulación de líquidos Bravo	Agilent o equivalente	G5409A
Agitador de placas Bravo	Agilent o equivalente	Opción 159
Bravo 96LT Cabezal de punta desechable	Agilent o equivalente	Opción 178	Unidad de cabezal de pipeteo de punta grande de 96 canales
Bravo 96ST Cabezal de punta desechable	Agilent o equivalente	Opción 177	Pipeteo de punta pequeña de 96 canales unidad principal
Bravo 384ST cabezal de punta desechable	Agilent o equivalente	Opción 179	de cabezal de pipeteo de punta pequeña de 384 canales
Bravo 96 250 μ L puntas de barrera estériles	Agilent o equivalente	19477-022
Bravo 384 30 μ L puntas de barrera estériles	Agilent o equivalente	19133-212
Bravo 384 70 μ L puntas de barrera estériles	Agilent o equivalente	19133-212
Lector de placas multimodo EnSpire	Perkin Elmer o equivalente	2300-0000	Detector de ensayo AlphaLISA con excitación láser de alta potencia
IL-8 (humano) Kit de detección AlphaLISA	Perkin Elmer o	equivalente AL224F	basado en perlas sin lavado
ProxiPlate-384 Plus microplacas blancas de 384 pocillos poco profundos	Perkin Elmer o equivalente	6008359
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen o equivalente	13778500	Reactivo de transfección
Opti-MEM 1 Medio de suero reducido	Invitrogen o equivalente	31985070
TrypLE Express	Gibco o equivalente	12605010	Solución de desprendimiento de células
IncuCyte Zoom	Essen Instruments o equivalente	ESSEN BIOSCI 4473	Microscopio automatizado alojado en incubadora
Cloropicrina	Trinity Manufacturing o equivalente	N/A	Toxicidad aguda e irritante
DMEM-F12 medio de cultivo celular	Invitrogen o equivalente	11330-057	Contiene HEPES
Suero fetal bovino	Invitrogen o equivalente	1891471
factor de crecimiento epidérmico humano (grado de cultivo celular)	Invitrogen o equivalente	E9644-.2MG
Insulina humana recombinante (grado de cultivo celular)	Invitrogen o equivalente	12585-014
Solución de penicilina-estreptomicina (grado de cultivo celular)	Invitrogen o equivalente	15140122
Hidrocortisona (grado de cultivo celular)	Sigma o equivalente	H0888-10G
Glucosa  (grado de cultivo celular)	Sigma o equivalente	G7021
PBS  (grado de cultivo celular)	Sigma o equivalente	P5493
siRNA	Dharmacon o equivalentes	varios
Azul de tiazolil bromuro de tetrazolio	Sigma o equivalente	M5655	Tampón
siRNA	Termo o equivalente	B002000
placas de cultivo celular de 96 pocillos	Corning o equivalente	CLS3595
T150 matraces	Corning o	equivalente CLS430825
BSL-2 campana de cultivo celular	Nuaire o equivalente	NU-540
Reservorios robóticos de 300 mL	Thermo o equivalente	12-565-572
96 depósitos de automatización con deflectores	Termo o equivalente	1064-15-8
Frascos de almacenamiento desechables estériles de 500 mL	Corning o equivalente	CLS430282
Sellador térmico de microplacas	Termo o equivalente	AB-1443A
Lámina de termosellado de microplacas	Termo o equivalente	AB-0475
Cardamonin	Tocris o equivalente	2509	Antiinflamatorio, utilizado como control positivo
SKF 86002	Tocris o equivalente	2008	Antiinflamatorio, utilizado como control positivo
DMSO	Sigma o equivalente	D8418
Ácido fluorhídrico al 48%	Sigma o equivalente	339261	Toxicidad corrosiva y aguda
1000 μ L Pipetas monocanal	Rainin o equivalentes	17014382
200 μ L Pipetas monocanal	Rainin o equivalentes	17014391
20 μ L Pipetas monocanal	Rainin o equivalentes	17014392
1000 μ L Pipetas de 12 canales	Rainin o equivalentes	17014497
200 μ L Pipetas de 12 canales	Rainin o equivalentes	17013810
20 μ L Pipetas de 12 canales	Rainin o equivalente	17013808
Puntas de pipeta 1000 μ L	Rainin o equivalente	17002920
Puntas de pipeta 200 μ L	Rainin o equivalente	17014294
Puntas de pipeta 20 μ L	Rainin o equivalente	17002928
Campana de gases químicos	Productos metálicos Jamestown	MHCO_229
Placas de almacenamiento de muestras de 384 pocillos	Termo o equivalente	262261 Cloruro
de sodio	Sigma o equivalente	S6191
Tubos cónicos de 50 mL Termo	o equivalente	14-959-49A
Pipetas serológicas 50 mL	Corning o equivalente	07-200-576
Pipetas serológicas 25 mL	Corning o equivalente	07-200-575
Pipetas serológicas 10 mL	Corning o equivalente	07-200-574
Pipetas serológicas 5 mL	Corning o equivalente	07-200-573
SV40-HCEC células epiteliales corneales humanas inmortalizadas	N/A	N/A	Estas células no están disponibles comercialmente, pero se pueden obtener de los investigadores citados en el artículo
Sceptor Handheld Automated Cell Counter	Millipore o equivalente	PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument	Affymetrix o equivalente	00-0372
Affymetrix 24 y 96-array plates	Affymetrix o equivalente	901257; 901434
Draegger tubo HF	Draeger o equivalente	8103251
tubo Draegger CP	Draeger o equivalente	8103421
bomba Draegger	Draeger o equivalente	6400000
Sellos de placa transparente	Resesarch Products International o equivalente	202502
Reservorios de reactivos	VistaLab Technologies o equivalente	3054-1000
Xlfit	IDBS o complemento de	N/A	equivalente utilizado para el ajuste automatizado de curvas

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