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Artículo de método

Medición de consumo de oxígeno mitocondrial en las fibras Permeabilized de Drosophila utilizando cantidades mínimas de tejido

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DOI:

10.3791/57376

7 de abril de 2018

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este artículo se describe un método para medir el consumo de oxígeno mediante respirometría de alta resolución de tórax permeabilized de Drosophila. Esta técnica requiere una cantidad mínima de tejido en comparación con la técnica de aislamiento mitocondrial clásica y los resultados obtenidos son más fisiológicamente relevantes.

Resumen

La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, representa un modelo emergente para el estudio del metabolismo. De hecho, drosophila tienen estructuras homólogas a los órganos humanos poseen rutas metabólicas altamente conservados y tienen una vida útil relativamente corta que permite el estudio de los mecanismos fundamentales diferentes en un período corto de tiempo. Sin embargo, es sorprendente que uno de los mecanismos esenciales para el metabolismo celular, la respiración mitocondrial, no ha sido bien investigada en este modelo. Es probable porque la medida de la respiración mitocondrial en Drosophila requiere generalmente un gran número de personas y los resultados obtenidos no son altamente reproducibles. Aquí, se describe un método que permite la medición precisa del consumo de oxígeno mitocondrial utilizando cantidades mínimas de tejido de Drosophila. En este método, los tórax son disecados y permeabilized mecánicamente con pinzas afiladas y químicamente con saponina, permitiendo que diferentes compuestos cruzar la membrana celular y modular la respiración mitocondrial. Después de permeabilización, se realiza un protocolo para evaluar la capacidad de los diferentes complejos del sistema de transporte de electrones (ETS) para la oxidación de diferentes sustratos, así como su respuesta a un uncoupler y varios inhibidores. Este método presenta muchas ventajas comparados aislamientos mitocondriales, ya que es más fisiológico relevante porque la mitocondria todavía está interactuando con los otros componentes celulares y la morfología mitocondrial se conserva. Además, preparaciones de la muestra son más rápidas, y los resultados obtenidos son altamente reproducibles. Combinando las ventajas de la Drosophila como modelo para el estudio del metabolismo con la evaluación de la respiración mitocondrial, importante nueva información puede ser revelada, sobre todo cuando las moscas están experimentando diferentes ambientales o fisiopatológico condiciones.

Introducción

La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se ha utilizado como organismo modelo para la investigación genética para sobre un siglo1. El estudio de este organismo no sólo ha conducido a importantes conocimientos fundamentales sobre herencia ligada al sexo2, mutación tarifa3, el desarrollo del sistema de los nervios y la celda destino determinación4, pero recientemente también se ha convertido en un herramienta valiosa para estudiar los mecanismos inherentes a varias enfermedades tales como Alzheimer y Parkinson5,

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Protocolo

1. preparación de reactivos

  1. Preparar las siguientes soluciones para la disección y permeabilización del tejido.
    1. Preparar la solución de preservación: 2,77 mM CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, taurina, 20 mM 15 mM fosfocreatina de Na2, 20 mM imidazol, dithiothreitol de 0,5 mM y 50 mM K-MES, pH 7.1 (se pueden almacenar a-20 ° C).
    2. Preparar la solución de saponina: 5 mg de saponinas en 1 mL de solución de preservación (preparar diariamente).
  2. Preparar las siguientes soluciones para la medición de la respiración.
    1. Preparar el medio de la r....

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Resultados

Se proporciona un rastro representativo del consumo de oxígeno mitocondrial utilizando el protocolo descrito en la figura 2. El piruvato y malato inyectado en las cámaras junto con las fibras del músculo permeabilized se refieren a la respiración de la CI-fuga, es decir, cuando el complejo I de la ETS es estimulada por el NADH producido por oxidación de piruvato y malato a través de la ciclo del ácido tricarboxílico (CI). Durante este tipo de respira.......

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Discusión

En este estudio, se describe un método para la preparación de la muestra antes de las mediciones de consumo de oxígeno mitocondrial en Drosophila. Este método fue desarrollado para superar diferentes problemas relacionados con los protocolos usando aislamientos mitocondriales, especialmente en cuanto a la duración y el número de personas requerido. En vez de trabajar con aislamientos mitocondriales generalmente que requieren gran cantidad de tejidos obtenidos de varios individuos, se realiza este experimento en permeabil.......

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por becas del nacional Ciencias y Consejo de investigación Ingeniería (NSERC, discovery grant) y Université de Moncton a NP. LHB gustaría reconocer el apoyo financiero del Instituto canadiense de investigación de la salud (CIHR), la Fundación de innovación de Nuevo Brunswick (NBIF) y Université de Moncton. El trabajo de EHC es apoyado por la sociedad de Alzheimer de Canadá Canadá cerebro, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, Fundación de la innovación de New Brunswick, Fundación de investigación de salud de New Brunswick y Université de Moncton.

