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Artículo de método

Medición de consumo de oxígeno mitocondrial en las fibras Permeabilized de Drosophila utilizando cantidades mínimas de tejido

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DOI:

10.3791/57376

⸱

7 de abril de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Département de chimie et biochimie, Université de Moncton, 2Département de biologie, Université de Moncton

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este artículo se describe un método para medir el consumo de oxígeno mediante respirometría de alta resolución de tórax permeabilized de Drosophila. Esta técnica requiere una cantidad mínima de tejido en comparación con la técnica de aislamiento mitocondrial clásica y los resultados obtenidos son más fisiológicamente relevantes.

Resumen

La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, representa un modelo emergente para el estudio del metabolismo. De hecho, drosophila tienen estructuras homólogas a los órganos humanos poseen rutas metabólicas altamente conservados y tienen una vida útil relativamente corta que permite el estudio de los mecanismos fundamentales diferentes en un período corto de tiempo. Sin embargo, es sorprendente que uno de los mecanismos esenciales para el metabolismo celular, la respiración mitocondrial, no ha sido bien investigada en este modelo. Es probable porque la medida de la respiración mitocondrial en Drosophila requiere generalmente un gran número de personas y los resultados obtenidos no son altamente reproducibles. Aquí, se describe un método que permite la medición precisa del consumo de oxígeno mitocondrial utilizando cantidades mínimas de tejido de Drosophila. En este método, los tórax son disecados y permeabilized mecánicamente con pinzas afiladas y químicamente con saponina, permitiendo que diferentes compuestos cruzar la membrana celular y modular la respiración mitocondrial. Después de permeabilización, se realiza un protocolo para evaluar la capacidad de los diferentes complejos del sistema de transporte de electrones (ETS) para la oxidación de diferentes sustratos, así como su respuesta a un uncoupler y varios inhibidores. Este método presenta muchas ventajas comparados aislamientos mitocondriales, ya que es más fisiológico relevante porque la mitocondria todavía está interactuando con los otros componentes celulares y la morfología mitocondrial se conserva. Además, preparaciones de la muestra son más rápidas, y los resultados obtenidos son altamente reproducibles. Combinando las ventajas de la Drosophila como modelo para el estudio del metabolismo con la evaluación de la respiración mitocondrial, importante nueva información puede ser revelada, sobre todo cuando las moscas están experimentando diferentes ambientales o fisiopatológico condiciones.

Introducción

La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se ha utilizado como organismo modelo para la investigación genética para sobre un siglo1. El estudio de este organismo no sólo ha conducido a importantes conocimientos fundamentales sobre herencia ligada al sexo2, mutación tarifa3, el desarrollo del sistema de los nervios y la celda destino determinación4, pero recientemente también se ha convertido en un herramienta valiosa para estudiar los mecanismos inherentes a varias enfermedades tales como Alzheimer y Parkinson5,6. Por otra parte, es un modelo popular para estudiar el proceso de envejecimiento, ya que se pueden levantar en gran número en un período corto de tiempo y tienen una vida corta. También poseen estructuras homólogas a los órganos humanos, como un corazón, cuerpos grasos (funciona de manera similar como el tejido adiposo hígado y blanco), oenocytes (células similares a hepatocitos), células (equivalentes a las células β-pancreáticas), productoras de insulina, así como la hemolinfa transporta metabolitos (análogo a la sangre de vertebrados)7. Además, las vías centrales del metabolismo intermediario (incluyendo la vía de señalización insulina/insulina-como factor de crecimiento similar y vías del blanco de rapamicina-TOR) son también altamente conservado7. Por estas razones, Drosophila han explotado recientemente para describir los mecanismos fundamentales que controlan el metabolismo, especialmente en condiciones patológicas inherentes a humanas enfermedades metabólicas como diabetes8. Un componente importante del metabolismo es la mitocondria que integra múltiples vías y realiza una de las funciones biológicas más importantes de la vida, la producción de ATP, mediante el proceso de fosforilación oxidativa (OXPHOS). Teniendo en cuenta su papel central en el metabolismo del organismo, no es de extrañar que las disfunciones mitocondriales están implicadas en muchas enfermedades como enfermedad de Parkinson9 y enfermedad de Alzheimer enfermedades10, así como en la esclerosis lateral amiotrófica 11 , 12. también son determinantes fundamentales del proceso de envejecimiento. De hecho, son los principales productores de especies reactivas del oxígeno (ROS) en la célula, que puede ser perjudicial para la célula en alta concentración a través del daño oxidativo11. Envejecimiento también se ha asociado a la acumulación de mutados o dañados del ADN mitocondrial13, mitofagia disfunciones14,15 , así como alteración de la Biogénesis mitocondrial16. Las mitocondrias también son determinantes de la homeostasis de la célula pueden utilizar diferentes sustratos para ajustar varias funciones celulares según la abundancia o escasez de macronutrientes17,18.

