Method Article

Fabricación de una Matriz microambiente celular Artificial multiplexados

DOI:

10.3791/57377

⸱

September 7th, 2018

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1Institute for Integrated Cell-Material Sciences (WPI-iCeMS), Kyoto University, 2Department of Life Science and Technology, School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology, 3Biomaterials Center for Regenerative Medical Engineering, Foundation for Advancement of International Science, 4Faculty of Science and Natural Resources, Universiti Malaysia Sabah, 5Institute for Chemical Research, Kyoto University, 6Ecole Normale Supérieure

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo describe la metodología detallada para preparar una matriz de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulación de alto rendimiento de física y química señales mímico en vivo microambientes celulares y a identificar el entorno celular óptimo para las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) con perfiles de unicelulares.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microambientes celulares consisten en una variedad de señales, tales como factores de crecimiento, matrices extracelulares y las interacciones intercelulares. Estas señales están bien orquestados y son cruciales en la regulación de las funciones celulares en un sistema de vida. Aunque un número de investigadores ha intentado investigar la correlación entre factores ambientales y las funciones celulares deseadas, mucho sigue siendo desconocido. Esto es en gran parte debido a la falta de una metodología apropiada para imitar tales señales ambientales en vitroy probar simultáneamente señales ambientales diferentes en las células. Aquí, Divulgamos una plataforma integrada de canales de microfluidos y una variedad de nanofibras, seguida por análisis unicelular de alto contenido, para examinar células de fenotipos alterados por distintos factores ambientales. Para demostrar la aplicación de esta plataforma, este estudio se centra en los fenotipos de uno mismo-renovar las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs). Presentamos los procedimientos de preparación de una matriz de nanofibras y la estructura de microfluidos en la fabricación de una gama de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME). Por otra parte, se describen pasos generales de la célula solo perfiles, tinción con marcadores fluorescentes múltiples, múltiples imágenes de fluorescencia y análisis estadísticos, de la célula.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Humanas pluripotentes células madre (hPSCs)1,2 uno mismo-renovar ilimitadamente y diferenciarse en varios linajes de tejido, que podrían revolucionar el desarrollo de fármacos, terapias basadas en células, ingeniería tisular y medicina regenerativa 3 , 4 , 5 , 6. platos de cultura general y las placas de microtitulación, sin embargo, no están diseñadas para permitir la manipulación precisa de la célula física y química a nivel celular con la gama de nano a micro-metros, que es un factor crítico para la extensión celular, auto renovación y diferenciación. Para solucionar este inconveniente, los estudios han investigado los roles de microambientes celulares en la regulación de las decisiones de destino celular y funciones de la célula4. En los últimos años, un creciente número de estudios se han realizado para reconstruir microambientes celulares in vitro7,8. Procesos de fabricación de nano y micro han establecido estos microambientes mediante la manipulación de productos químicos9,10,11,12,13, 14,15,16,17 y física18,19,20 señales ambientales. Hasta ahora no había informes de investigar sistemáticamente los mecanismos subyacentes de señales ambientales físicos y químicos en las decisiones de destino celular y funciones dentro de una única plataforma.

