Uso práctico de ARN de interferencia: administración Oral de ARN bicatenario en liposomas portadores para las cucarachas

RNAi se ha demostrado como un método eficaz para la expresión génica de precipitación a través de un mecanismo de una vía de silenciamiento postranscripcional provocada por las moléculas de dsRNA en muchos eucariotas¹. En la última década de estudio, RNAi se ha convertido en una herramienta útil para el estudio de las funciones de los genes de desarrollo comportamiento por agotamiento de la expresión de genes específicos a través de inyección o alimentación de dsARN en varios taxa de insectos^2,3. Debido a la especificidad y la robustez del efecto que agota, la aplicación de ARNi se considera actualmente como una estrategia potencial para^4,de gestión de control de plagas⁵. Sin embargo, la eficacia de RNAi varía ampliamente entre especies de insectos, dependiendo de los diferentes genes blanco y los métodos de entrega. Un cuerpo creciente de evidencia sugiere que la inestabilidad del dsRNA, que se degrada por ribonucleasas, es un factor crítico para la eficacia limitada de ARNi^5,6. Por ejemplo, la baja sensibilidad de ARNi en sexta de Manduca ha sido explicada por el hecho de que el dsARN mezclado con hemolinfa fue rápidamente degradado dentro de 1 hora⁷. Del mismo modo, la presencia de nucleasas alcalinas en el intestino medio, que eficientemente degradar dsRNA ingerido, está fuertemente correlacionada con baja eficiencia de ARNi en diferentes órdenes de insectos^8,9,10.

La administración oral de dsRNA es particularmente interesante para el uso de RNAi en una estrategia de control de plagas, pero retardar la degradación del dsRNA de nucleasas en el midgut ha no aún ha desarrollado un método, que tendrían el potencial para asegurar la eficaz Arni mediante la alimentación. Sin embargo, la insensibilidad de RNAi para administración oral de dsARN se han descrito gran cantidad de dsRNA, por ejemplo, 50 μg de Bombyx mori, la alimentación o alimentación continua por 8 días (8 μg dsRNA en total) en las especies de langosta. La cucaracha alemana Blattella germinica, es altamente sensible a ARNi por la inyección de dsRNA^11,12,13,14, pero no responde a dsARN a través de la alimentación. Recientemente, Lin et al. (2017) han demostrado que el dsARN encapsulado con resultados de portadores de liposomas en ARNi éxito a caída la expresión de genes de la α-tubulina en la mortalidad significativa del midgut y disparador de la cucaracha alemana¹⁵. Como la degradación de dsARN en el intestino medio es el factor limitante para RNAi oral, los portadores de liposomas son un vehículo para proteger dsRNA de degradación, que es fácilmente aplicable en otros insectos con actividades de nucleasa fuerte en la tripa. De la nota, la razón para elegir el reactivo de transfección particular (véase Tabla de materiales) utiliza como portador del liposoma en el protocolo actual es que ha sido probado para la transfección de células de insecto línea con menos toxicidad, según la instrucciones del fabricante. Según la comparación de los sistemas de transfección de liposoma diferente en Gharavi et al. (2013) ¹⁶, la eficiencia de transferencia pequeño arn interferente (siRNA) es aproximadamente el mismo entre este y otros sistemas disponibles en el mercado que se han utilizado para los sistemas de entrega de dsARN en otros insectos^17,18 . Además, nuestro método de alimentación es lo suficientemente cuidadoso asegurar la cantidad adecuada de dsRNA es ingerida por cada cucaracha, y que los resultados son robustos y confirmado. En Resumen, el presente Protocolo y los resultados demuestran que usando dsARN lipoplexes mejora la estabilidad de dsARN y abre la puerta al diseño de la administración oral de la estrategia de ARNi, que es un enfoque prometedor para el control de plagas en el futuro.