De hecho, los diferentes nutrientes en la dieta (carbohidratos, lípidos y proteínas) son digeridos, absorbidos y transportados en las células. Luego se transforman en el citosol y los substratos derivados son transportados a la matriz mitocondrial donde se producen reduciendo equivalentes, tales como NADH y FADH219. Estos equivalentes reductores son oxidados luego por diferentes complejos enzimáticos del sistema de transporte de electrones (ETS). Estos complejos están incrustados en la membrana interna mitocondrial, como el complejo I y complejo II. Además, otros complejos enzimáticos como el glicerol-3-fosfato deshidrogenasa mitocondrial y la deshidrogenasa de prolina representan rutas alternativas para la entrada de electrones en la ETS20,21. Estos complejos 'alternativos' son particularmente importantes en los insectos, como según la especie, pueden participar activamente para aumentar la respiración20,22,23,21. Electrones de estas ETS sistemas de alimentación se transfieren a la ubiquinona y posteriormente al complejo III y luego al complejo IV, hasta el aceptor final, oxígeno molecular. Esta transferencia de electrones genera una fuerza protón-motriz a través de la membrana interna mitocondrial conduce a la fosforilación de ADP a ATP en el complejo V (figura 1). Teniendo en cuenta el papel central de la mitocondria en la homeostasis de la célula, estudiando el metabolismo mitocondrial utilizando el modelo relevante D. melanogaster representa una poderosa herramienta para delinear los mecanismos subyacentes de diversos fisiopatológicos condiciones o bajo estrés celulares y medio ambiente. Sorprendentemente sin embargo, sólo un puñado de estudios realmente mide la respiración mitocondrial en Drosophila24,25,26. De hecho, experimentos con el objetivo de evaluar el consumo de oxígeno mitocondrial requieren el aislamiento de las mitocondrias. Aunque ventajosa para la medición de funciones mitocondriales (como producción de ROS o relación P/O como marcador de la eficiencia mitocondrial27,28), estos aislamientos generalmente requieren grandes cantidades de tejido de varios individuos24,29. Este requisito para grandes cantidades de tejido y de los individuos es un factor limitante importante, teniendo en cuenta que todos los individuos deben ser la misma edad y preferiblemente del mismo sexo para los experimentos, haciendo la medida de la respiración en diferentes tiempo puntos laborioso en el mejor. Por otra parte, mientras que aislamientos mitocondriales pueden proporcionar la penetración importante en los mecanismos fundamentales que rigen el metabolismo mitocondrial, los métodos utilizados para aislar mitocondrias tienen varios inconvenientes como la dificultad para obtener resultados reproducibles , interrupción de la red mitocondrial y alteración de mitochondrial estructura y función de29,30,31.

El objetivo de este estudio es presentar un protocolo robusto para medir consumo de oxígeno mitocondrial en Drosophila utilizando sólo una cantidad mínima de tejido a partir de muy pocos individuos. Este protocolo consiste en la medición de oxígeno mitocondrial consumo en situ con fibras musculares permeabilized29 de tórax de Drosophila en combinación con alta resolución respirometria32,33, 34 , 35. este método tiene también ventajas adicionales en comparación con el método clásico de aislamiento mitocondrial puesto que las interacciones con los otros componentes de la célula como estructura y la función mitocondrial así como más se conservan en permeabilized las fibras29,31,,36, que hace que este enfoque más fisiológico relevantes. Con este protocolo, funciones mitocondriales pueden evaluarse con precisión con alta resolución respirometría en tórax solamente tres de Drosophila, sustratos permitiendo la determinación del consumo de oxígeno en varios pasos diferentes del ETS. Por lo tanto, este protocolo podría ayudar a responder preguntas clave sobre los mecanismos fundamentales que controlan el metabolismo en el contexto de muchas condiciones ambientales o patofisiológicos aprovechando el modelo de Drosophila.

