Fabricación de una Matriz microambiente celular Artificial multiplexados

Summary

Este artículo describe la metodología detallada para preparar una matriz de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulación de alto rendimiento de física y química señales mímico en vivo microambientes celulares y a identificar el entorno celular óptimo para las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) con perfiles de unicelulares.

Abstract

Microambientes celulares consisten en una variedad de señales, tales como factores de crecimiento, matrices extracelulares y las interacciones intercelulares. Estas señales están bien orquestados y son cruciales en la regulación de las funciones celulares en un sistema de vida. Aunque un número de investigadores ha intentado investigar la correlación entre factores ambientales y las funciones celulares deseadas, mucho sigue siendo desconocido. Esto es en gran parte debido a la falta de una metodología apropiada para imitar tales señales ambientales en vitroy probar simultáneamente señales ambientales diferentes en las células. Aquí, Divulgamos una plataforma integrada de canales de microfluidos y una variedad de nanofibras, seguida por análisis unicelular de alto contenido, para examinar células de fenotipos alterados por distintos factores ambientales. Para demostrar la aplicación de esta plataforma, este estudio se centra en los fenotipos de uno mismo-renovar las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs). Presentamos los procedimientos de preparación de una matriz de nanofibras y la estructura de microfluidos en la fabricación de una gama de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME). Por otra parte, se describen pasos generales de la célula solo perfiles, tinción con marcadores fluorescentes múltiples, múltiples imágenes de fluorescencia y análisis estadísticos, de la célula.

Introduction

Humanas pluripotentes células madre (hPSCs)^1,2 uno mismo-renovar ilimitadamente y diferenciarse en varios linajes de tejido, que podrían revolucionar el desarrollo de fármacos, terapias basadas en células, ingeniería tisular y medicina regenerativa ^{3 , 4 , 5 , 6}. platos de cultura general y las placas de microtitulación, sin embargo, no están diseñadas para permitir la manipulación precisa de la célula física y química a nivel celular con la gama de nano a micro-metros, que es un fac....

Protocol

1. fabricación de matriz MACME

Nota: Todos los materiales y equipos se enumeran en la tabla de materiales.

1. Preparación de máscaras para una variedad de nanofibras y un molde para una estructura de microfluidos
   1. Crear imágenes tridimensionales (3D) de máscaras para las matrices de nanofibras y moldes para microfluidos estructuras utilizando paquetes de software de gráficos de computadora 3D (tabla 1).
      Nota: Las imágenes 3D son leer e imprimir por una impresora 3D. Las máscaras impresos y molde tienen las mismas dimensiones con imágenes en 3D mediante el software de grá....

Results

Matrices MACME: diseño y fabricación: En combinación con la tecnología de nanofibras, utilizamos cultivo celular de microfluidos y detección técnicas empleadas anteriormente para identificar las condiciones óptimas para hPSC auto-renovación o diferenciación^35,36 (figura 1). Esto es idóneo para el establecimiento de robustos alto rendimiento celular ensayos porque las cámaras de cultiv.......

