Medición de consumo de oxígeno mitocondrial en las fibras Permeabilized de Drosophila utilizando cantidades mínimas de tejido

Resumen

En este artículo se describe un método para medir el consumo de oxígeno mediante respirometría de alta resolución de tórax permeabilized de Drosophila. Esta técnica requiere una cantidad mínima de tejido en comparación con la técnica de aislamiento mitocondrial clásica y los resultados obtenidos son más fisiológicamente relevantes.

Resumen

La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, representa un modelo emergente para el estudio del metabolismo. De hecho, drosophila tienen estructuras homólogas a los órganos humanos poseen rutas metabólicas altamente conservados y tienen una vida útil relativamente corta que permite el estudio de los mecanismos fundamentales diferentes en un período corto de tiempo. Sin embargo, es sorprendente que uno de los mecanismos esenciales para el metabolismo celular, la respiración mitocondrial, no ha sido bien investigada en este modelo. Es probable porque la medida de la respiración mitocondrial en Drosophila requiere generalmente un gran número de personas y los resultados obtenidos no son altamente reproducibles. Aquí, se describe un método que permite la medición precisa del consumo de oxígeno mitocondrial utilizando cantidades mínimas de tejido de Drosophila. En este método, los tórax son disecados y permeabilized mecánicamente con pinzas afiladas y químicamente con saponina, permitiendo que diferentes compuestos cruzar la membrana celular y modular la respiración mitocondrial. Después de permeabilización, se realiza un protocolo para evaluar la capacidad de los diferentes complejos del sistema de transporte de electrones (ETS) para la oxidación de diferentes sustratos, así como su respuesta a un uncoupler y varios inhibidores. Este método presenta muchas ventajas comparados aislamientos mitocondriales, ya que es más fisiológico relevante porque la mitocondria todavía está interactuando con los otros componentes celulares y la morfología mitocondrial se conserva. Además, preparaciones de la muestra son más rápidas, y los resultados obtenidos son altamente reproducibles. Combinando las ventajas de la Drosophila como modelo para el estudio del metabolismo con la evaluación de la respiración mitocondrial, importante nueva información puede ser revelada, sobre todo cuando las moscas están experimentando diferentes ambientales o fisiopatológico condiciones.

Introducción

La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se ha utilizado como organismo modelo para la investigación genética para sobre un siglo¹. El estudio de este organismo no sólo ha conducido a importantes conocimientos fundamentales sobre herencia ligada al sexo², mutación tarifa³, el desarrollo del sistema de los nervios y la celda destino determinación⁴, pero recientemente también se ha convertido en un herramienta valiosa para estudiar los mecanismos inherentes a varias enfermedades tales como Alzheimer y Parkinson^5,

Protocolo

1. preparación de reactivos

1. Preparar las siguientes soluciones para la disección y permeabilización del tejido.
   1. Preparar la solución de preservación: 2,77 mM CaK₂EGTA, 7,23 mM K₂EGTA, 5,77 mM Na₂ATP, 6,56 mM MgCl₂, taurina, 20 mM 15 mM fosfocreatina de Na₂, 20 mM imidazol, dithiothreitol de 0,5 mM y 50 mM K-MES, pH 7.1 (se pueden almacenar a-20 ° C).
   2. Preparar la solución de saponina: 5 mg de saponinas en 1 mL de solución de preservación (preparar diariamente).
2. Preparar las siguientes soluciones para la medición de la respiración.
   1. Preparar el medio de la r....

Resultados

Se proporciona un rastro representativo del consumo de oxígeno mitocondrial utilizando el protocolo descrito en la figura 2. El piruvato y malato inyectado en las cámaras junto con las fibras del músculo permeabilized se refieren a la respiración de la CI-fuga, es decir, cuando el complejo I de la ETS es estimulada por el NADH producido por oxidación de piruvato y malato a través de la ciclo del ácido tricarboxílico (CI). Durante este tipo de respira.......