Aquí, presentamos una estrategia basada en los principios de diseño simple para establecer una plataforma de proyección sólida (figura 1). En primer lugar, describimos el procedimiento de desarrollo de una plataforma integrada para la creación de microambientes celulares versátiles, artificiales mediante una matriz de nanofibras y una estructura de microfluidos: matriz el multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) (Figura 1A y 2A). La matriz de nanofibras tiene 12 diferentes microambientes en diferentes combinaciones de materiales de nanofibras y densidades. Electrospinning fue utilizada para fabricar nanofibras. Los materiales de nanofibras, como poliestireno (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22y23de la gelatina (GT), fueron diseñados para poner a prueba sus propiedades químicas, que puedan afectar la adhesión celular y el mantenimiento de pluripotencia ( Figura 2B). Densidades de nanofibras fueron variadas por electrospinning tiempo cambiante y las nanofibras generadas fueron definidas según sus densidades (DNF, con D = XLow/Low/Mid/High). La estructura de microfluidos se compone de polidimetilsiloxano (PDMS) albergar 48 cámaras de cultivo celular, que pueden colocarse a lo largo de las dimensiones estándar de la microplaca de 96 pozos. PDMS es un polímero biocompatible y gas intercambiables que generalmente se utiliza para fabricar dispositivos de microfluidos24. Cada canal microfluídico fue diseñado para ser 700 μm ancho 8.4 mm de largo y tenía dos entradas en sus bordes (cuadro 1). Las cámaras tenían diferentes alturas (250, 500 y 1000 μm) para manipular las iniciales siembra celular densidades (0.3, 0.6 y 1.2 × 105 células/cm2), que pueden correlacionar con la supervivencia, proliferación y diferenciación de hPSCs25 (Figura 2C). El número de células sembradas en una cámara es proporcional a la densidad de la columna sobre el piso de la cámara, y así siembra la densidad de la célula inicial fue controlada introduciendo la misma suspensión de células en cámaras de cultivo con diferentes alturas. Todos los canales fueron diseñados para ser ≥ 250 μm de altura26 para minimizar los efectos de la tensión de oxígeno27 y tensión de esquileo28 en las células. Canal alturas de 250, 500 y 1000 μm son abreviados aquí como XCD con X = Low, Mid y High, respectivamente. Los ambientes con nanofibras distintas densidades y densidades de siembra de células iniciales fueron acortados como "Material_NF density_Cell densidad" (por ejemplo, GT_HighNF_HighCD: un entorno caracterizado por alta densidad GT nanofibras y alta inicial de la célula-siembra densidad).

Posteriormente, describimos cómo realizar el análisis unicelular para investigar sistemáticamente el comportamiento de la célula en respuesta a factores ambientales (figura 1B). Como una prueba de concepto, se identificaron el entorno celular óptimo para hPSC auto renovación, que es una función clave para hPSC mantenimiento (figura 1B)29. Citometría de imagen, seguida por análisis estadísticos, permite la interpretación cuantitativa de respuestas fenotípicas celulares individuales a entornos celulares. Entre una variedad de funciones celulares, este artículo proporciona un procedimiento detallado para identificar las condiciones óptimas para mantener hPSC auto renovación.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. fabricación de matriz MACME

Nota: Todos los materiales y equipos se enumeran en la tabla de materiales.