Para medir el consumo de oxígeno en varios pasos diferentes del ETS y evaluar diferentes sustratos contribuyen a la respiración, diferentes sustratos (figura 1), uncoupler, y los inhibidores son usados30 después de permeabilización de las tejido. En concreto, se realizan adiciones secuenciales de diferentes sustratos para estimular la entrada de electrones a través de diversos complejos de la ETS. Cianuro de carbonilo de un uncoupler, 4-(de trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), luego se agrega en la concentración óptima para medir la respiración no juntada, es decir, estimula la respiración sin fosforilar al consumo máximo de oxígeno. Inhibiciones secuenciales de los complejos que i, II y III estamos entonces realizado para monitorear el consumo de oxígeno residual que se debe a reacciones de oxidación no-ETS. Por último, capacidad de respiración máxima de complejo IV puede ser evaluado por la inyección de N, N, N', N, - tetrametil - p-Fenilendiamina (debe), un proveedor de electrones artificial y ascorbato. Es importante tener en cuenta que los experimentos se llevan a cabo a 24 °C ya que es la temperatura a la que se crían las moscas.

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Protocolo

1. preparación de reactivos

  1. Preparar las siguientes soluciones para la disección y permeabilización del tejido.
    1. Preparar la solución de preservación: 2,77 mM CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, taurina, 20 mM 15 mM fosfocreatina de Na2, 20 mM imidazol, dithiothreitol de 0,5 mM y 50 mM K-MES, pH 7.1 (se pueden almacenar a-20 ° C).
    2. Preparar la solución de saponina: 5 mg de saponinas en 1 mL de solución de preservación (preparar diariamente).
  2. Preparar las siguientes soluciones para la medición de la respiración.
    1. Preparar el medio de la respiración: 120 mM KCl 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2y 0.2% BSA (w/v), pH 7,2.
    2. Preparar sustratos, uncoupler, inhibidores. Disolver todos los sustratos en H2O y disolver el uncoupler FCCP, así como los inhibidores en etanol absoluto (excepto malonato que se diluye en H2O). Neutralizar la mayoría de los sustratos así como malonato (véase Tabla de materiales). Todas las concentraciones en el protocolo son concentraciones finales dentro de cámaras de 2 mL.

2. preparación y calibración de la alta resolución respirómetro.

  1. Lavar las cámaras, tapas y tapones del respirómetro tres veces con etanol al 70% y tres veces con agua destilada.
  2. Calibrar a cero concentración de oxígeno: pipeta 2,3 mL de medio de la respiración en la cámara y añadir 10 mg de Ditionito de sodio. Aunque el volumen máximo de la cámara es de 2 mL, se agregan 2.3 mL para asegurar que ninguna burbuja de aire se mantiene bajo el tope al cerrar las cámaras. Las cámaras con los tapones de cierre y medir la concentración de oxígeno de 10-20 min calibrar los electrodos en cero concentración de oxígeno con la resultante tasa de consumo de oxígeno.
  3. Lavar las cámaras con agua destilada, incubar en etanol absoluto durante 10 minutos y luego enjuague con agua destilada.
  4. Calibrar en la saturación del aire: pipeta 2,3 mL de medio de la respiración en las cámaras, inserte los tapones de aspirar el exceso medio encima de los tapones y luego levante los tapones con el espaciador. Medio de exceso de respiración se pipetea en la cámara (volumen de 2 mL total) para evitar la presencia de burbujas de aire después del cierre de las cámaras.
  5. Controlar el consumo de oxígeno por 45 min a una hora, hasta que la concentración de oxígeno (trazo azul) es estable alrededor de 250 nM a 24 ° C.