....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Respirómetro de alta resolución Oxygraph O2KOroboros Instruments, Innsbruck, Austria10022-02Startup O2K respirómetro kit
 
Conjunto de valoración de O2K Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria20820-03Jeringas Hamilton con diferentes volúmenes
 
Software DatlabOroboros Instruments, Innsbruck, Austria20700Software para la adquisición y análisis de datos
 
Pinza antimagnética de punta finaVWR82027-400
 
Secura225D-1S-DQESartorius AG, Goettingen, AlemaniaBalanza semi-micro (distribuida por varias empresas) 
 
Drosophila melanogaster w1118Bloomington Drosophila stock Center, IN, USAbr/> Condición de almacenamiento: 24 ° C
Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacéticoSigma-AldrichE4378EGTA
Condición de almacenamiento: RT
KOHSigma-AldrichP1767PRECAUCIÓN: corrosivo para los metales, toxicidad aguda, corrosión de la piel, daño ocular grave, toxicidad acuática aguda.
Condición de almacenamiento: RT
CaCO3Sigma-AldrichC4830
Condición de almacenamiento: RT
Na2ATPSigma-AldrichA2383
Condición de almacenamiento: -20 ° C
MgCl2.6H2OSigma-AldrichM9272
Condición de almacenamiento: RT
TaurineSigma-AldrichT0625
Condición de almacenamiento: RT
Na2FosfocreatinaSigma-AldrichP7936
Condición de almacenamiento: -20 ° C
ImidazolSigma-AldrichI5513
Condición de almacenamiento: RT
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
Condiciones de almacenamiento: 2-8 & deg; C
MES hidratoSigma-AldrichM8250
Condición de almacenamiento:
RT Saponina de corteza de quillajaSigma-AldrichS7900Saponina
Condición de almacenamiento: RT
Preparación de la solución: 5 mg en 1 mL de solución de conservación. Prepáralo fresco todos los días.
KClSigma-AldrichP9541
Condición de almacenamiento: RT
KH2PO4Sigma-AldrichP9791
Condición de almacenamiento: RT
HEPESSigma-AldrichH3375
Condición de almacenamiento: RT
BSASigma-Aldrich05470
Condición de almacenamiento: 2-8 ° C
Na2S2O4Sigma-Aldrich157953Ditionita sódica. PRECAUCIÓN: sustancias y mezclas que se calientan automáticamente, toxicidad aguda, toxicidad acuática aguda y toxicidad acuática crónica.
Condición de almacenamiento:
RT piruvato de sodioSigma-AldrichP2256Pyruvate
Condición de almacenamiento: 2-8 ° C
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Prepáralo fresco todos los días.
Ácido L-(-)-málicoSigma-AldrichM1000Malato
Condición de almacenamiento: RT
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Neutralizar con KOH y almacenar a -20 °C.
Adenosina 5'-difosfato monopotásico sal hidratoSigma-AldrichA5285ADP
Condición de almacenamiento: -20 ° C
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Neutralizar con KOH y almacenar a -80 °C.
Citocromo c de corazón equinoSigma-AldrichC7752Citocromo c
Condición de almacenamiento: -20 & grados; C
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Almacenar a -20 °C.
L-ProlineSigma-AldrichP0380Proline
Condición de almacenamiento: RT
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Almacenar a -20 °C.
Succinato de sodio dibásico hexahidratadoSigma-AldrichS2378Succinato
Condición de almacenamiento: RT
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Neutralizar con HCl y almacenar a -20 °C.
sn-glicerol 3-fosfato sal de bis (ciclohexilamonio)Sigma-AldrichG7886Glicerol-3-fosfato
Condición de almacenamiento: -20 ° C
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Neutralizar con HCl y almacenar a -80 °C.
Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazonaSigma-AldrichC2920FCCP. ATENCIÓN: toxicidad aguda, sensibilización cutánea, toxicidad acuática crónica.
Condición de almacenamiento: RT
Preparación de la solución: En etanol absoluto. Almacene en viales de vidrio a -20 ° C.
RotenonaSigma-AldrichR8875PRECAUCIÓN: toxicidad aguda, irritación de la piel, irritación de los ojos, toxicidad específica en órganos diana (sistema respiratorio), toxicidad acuática aguda, toxicidad acuática crónica
Preparación de la solución: En etanol absoluto. Almacene en viales oscuros a -20 ° C.
Ácido malónicoSigma-AldrichM1296 malonato. PRECAUCIÓN: toxicidad aguda, daño ocular grave.
Condición de almacenamiento: RT
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Neutralizar con KOH. Prepáralo fresco todos los días.
Antimicina A de Streptomyces sp.Sigma-AldrichA8674Antimicina A. PRECAUCIÓN: toxicidad aguda, toxicidad acuática aguda, toxicidad acuática crónica.
Condición de almacenamiento: -20 ° C
Preparación de la solución: En etanol absoluto. Almacenar a -20 °C.
N,N,N′,N′-Tetrametil-p-fenilendiaminaSigma-AldrichT7394TMPD
Condición de almacenamiento: RT
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Almacene en viales oscuros at  -20 °C.
(+)-L-ascorbato de sodioSigma-AldrichA4034Ascorbato
Condición de almacenamiento: RT
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Almacene en viales oscuros at  -20 °C.
NaN3Sigma-AldrichS2002Azida sódica. ATENCIÓN: toxicidad aguda (oral y dérmica), toxicidad específica en órganos diana (cerebro), toxicidad acuática, toxicidad acuática crónica.
Preparación de la solución: En agua MilliQ. Almacenar a -20 °C.
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Referencias

  1. Stephenson, R., Metcalfe, N. H. Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use. The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).
  2. Morgan, T. H. An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila. Journal o....

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Etiquetas

Drosophila melanogasterdisecci n del t raxpermeabilizaci n con saponinarespirometr a de alta resoluci nsistema de transporte de electronesoxidaci n de sustratosrespuesta al desacoplantean lisis de inhibidoresrespiraci n mitocondrial