  1. Preparación de máscaras para una variedad de nanofibras y un molde para una estructura de microfluidos
    1. Crear imágenes tridimensionales (3D) de máscaras para las matrices de nanofibras y moldes para microfluidos estructuras utilizando paquetes de software de gráficos de computadora 3D (tabla 1).
      Nota: Las imágenes 3D son leer e imprimir por una impresora 3D. Las máscaras impresos y molde tienen las mismas dimensiones con imágenes en 3D mediante el software de gráficos en el paso 1.1.1.
    2. Imprimir máscaras y un molde de estos diseños utilizando una impresora 3D.
      Nota: En el presente Protocolo, una impresora 3D de ink-jet-como con la resina UV-curable fue usado30. La resolución de la impresora fue 635 × 400 ppp y 15 μm en X, Y y Z, respectivamente, sin embargo, la X real, Y resolución era aproximadamente cuatro veces menor.
  2. Preparación de la matriz de nanofibras (figura 3A)
    1. Preparar soluciones de polímeros para el electrospinning.
      1. Líquido PMGI 13% diluido con Tetrahidrofurano por 9% (w/v)22.
      2. Disolver 0,08 g de PS (peso molecular medio en número (Mn): 130.000) en THF:dimethylformamide (cociente del volumen 1:1)21y THF:dimethylformamide para llevar el volumen hasta el final 1 mL (solución al 8% (w/v) PS).
      3. Disolver 0,1 g de GT en el agua: ácido acético: etilo acetato (cociente del volumen 1:1.6:2.1) y añadir agua: ácido acético: etilo acetato para llevar el volumen hasta el final 1 mL (solución al 10% (p/v) GT) como descrito23,31.
    2. Utilizar un máquina de la farfulla del magnetrón, depositar una fina capa de platino con un espesor de 5 nm en un poliestireno (PS) base (127,7 × 85,5 mm), que sirve como cátodo en la configuración de electrospinning.
    3. Carga de cada solución de polímero en una jeringa de 5 mL, equipada con una aguja embotada del acero inoxidable de 23 G.
    4. Colocar y fijar la jeringa con la aguja en una bomba de jeringa con 12 cm aparte del colector del dispositivo electrospinning.
    5. Conecte la aguja de la jeringa a una fuente de alimentación de alto voltaje y situado a 11 kV.
    6. Ajustar la velocidad de bombea de 0,2 mL por hora.
    7. Mantener temperatura y humedad a 30 ° C y < 30% (v/v).
    8. Poner la máscara en la placa base preparada en el paso 1.2.2.
    9. Fabricar nanofibras en la placa base a través de los agujeros de la máscara con densidades distintas, cambiando el tiempo de centrifugado eléctrico (por ejemplo, 20, 60, 90 y 180 s).
    10. Quitar la máscara de la placa base.
      Nota. Etanol puede ser rociado sobre las nanofibras GT electrospun antes de quitar la máscara para evitar pelar nanofibras GT junto con la máscara.
    11. Repita el paso 1.2.4-1.2.10 hasta la finalización de la fabricación de nanofibras de arreglo de discos.
    12. Coloque la matriz de nanofibras en un desecador a 25 ° C por 16 h para evaporar el disolvente restante.
    13. CrossLink GT nanofibras con clorhidrato de 0.2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimida (EDC) y 0,2 M N-hydroxysuccinimide (NHS) en etanol a 25 ° C por 4 h23.
    14. Enjuague nanofibras GT dos veces con etanol al 99.5% (v/v) y de vacío en seco a 25 ° C durante 16 horas.
  3. Fabricación de estructuras de microfluidos (figura 3B)
    1. Mezcle 2 g de PDMS curado agente y 20 g de base PDMS (1:10 peso relación; Pre-PDMS). 24
    2. Vierta la mezcla pre-PDMS en el molde fabricado en el paso 1.2.
    3. Gas de la mezcla pre-PDMS en un desecador durante 30 minutos.
    4. Curar la mezcla pre-PDMS en un horno a 65 ° C por 16 h.
  4. Matrices de ensamble de MACME (figura 3B)