3. disección de moscas y permeabilización del tejido

  1. Asegúrese de que todas las medidas se realizan en el hielo.
  2. Anestesie seis moscas macho de la misma cepa, misma edad y se crió en la misma dieta en hielo para facilitar la disección de las moscas (wild-type w1118, 15 días de edad, alimentado en medio de la harina de maíz).
  3. Con un bisturí y pinzas de punta fina, diseccionar las moscas (quitar la cabeza y el abdomen) para mantener sólo el tórax contiene los músculos de vuelo. Este paso puede hacerse con el ojo desnudo. Manejar los tórax resultantes con pinzas de punta fina.
  4. La transferencia de tres tórax disecada en 25 mm placa de Petri que contiene 2 mL de solución de preservación fría usando el fórceps.
  5. Con las pinzas de punta fina, mecánicamente permeabilizar los tórax insertando la punta de las pinzas en el tórax y varias veces desgarrar el tejido para obtener una red libremente.
  6. En una placa de 24 pocillos, se llenan dos pozos 12,5 μl de la solución de saponina y 1 mL de solución de preservación para obtener una concentración final de 62.5 μg/mL de saponina. Llene los dos pozos adyacentes con 1 mL de medio de respiración.
  7. Con las pinzas de punta fina, tres tórax permeabilized de transferencia en la solución de saponina diluida e incubar con agitación suave en un agitador orbital, en el hielo, durante 20 minutos.
  8. Después de la incubación de estos última, transferir las fibras en los pozos juntos con el medio de la respiración con agitación suave, en hielo durante 5 minutos enjuagar la saponina.

4. determinación de peso seco

  1. Seque el tórax permeabilized sobre una superficie absorbente y flip 3 - 4 veces con las pinzas de punta fina para asegurarse de que se quita toda la humedad.
  2. Pesar el tres tórax juntos en una Microbalanza. Tenga en cuenta el peso obtenido como antes para normalizar las tasas de consumo de oxígeno mitocondrial.
  3. Transferencia de los tejidos inmediatamente en una gota de medio de la respiración en el hielo.

5. determinación de las tasas de consumo oxígeno

  1. Abra las cámaras del respirómetro (Retire los tapones) y añadir 10 mM de piruvato y malato de 2 mM en cada cámara.
  2. Añadir los tejidos permeabilized directamente en las cámaras con el medio de la respiración.
  3. Reemplace los tapones usando al espaciador.
  4. Con una jeringa de 60 mL, recoger oxígeno directamente de un tanque de oxígeno e inyecte 2-5 mL de oxígeno a través de los capilares el tapón de cada cámara para asegurarse de que la difusión de oxígeno a través del tejido no limitará el consumo de oxígeno.
  5. Inserte una jeringa Hamilton en el capilar de cada tapón para asegurarse de que el tórax permanezcan en la cámara.
  6. Cerrar los compartimientos completamente cuando la concentración de oxígeno es alrededor de 400 nM, logrando niveles de oxígeno por encima de la saturación del aire (alrededor de 160% aire saturación) dentro de las cámaras.
  7. Detenga y reinicie los agitadores para comprobar si las burbujas de aire en las cámaras.
  8. Ingrese la masa de tejido pesado previamente para normalizar las tasas de respiración por masa de tejido (mg), mostrando el consumo de oxígeno de la masa específica (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 de tejido).
  9. Una vez que el consumo de oxígeno se estabiliza (trazo rojo), agregar 5 mM ADP con una jeringa Hamilton.
  10. Después de cada inyección, enjuague la jeringa con agua destilada, etanol al 70% y otra vez de agua destilada.
  11. Una vez que el consumo de oxígeno es estable otra vez, inyectar 5 μl de 4 mM del citocromo c.
  12. Proceder a las inyecciones secuenciales de los siguientes substratos para evaluar el consumo de oxígeno mitocondrial en diferentes pasos del ETS:
    1. Añadir 5 μl de una prolina de 2 M.
    2. Añadir 10 μl de succinato de un de 1 M.
    3. Añadir 30 μl de un 1 M glicerol-3-fosfato.
  13. Inyecte uncoupler FCCP de manera valoración por pasos de 0.5-1 μm (2 μl de una solución de 1 mM) hasta que la concentración óptima es alcanzada, es decir, la concentración para lograr el consumo de oxígeno más alto posible sin inhibición (PRECAUCIÓN: ver tabla de de materiales).
  14. Inyectar los siguientes inhibidores secuencialmente para inhibir completamente el flujo de electrones en el ETS con el fin de medir el consumo de oxígeno residual (ROX) es decir, no-respiratoria las reacciones como reacciones oxigenasa entre otros:
    1. Añadir 1 μl de una rotenona de 1 mM (PRECAUCIÓN: véase Tabla de materiales).
    2. Añadir 5 μl de un malonato de 2 M (PRECAUCIÓN: véase Tabla de materiales).
    3. Añadir 1 μl de un 5 mM antimicina A (PRECAUCIÓN: véase Tabla de materiales).
  15. Añadir ascorbato de 0,2 mM y 0,5 mM debe secuencialmente en las cámaras, a partir del ascorbato para medir el consumo de oxígeno por el complejo IV.
  16. Añadir 20 mM de azida sódica para inhibir el complejo IV (PRECAUCIÓN: véase Tabla de materiales).
  17. Una vez que la señal es estable, abrir las cámaras con el espaciador, volver a oxigenar las cámaras mediante la inyección de 2 mL de oxígeno puro y cerrar las cámaras cuando la concentración es alrededor de 250-300 nmol.mL-1.
  18. Medir la señal de 10-15 minutos y calcular el fondo de la química, es decir, el consumo de oxígeno debido a la autoxidación de debe.