Discusión

En este estudio, se describe un método para la preparación de la muestra antes de las mediciones de consumo de oxígeno mitocondrial en Drosophila. Este método fue desarrollado para superar diferentes problemas relacionados con los protocolos usando aislamientos mitocondriales, especialmente en cuanto a la duración y el número de personas requerido. En vez de trabajar con aislamientos mitocondriales generalmente que requieren gran cantidad de tejidos obtenidos de varios individuos, se realiza este experimento en permeabil.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Respirómetro de alta resolución Oxygraph O2K	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	10022-02	Startup O2K respirómetro kit
Conjunto de valoración de O2K	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20820-03	Jeringas Hamilton con diferentes volúmenes
Software Datlab	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20700	Software para la adquisición y análisis de datos
Pinza antimagnética de punta fina	VWR	82027-400
Secura225D-1S-DQE	Sartorius AG, Goettingen, Alemania		Balanza semi-micro (distribuida por varias empresas)
Drosophila melanogaster w1118	Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA		br/> Condición de almacenamiento: 24 ° C
Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético	Sigma-Aldrich	E4378	EGTA Condición de almacenamiento: RT
KOH	Sigma-Aldrich	P1767	PRECAUCIÓN: corrosivo para los metales, toxicidad aguda, corrosión de la piel, daño ocular grave, toxicidad acuática aguda. Condición de almacenamiento: RT
CaCO3	Sigma-Aldrich	C4830	Condición de almacenamiento: RT
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Condición de almacenamiento: -20 ° C
MgCl2.6H2O	Sigma-Aldrich	M9272	Condición de almacenamiento: RT
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	Condición de almacenamiento: RT
Na2Fosfocreatina	Sigma-Aldrich	P7936	Condición de almacenamiento: -20 ° C
Imidazol	Sigma-Aldrich	I5513	Condición de almacenamiento: RT
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632	Condiciones de almacenamiento: 2-8 & deg; C
MES hidrato	Sigma-Aldrich	M8250	Condición de almacenamiento:
RT Saponina de corteza de quillaja	Sigma-Aldrich	S7900	Saponina Condición de almacenamiento: RT Preparación de la solución: 5 mg en 1 mL de solución de conservación. Prepáralo fresco todos los días.
KCl	Sigma-Aldrich	P9541	Condición de almacenamiento: RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791	Condición de almacenamiento: RT
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Condición de almacenamiento: RT
BSA	Sigma-Aldrich	05470	Condición de almacenamiento: 2-8 ° C
Na2S2O4	Sigma-Aldrich	157953	Ditionita sódica. PRECAUCIÓN: sustancias y mezclas que se calientan automáticamente, toxicidad aguda, toxicidad acuática aguda y toxicidad acuática crónica. Condición de almacenamiento:
RT piruvato de sodio	Sigma-Aldrich	P2256	Pyruvate Condición de almacenamiento: 2-8 ° C Preparación de la solución: En agua MilliQ. Prepáralo fresco todos los días.
Ácido L-(-)-málico	Sigma-Aldrich	M1000	Malato Condición de almacenamiento: RT Preparación de la solución: En agua MilliQ. Neutralizar con KOH y almacenar a -20 °C.
Adenosina 5'-difosfato monopotásico sal hidrato	Sigma-Aldrich	A5285	ADP Condición de almacenamiento: -20 ° C Preparación de la solución: En agua MilliQ. Neutralizar con KOH y almacenar a -80 °C.
Citocromo c de corazón equino	Sigma-Aldrich	C7752	Citocromo c Condición de almacenamiento: -20 & grados; C Preparación de la solución: En agua MilliQ. Almacenar a -20 °C.
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380	Proline Condición de almacenamiento: RT Preparación de la solución: En agua MilliQ. Almacenar a -20 °C.
Succinato de sodio dibásico hexahidratado	Sigma-Aldrich	S2378	Succinato Condición de almacenamiento: RT Preparación de la solución: En agua MilliQ. Neutralizar con HCl y almacenar a -20 °C.
sn-glicerol 3-fosfato sal de bis (ciclohexilamonio)	Sigma-Aldrich	G7886	Glicerol-3-fosfato Condición de almacenamiento: -20 ° C Preparación de la solución: En agua MilliQ. Neutralizar con HCl y almacenar a -80 °C.
Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona	Sigma-Aldrich	C2920	FCCP. ATENCIÓN: toxicidad aguda, sensibilización cutánea, toxicidad acuática crónica. Condición de almacenamiento: RT Preparación de la solución: En etanol absoluto. Almacene en viales de vidrio a -20 ° C.
Rotenona	Sigma-Aldrich	R8875	PRECAUCIÓN: toxicidad aguda, irritación de la piel, irritación de los ojos, toxicidad específica en órganos diana (sistema respiratorio), toxicidad acuática aguda, toxicidad acuática crónica Preparación de la solución: En etanol absoluto. Almacene en viales oscuros a -20 ° C.
Ácido malónico	Sigma-Aldrich	M1296 malonato	. PRECAUCIÓN: toxicidad aguda, daño ocular grave. Condición de almacenamiento: RT Preparación de la solución: En agua MilliQ. Neutralizar con KOH. Prepáralo fresco todos los días.
Antimicina A de Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	A8674	Antimicina A. PRECAUCIÓN: toxicidad aguda, toxicidad acuática aguda, toxicidad acuática crónica. Condición de almacenamiento: -20 ° C Preparación de la solución: En etanol absoluto. Almacenar a -20 °C.
N,N,N′,N′-Tetrametil-p-fenilendiamina	Sigma-Aldrich	T7394	TMPD Condición de almacenamiento: RT Preparación de la solución: En agua MilliQ. Almacene en viales oscuros at  -20 °C.
(+)-L-ascorbato de sodio	Sigma-Aldrich	A4034	Ascorbato Condición de almacenamiento: RT Preparación de la solución: En agua MilliQ. Almacene en viales oscuros at  -20 °C.
NaN3	Sigma-Aldrich	S2002	Azida sódica. ATENCIÓN: toxicidad aguda (oral y dérmica), toxicidad específica en órganos diana (cerebro), toxicidad acuática, toxicidad acuática crónica. Preparación de la solución: En agua MilliQ. Almacenar a -20 °C.

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