    1. Retire la estructura PDMS curada a paso 1.3.4 del molde y limpia con etanol al 70% (v/v).
    2. Tratar la atmósfera descarga de corona en la parte inferior de la estructura PDMS32.
      Nota: En el presente Protocolo, la corona se descarga sobre toda la superficie de una capa de 3 o 4 veces con un aparato de descarga de corona "Handy". Tratamiento plasma de oxígeno fue sustituido por descarga atmosférica de corona para alterar la adherencia superficial.
    3. Montar rápidamente la estructura PDMS con la matriz de nanofibras.
    4. Horno-cueza al horno a 65° C durante 2 días.

2. carga de hESCs en matriz MACME

  1. Para el cultivo rutinario de H9 tallo las células embrionarias humanas (hESCs), mantener las células en xeno-libre químicamente definición medio de cultivo para hPSC mantenimiento33 suplementado con 10 μm Y-27632 roca inhibidor34 (llamado hPSC medio) en un cultivo celular de 35 mm plato recubierto con matriz de gel de la membrana del sótano (MG).
  2. Células de paso cada 4 a 7 días con una proteasa de tipo tripsina recombinante.
  3. Esterilizar una matriz MACME con etanol al 99.5%, por carga en los compartimientos durante 10 min y luego eliminar el etanol. Repetir este paso 3 veces.
  4. Introducir 12 μl de magnesio, 10 vitronectina μg/mL (VN), y 0.1% (p/v) GT en el control de cámaras de la cultura e incubar las cámaras a 37 ° C por 1 h a capa en las superficies de la cámara.
    Nota: En este protocolo, MG, VN y GT fueron seleccionados como proteínas de referencia para la adherencia de la célula y la cultura. Porque MG y VN son estándar de cultivo de células matrices utilizado para mantener la auto renovación hPSC, se utilizan como controles positivos; dos dimensiones GT (2 díg) o no-capa de recubrimiento (NC) se utilizaron como controles negativos.
  5. Introducir hPSC precalentado medio en todos los compartimientos de la matriz MACME. Incubar las cámaras durante 30 min a 37 ° C.
  6. Células H9 lavar cultivado en una placa de 35 mm con DPBS, Añadir 0,5 mL de una proteasa de tipo tripsina recombinante al plato e incubar a 37 ° C por 1 min y aspirar con cuidado sólo los sobrenadantes mezclados con proteasa.
    Nota: En la etapa de aspiración, las células no están separadas.
  7. Inmediatamente añada medio hPSC, suavemente, dispensar el medio contra la superficie del plato repetidamente para disociar las células y las células separadas se transfieren a un tubo cónico de 15 mL.
  8. Centrifugue a 200 x g durante 3 min aspirar el sobrenadante y suspender las células en un medio precalentado hPSC.
  9. Introducir 12 μl de la suspensión celular (1,2 × 106 células/mL) en cada cámara de microfluidos.
    Nota: Introducir células en una cámara de otra utilizando una micropipeta. Porque el número de células sembradas de cámaras es proporcional a la densidad de la columna sobre el piso de la cámara, la densidad inicial de siembra de células podría ser controlada a pesar de muestras de la suspensión de la célula misma. Asegúrese de pipeteo se realiza suavemente. Retire el exceso medio de las cámaras con un palito con punta de algodón después de la carga. La matriz MACME es compatible con sistemas de pipeta automatizada y pipetas de laboratorio comúnmente usado, y no requiere ningún equipo especial.
  10. Cambiar el medio hPSC cada 12 h y la cultura durante 4 días.
    Nota: Volúmenes constantes del medio (1.6, 3.2 y 6.4 μL) se mantienen mediante el uso de cámaras de diferentes tamaños. Células en cultivo bajo una condición estática para minimizar la tensión de esquileo excepto el cambio del medio de cultivo celular35,36.