6. limpieza del respirómetro

  1. Después de las mediciones, enjuague los compartimientos con agua destilada una vez y enjuague la cámara tres veces en etanol al 70%.
  2. Incubar en etanol absoluto durante 10 minutos inactivar los inhibidores.
  3. Enjuagar tres veces con agua destilada, llene los compartimientos con etanol al 70% y vuelva a colocar los tapones y las tapas hasta la siguiente utilización.

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Resultados

Se proporciona un rastro representativo del consumo de oxígeno mitocondrial utilizando el protocolo descrito en la figura 2. El piruvato y malato inyectado en las cámaras junto con las fibras del músculo permeabilized se refieren a la respiración de la CI-fuga, es decir, cuando el complejo I de la ETS es estimulada por el NADH producido por oxidación de piruvato y malato a través de la ciclo del ácido tricarboxílico (CI). Durante este tipo de respira...

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Discusión

En este estudio, se describe un método para la preparación de la muestra antes de las mediciones de consumo de oxígeno mitocondrial en Drosophila. Este método fue desarrollado para superar diferentes problemas relacionados con los protocolos usando aislamientos mitocondriales, especialmente en cuanto a la duración y el número de personas requerido. En vez de trabajar con aislamientos mitocondriales generalmente que requieren gran cantidad de tejidos obtenidos de varios individuos, se realiza este experimento en permeabil...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por becas del nacional Ciencias y Consejo de investigación Ingeniería (NSERC, discovery grant) y Université de Moncton a NP. LHB gustaría reconocer el apoyo financiero del Instituto canadiense de investigación de la salud (CIHR), la Fundación de innovación de Nuevo Brunswick (NBIF) y Université de Moncton. El trabajo de EHC es apoyado por la sociedad de Alzheimer de Canadá Canadá cerebro, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, Fundación de la innovación de New Brunswick, Fundación de investigación de salud de New Brunswick y Université de Moncton.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Respirómetro de alta resolución Oxygraph O2KOroboros Instruments, Innsbruck, Austria10022-02Startup O2K respirómetro kit
 
Conjunto de valoración de O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria20820-03Jeringas Hamilton con diferentes volúmenes
 
Software DatlabOroboros Instruments, Innsbruck, Austria20700Software para la adquisición y análisis de datos
 
Pinza antimagnética de punta finaVWR82027-400
 
Secura225D-1S-DQESartorius AG, Goettingen, AlemaniaBalanza semi-micro (distribuida por varias empresas) 
 