Discussion

Este protocolo muestra el primer método de screening para establecer un sistema de cultivo sólido para el mantenimiento de hPSCs calificado. En primer lugar, hemos descrito cómo preparar una plataforma con diversas ECMs artificial y célula siembra densidades usando un dispositivo microfluídico integrado con una variedad de nanofibras, la matriz MACME. Phenotyping sola célula basada en imágenes en segundo lugar, cuantitativo fue realizado⁵⁰ para evaluar los resultados celulares individuales y compo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poliestireno (PS)	Sigma	#182435	Mw promedio: 290,000, Mn promedio: 130,000
Polimetilglutarimida (PMGI)	MicroChem	G113113
Gelatina (GT)	Sigma	G2625	De piel porcina, kit de
elastómero de silicona Sylgard 184	Doe Corning Toray	#1064291	El agente de curado PDMS y la base de elastómero de silicona son componentes de este kit.
OpenSCAD			Este es un software gratuito de gráficos por computadora (http://www.openscad.org/) en 3D que se utiliza para diseñar el molde del dispositivo microfluídico.
AutoCAD 2014	Autodesk		Se trata de un software de gráficos por ordenador en 3D (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) utilizado para el diseño de la máscara utilizada en la preparación de matrices de nanofibras.
Impresora 3D, AGILISTA-3000	Keyence
Resina curable UV, AR-M2	Keyence		Se utiliza para la impresión 3D de Agilista.
Ácido acético	Sigma	#338826	≥ 99.99%
Acetato de etilo	Sigma	#270989	Anhidro, 99.8%
Tetrahidrofurano (THF)	Sigma	#401757
MSP-30T	Dispositivo		Máquina de pulverización catódica de magnetrón
Nunc OmniTray	Thermo Fisher Scientific	#242811	Se trata de una placa base de poliestireno sobre la que se crea la matriz de nanofibras. El tamaño de esta placa suele ser de 127,7 x 85,5 mm.
Máquina de descarga de corona tipo pistola	Shinko Electric & Instrumentación	CFG-500	Este práctico dispositivo se utiliza para generar corona para la activación de la superficie inferior de la capa PDMS en el paso 1.5 "Ensamblaje de las matrices MACME" en el protocolo.
Jeringa de 5 mL	Terumo	SS-05SZ
Aguja roma de acero inoxidable (calibre 23)	Nipro	#2166	El diámetro exterior y la longitud son de 0,6 y 32 mm, respectivamente.
Fuente de alimentación de alto voltaje	TechDempaz
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, clorhidrato	Dojindo	W001
N-hidroxisuccinimida	Sigma	#56480
Matrigel hESC Qualified Matrix Corning		#354277	Esta proteína se denomina matriz de gel de membrana basal en el protocolo.
CellAdhere Vitronectina, Humano, Solución	STEMCELL Technologies	#07004
TeSR-E8	STEMCELL Technologies	#05940	Medio de cultivo sin alimentador y sin xeno para el mantenimiento de células ES e iPS humanas
Y-27632	Wako Pure Chemical Industries	#253-00513
Enzima TrypLE Express (1X), rojo fenol	Thermo Fisher Scientific	#12605028	Se trata de una proteasa recombinante similar a la tripsina para la disociación de células de mamíferos adherentes.
Kit de imágenes Click-iT EdU con Alexa Fluor 647 Azides	Thermo Fisher Scientific	C10086	El marcaje fluorescente de las células en proliferación en la tinción fluorescente en placa se realizó siguiendo el manual del producto de este kit.
Anexina V, Alexa Fluor 594 conjugado	Thermo Fisher Scientific	A13203
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Oct-3/4 Anticuerpo (C-10)	Santa Cruz Biotechnology	sc-5279
Burro Anti-Ratón IgG H& L (DyLight 488)	abcam	ab96875	Este es un anticuerpo secundario utilizado en la tinción de células fluorescentes en placa.
Se	trata		un microscopio de fluorescencia invertida equipado con una lente de objetivo CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. (Nikon), cámara CCD (ORCA-R2, Hamamatsu), lámpara de mercurio (Intensilight, Nikon), platina automatizada XYZ (platina motorizada Ti-S-ER con codificadores, Nikon) y cubos de filtro para cuatro canales de fluorescencia (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon)
NIS-Elements Advanced Research	Nikon		Este es un software de imágenes de microscopio que se utiliza para la adquisición automática de imágenes.
CellProfiler, Version 2.1.0			Este es un software abierto y gratuito para el análisis de imágenes celulares (http://cellprofiler.org/).
El análisis R			SOM se realiza mediante el paquete kohonen de este software. Está disponible de forma gratuita (https://www.r-project.org/).
Cluster 3.0			Este es el software de agrupación en clústeres de código abierto (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Con este software se realiza la agrupación jerárquica no supervisada.
Java TreeView			Este software de código abierto (http://jtreeview.sourceforge.net/) se utiliza para visualizar datos de agrupación en clústeres como un mapa de calor y un dendrograma.
H9 célula madre embrionaria humana	WiCell Banco de células madre	WA09