3. cuantitativa unicelular perfiles

  1. Tinción fluorescente de la célula en placa
    Nota:     para analizar cambios fenotípicos de la uno mismo-renovación de hPSCs, este protocolo seleccionado tres marcadores fenotípicos claves de este protocolo: OCT4, 5-ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU) y la anexina V, para medir el estado de pluripotencia, proliferación y apoptosis , respectivamente (figura 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) se utiliza para identificar los núcleos de célula. OCT4 es uno de los factores de transcripción crítica de pluripotencia.
    1. Incubar H9 hESCs en arreglos de discos de MACME en hPSC suplementado con alquino EdU de 10 μm a 37 ° C por 30 min.
    2. Después del lavado con tampón de annexin-obligatoria (10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2), se tiñen las células con un conjugado fluorescente naranja de tinte-anexina V a 20 ° C durante 15 minutos.
    3. Fijar las células en PBS con paraformaldehído al 4% (v/v) a 20 ° C durante 15 minutos y luego enjuague las células con PBS dos veces.
    4. Permeabilizar las células con PBS con 0.3% (v/v) Triton X-100 a 20 ° C por 16 h.
      Nota: Paraformaldehido debilita el vínculo entre una placa base de plástico y una estructura de microfluídica PDMS. Así, el desprendimiento de la capa PDMS del array al paso 3.2.1 también puede realizarse justo después de este paso.
    5. Incubar las células en buffer Tris base de la reacción con una azida de tinte fluorescente rojo a 20 ° C durante 30 minutos.
    6. Incubar las células en solución amortiguadora de bloqueo (PBS con 5% (v/v) de suero normal de cabra, burro normal 5% (v/v) suero, albúmina de suero bovino 3% (p/v), 0,1% (v/v) de Tween-20 y 0.1% (w/v) N-dodecil-β-D-maltoside) a 4 ° C por 16 h.
    7. Incubar en PBS con 0,5% (v/v) solución Triton X-100 y anticuerpo OCT3/4 humano (IgG de ratón) a 4 ° C por 16 h.
    8. Incubar en solución amortiguadora de bloqueo con anti-ratón burro de marcado tinte verde fluorescente IgG (H+L) a 37 ° C durante 60 minutos.
    9. Incubar en PBS con DAPI a 20 ° C durante 30 minutos.
    10. Reemplace DAPI PBS con PBS.
    11. Conservar la matriz MACME a 4 ° C hasta la adquisición de la imagen.
  2. Adquisición de la imagen (figura 4)
    1. Retire la estructura de la microfluídica PDMS de la matriz MACME.
    2. Retirar el PBS residual de la matriz MACME, aplicar 90%(v/v) glicerol en PBS a las células y coloque el cubreobjetos sobre las células.
    3. Coloque la placa boca abajo en el escenario de un microscopio de fluorescencia invertido.
    4. Adquisición de imágenes de color de 12 bits automáticamente con todos componentes motorizados (etapa, filtros, obturador y sistemas de enfoque) que eran controlados por un software de imágenes de microscopio.
      Nota. En este protocolo, tiempos de exposición se ajustan para llegar a cerca de los valores de intensidad máxima (máxima intensidad de pixel: 4096), pero no la saturación, para cada imagen, DAPI, OCT4, anexina V y EdU.
  3. Tratamiento de la imagen guiado por ordenador y fluorescencia la señal de cuantificación (figura 5)
    Nota:     el siguiente análisis de la imagen de la célula se realiza en base a un método previamente descrito37.
    1. Convertir imágenes en color a escala de grises.
    2. Calcular el valor umbral individual para cada imagen DAPI con el método de Otsu y clasificar píxeles por encima del umbral como primer plano y a continuación como fondo. Asegúrese de que el valor del primer plano corresponde a la intensidad fluorescente de DAPI.
      Nota: El proceso de análisis de imagen contiene 5 pasos; identificación de los objetos primarios en DAPI imágenes, identificación de objetos secundarios de OCT4, anexina V e imágenes de EdU, respectivamente y la medición de la intensidad del objeto. La figura 3 muestra las imágenes de la interfaz gráfica de usuario (GUI) en la configuración de procesamiento de imágenes.
    3. Medir la intensidad fluorescente de OCT4 y EdU en cada imagen.
    4. Identificar la región manchada con anexina V con el método de propagación y cuantificar la intensidad fluorescente.
  4. 3.4. estadístico análisis para visualizar los fenotipos celulares individuales en proyección de imagen de unicelular
    1. Normalizar la intensidad fluorescente entrada de cada marcador fenotípico centrado y escalando estas variables para darles peso igual.
    2. Realizar análisis de mapa (SOM) uno mismo-organización mediante el uso de un entorno de software para computación estadística y gráficos según lo descrito por anteriores estudios38,39.
      1. Crear 25 nodos SOM con distintivo cuatro "codebook vectores" correspondiente a la intensidad fluorescente de cuatro marcadores, DAPI, EdU, anexina V y OCT4.
      2. Asignar celdas individuales en cada microambiente a un "ganador" nodo de (más similar) y trazar como frecuencia de la célula, según la cual los vectores de códigos del nodo ganador se actualizan utilizando un promedio ponderado, donde el peso es la tasa de aprendizaje (aquí, 0,05 como por defecto).
        Nota: Omitir datos de cámaras que contiene menos de 1.000 células porque conjuntos de datos que contiene algunas células no proporciona resultados estadísticamente relevantes de SOM.
    3. Realizar clustering jerárquico sin supervisión con los valores de SOM-nodo mediante el método de ligamiento promedio basado en la correlación de Pearson de una agrupación de software40.
    4. Que los datos de clustering en el dendrograma y heatmap views41.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Matrices MACME: diseño y fabricación: En combinación con la tecnología de nanofibras, utilizamos cultivo celular de microfluidos y detección técnicas empleadas anteriormente para identificar las condiciones óptimas para hPSC auto-renovación o diferenciación35,36 (figura 1). Esto es idóneo para el establecimiento de robustos alto rendimiento celular ensayos porque las cámaras de cultiv...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo muestra el primer método de screening para establecer un sistema de cultivo sólido para el mantenimiento de hPSCs calificado. En primer lugar, hemos descrito cómo preparar una plataforma con diversas ECMs artificial y célula siembra densidades usando un dispositivo microfluídico integrado con una variedad de nanofibras, la matriz MACME. Phenotyping sola célula basada en imágenes en segundo lugar, cuantitativo fue realizado50 para evaluar los resultados celulares individuales y compo...