Drosophila melanogaster w1118Bloomington Drosophila stock Center, IN, USAbr/> Condición de almacenamiento: 24 ° C
Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacéticoSigma-AldrichE4378EGTA
Condición de almacenamiento: RT
KOHSigma-AldrichP1767PRECAUCIÓN: corrosivo para los metales, toxicidad aguda, corrosión de la piel, daño ocular grave, toxicidad acuática aguda.
Condición de almacenamiento: RT
CaCO3Sigma-AldrichC4830
Condición de almacenamiento: RT
Na2ATPSigma-AldrichA2383
Condición de almacenamiento: -20 ° C
MgCl2.6H2OSigma-AldrichM9272
Condición de almacenamiento: RT
TaurineSigma-AldrichT0625
Condición de almacenamiento: RT
Na2FosfocreatinaSigma-AldrichP7936
Condición de almacenamiento: -20 ° C
ImidazolSigma-AldrichI5513
Condición de almacenamiento: RT
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
Condiciones de almacenamiento: 2-8 & deg; C
MES hidratoSigma-AldrichM8250
Condición de almacenamiento:
RT Saponina de corteza de quillajaSigma-AldrichS7900Saponina
Condición de almacenamiento: RT
Preparación de la solución: 5 mg en 1 mL de solución de conservación. Prepáralo fresco todos los días.
KClSigma-AldrichP9541
Condición de almacenamiento: RT
KH2PO4Sigma-AldrichP9791
Condición de almacenamiento: RT
HEPESSigma-AldrichH3375
Condición de almacenamiento: RT
BSASigma-Aldrich05470
Condición de almacenamiento: 2-8 ° C
Na2S2O4Sigma-Aldrich157953Ditionita sódica. PRECAUCIÓN: sustancias y mezclas que se calientan automáticamente, toxicidad aguda, toxicidad acuática aguda y toxicidad acuática crónica.
Condición de almacenamiento:
RT piruvato de sodioSigma-AldrichP2256Pyruvate
Condición de almacenamiento: 2-8 ° C
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Prepáralo fresco todos los días.
Ácido L-(-)-málicoSigma-AldrichM1000Malato
Condición de almacenamiento: RT
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Neutralizar con KOH y almacenar a -20 °C.
Adenosina 5'-difosfato monopotásico sal hidratoSigma-AldrichA5285ADP
Condición de almacenamiento: -20 ° C
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Neutralizar con KOH y almacenar a -80 °C.
Citocromo c de corazón equinoSigma-AldrichC7752Citocromo c
Condición de almacenamiento: -20 & grados; C
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Almacenar a -20 °C.
L-ProlineSigma-AldrichP0380Proline
Condición de almacenamiento: RT
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Almacenar a -20 °C.
Succinato de sodio dibásico hexahidratadoSigma-AldrichS2378Succinato
Condición de almacenamiento: RT
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Neutralizar con HCl y almacenar a -20 °C.
sn-glicerol 3-fosfato sal de bis (ciclohexilamonio)Sigma-AldrichG7886Glicerol-3-fosfato
Condición de almacenamiento: -20 ° C
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Neutralizar con HCl y almacenar a -80 °C.
Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazonaSigma-AldrichC2920FCCP. ATENCIÓN: toxicidad aguda, sensibilización cutánea, toxicidad acuática crónica.
Condición de almacenamiento: RT
Preparación de la solución: En etanol absoluto. Almacene en viales de vidrio a -20 ° C.
RotenonaSigma-AldrichR8875PRECAUCIÓN: toxicidad aguda, irritación de la piel, irritación de los ojos, toxicidad específica en órganos diana (sistema respiratorio), toxicidad acuática aguda, toxicidad acuática crónica
Preparación de la solución: En etanol absoluto. Almacene en viales oscuros a -20 ° C.
Ácido malónicoSigma-AldrichM1296 malonato. PRECAUCIÓN: toxicidad aguda, daño ocular grave.
Condición de almacenamiento: RT
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Neutralizar con KOH. Prepáralo fresco todos los días.
Antimicina A de Streptomyces sp.Sigma-AldrichA8674Antimicina A. PRECAUCIÓN: toxicidad aguda, toxicidad acuática aguda, toxicidad acuática crónica.
Condición de almacenamiento: -20 ° C
Preparación de la solución: En etanol absoluto. Almacenar a -20 °C.
N,N,N′,N′-Tetrametil-p-fenilendiaminaSigma-AldrichT7394TMPD
Condición de almacenamiento: RT
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Almacene en viales oscuros at  -20 °C.
(+)-L-ascorbato de sodioSigma-AldrichA4034Ascorbato
Condición de almacenamiento: RT
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Almacene en viales oscuros at  -20 °C.
NaN3Sigma-AldrichS2002Azida sódica. ATENCIÓN: toxicidad aguda (oral y dérmica), toxicidad específica en órganos diana (cerebro), toxicidad acuática, toxicidad acuática crónica.
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Almacenar a -20 °C.
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Referencias

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