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Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Prof. N. Nakatsuji en iCeMS, Universidad de Kyoto, para proporcionar células madre embrionarias humanas. También agradecemos a Prof. A. Maruyama en Instituto de tecnología de Tokio por su apoyo en el uso del microscopio de fuerza atómica. Financiamiento fue proporcionado generosamente por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 y 24656502); la financiación también fue proporcionada por la nueva energía y organización de desarrollo de tecnologías industriales (NEDO) y la Fundación de Ciencias de la vida de Terumo. El WPI iCeMS es apoyado por el mundo Premier Internacional Investigación Centro iniciativa (IPM), el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología (MEXT), Japón. Una parte de este trabajo fue apoyada por el centro de nanotecnología de Universidad de Kyoto y la planta de Nano-procesamiento de AIST en "Proyecto de plataforma de nanotecnología" patrocinado por MEXT, Japón.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Poliestireno (PS)Sigma#182435Mw promedio: 290,000, Mn promedio: 130,000
Polimetilglutarimida (PMGI)MicroChemG113113
Gelatina (GT)SigmaG2625De piel porcina, kit de
elastómero de silicona Sylgard 184Doe Corning Toray#1064291El agente de curado PDMS y la base de elastómero de silicona son componentes de este kit.
OpenSCADEste es un software gratuito de gráficos por computadora (http://www.openscad.org/) en 3D que se utiliza para diseñar el molde del dispositivo microfluídico.
AutoCAD 2014AutodeskSe trata de un software de gráficos por ordenador en 3D (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) utilizado para el diseño de la máscara utilizada en la preparación de matrices de nanofibras.
Impresora 3D, AGILISTA-3000Keyence
Resina curable UV, AR-M2KeyenceSe utiliza para la impresión 3D de Agilista.
Ácido acéticoSigma#338826≥ 99.99%
Acetato de etiloSigma#270989Anhidro, 99.8%
Tetrahidrofurano (THF)Sigma#401757
MSP-30TDispositivoMáquina de pulverización catódica de magnetrón
Nunc OmniTrayThermo Fisher Scientific#242811Se trata de una placa base de poliestireno sobre la que se crea la matriz de nanofibras. El tamaño de esta placa suele ser de 127,7 x 85,5 mm.
Máquina de descarga de corona tipo pistolaShinko Electric & InstrumentaciónCFG-500Este práctico dispositivo se utiliza para generar corona para la activación de la superficie inferior de la capa PDMS en el paso 1.5 "Ensamblaje de las matrices MACME" en el protocolo.
Jeringa de 5 mLTerumoSS-05SZ
Aguja roma de acero inoxidable (calibre 23)Nipro#2166El diámetro exterior y la longitud son de 0,6 y 32 mm, respectivamente.
Fuente de alimentación de alto voltajeTechDempaz
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, clorhidratoDojindoW001
N-hidroxisuccinimidaSigma#56480
Matrigel hESC Qualified Matrix Corning#354277Esta proteína se denomina matriz de gel de membrana basal en el protocolo.
CellAdhere Vitronectina, Humano, SoluciónSTEMCELL Technologies#07004
TeSR-E8STEMCELL Technologies#05940Medio de cultivo sin alimentador y sin xeno para el mantenimiento de células ES e iPS humanas
Y-27632Wako Pure Chemical Industries#253-00513
Enzima TrypLE Express (1X), rojo fenolThermo Fisher Scientific#12605028Se trata de una proteasa recombinante similar a la tripsina para la disociación de células de mamíferos adherentes.
Kit de imágenes Click-iT EdU con Alexa Fluor 647 AzidesThermo Fisher ScientificC10086El marcaje fluorescente de las células en proliferación en la tinción fluorescente en placa se realizó siguiendo el manual del producto de este kit.
Anexina V, Alexa Fluor 594 conjugadoThermo Fisher ScientificA13203
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Oct-3/4 Anticuerpo (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279
Burro Anti-Ratón IgG H& L (DyLight 488)abcamab96875Este es un anticuerpo secundario utilizado en la tinción de células fluorescentes en placa.
Setrataun microscopio de fluorescencia invertida equipado con una lente de objetivo CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. (Nikon), cámara CCD (ORCA-R2, Hamamatsu), lámpara de mercurio (Intensilight, Nikon), platina automatizada XYZ (platina motorizada Ti-S-ER con codificadores, Nikon) y cubos de filtro para cuatro canales de fluorescencia (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced ResearchNikonEste es un software de imágenes de microscopio que se utiliza para la adquisición automática de imágenes.
CellProfiler, Version 2.1.0Este es un software abierto y gratuito para el análisis de imágenes celulares (http://cellprofiler.org/).
El análisis RSOM se realiza mediante el paquete kohonen de este software. Está disponible de forma gratuita (https://www.r-project.org/).
Cluster 3.0Este es el software de agrupación en clústeres de código abierto (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Con este software se realiza la agrupación jerárquica no supervisada.
Java TreeViewEste software de código abierto (http://jtreeview.sourceforge.net/) se utiliza para visualizar datos de agrupación en clústeres como un mapa de calor y un dendrograma.
H9 célula madre embrionaria humanaWiCell Banco de células madreWA09
tipo A de vacío de

References

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