1. síntesis y preparación de dsRNA

1. Identificar los sitios de destino de dsARN en el 3' región sin traducir de los genes diana. El dsTub se utiliza para apuntar el gen de la α-tubulina (tub) (GenBank número de accesión: KX228233), y dsEGFP como un control negativo de dsARN se diseña de la secuencia de la proteína de fluorescencia verde (EGFP; GenBank número de accesión: LC311024).
2. Realizar la amplificación por PCR estándar para sintetizar las plantillas de dsRNA con cartillas gene-específicas que contenga la secuencia de promotor de T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). La cartilla información utilizado y las condiciones de amplificación de PCR son las reportadas por Lin et al. (2017) ¹² (véase Tabla de materiales).
3. Proceder con la preparación de dsRNA utilizando una transcripción T7 Kit (véase Tabla de materiales), siguiendo las instrucciones del fabricante.
   Nota: Para producir alta cantidad dsRNA, mezclar dos reacciones en un tubo (en total 40 μL) e incube a 37 ° C durante la noche.
4. Añadir 2 μl de DNasa (véase Tabla de materiales) en muestras de dsRNA durante 15 min a 37 ° C a plantillas de la DNA de digerir.
5. Añadir 200 μL de reactivo de extracción (véase Tabla de materiales) y cloroformo de 40 μl, y vortex.
6. Centrifugar durante 10 min a 13.000 x g a 4 ° C, y luego recoger sobrenadante (150 μL) en un nuevo tubo de microcentrífuga.
7. Precipitar el dsRNA agregando 150 de μl isopropanol y incubar durante 15 minutos en hielo.
8. Centrifugar durante 15 min a 13.000 x g a 4 ° C, luego retire el sobrenadante.
9. Añadir 200 μL de etanol 70% para lavar dsARN pellets. Centrifugar 10 min a 13.000 x g a 4 ° C.
10. Eliminar el etanol y repita los pasos de lavado del etanol.
11. Eliminar el etanol y el dsRNA seco pellet por concentradores de vacío centrífugos durante 3 min., luego resuspender dsRNA con agua libre de ARNasa.
12. Determinar la cantidad del dsRNA purificada usando un espectrofotómetro de UV-Vis de micro-volumen (véase Tabla de materiales) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y ajustar a la concentración deseada (p. ej., 0,25 μg/μl para la preparación de dsRNA lipoplexes).
13. Almacenar las muestras de dsRNA a-20 ° C hasta por 3 meses.

2. preparación de dsARN Lipoplexes

1. Diluir 4 μL del reactivo de transfección (véase Tabla de materiales) al añadir 4 μL de solución de glucosa 5%. Diluir 4 μL de dsRNA (1 μg) al añadir 4 μL de solución de glucosa 5%.
2. Añadir la solución de reactivo de liposomas diluido inmediatamente en la solución de dsRNA diluido todos a la vez. Vortex para mezclar e incubar por 15 min a 25 ° C.
   Nota: No mezcle las soluciones en el orden inverso.
3. El dsRNA lipoplexes están listas para usarse. Use dentro de 1 hora de preparación y desechar después de 1 hora.
   Nota: Según las instrucciones del fabricante, los lipoplexes debe usarse tan pronto como sea posible.

3. colección de enzimas extracelulares de hemolinfa y jugo del Midgut

1. Tampón salino insectos (stock de x 10)
   1. Mezclar 900 mL de agua bidestilada con 109,3 g NaCl, 15,7 g KCl, 6,3 g CaCl₂y 8,3 g MgCl₂·6H₂O.
   2. Ajustar el pH a 6.8 y completar hasta 1.000 mL.
2. Colección de hemolinfa
   1. Anestesiar las cucarachas en el hielo hasta que no se muevan durante 3 minutos.
   2. Sostenga la cucaracha con dos dedos (índice y pulgar) y subir el lado ventral de la cucaracha.
   3. Utilizar la tijera de disección para corte frente a la punta de la cadera de una pata trasera.
      Nota: Cortar la intersección conectada entre la coxa y trocánter. La supresión de la otra parte de la cadera era menos eficiente para recoger la hemolinfa.
   4. Apriete el abdomen suavemente con el dedo medio y recoger la hemolinfa sangrado de la incisión con una micropipeta 10 μl.
   5. Piscina de la hemolinfa de varias cucarachas (5 individuos) en un tubo de microcentrífuga.
      Nota: Mantenga los tubos de microcentrífuga en hielo para evitar melanization. El volumen promedio de hemolinfa de una cucaracha macho es 2-3 μl.
   6. Girar por la hemolinfa brevemente con una centrífuga de mesa para 10 s.
   7. Transferir el volumen de hemolinfa (es decir, 10 μl) y mezclar con 50 μl de tampón salino insectos de 1 x.
   8. Centrifugar 10 min a 1.000 x g a 4 ° C para girar por hemocitos. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio.
   9. Cuantificar la concentración de proteína total utilizando un espectrofotómetro de UV-Vis de micro volumen midiendo A280¹⁵.
   10. Ajustar cada muestra para tener la misma concentración de proteína (6 mg/μl de proteínas totales).
3. Colección de jugo del midgut
   1. Anestesiar las cucarachas en el hielo. Arreglar las cucarachas lado ventral de la placa de disección con tampón salino insecto frío 1 x usando pernos de insectos.
   2. Diseccionar el abdomen con una pinza fina. Quitar la tripa entera (incluyendo el intestino delantero, mediados, anteriores y posteriores) a un plato fresco con 1 x buffer salina insectos.
   3. Retire el intestino delantero y trasero y transferir rápidamente el midgut en un tubo de microcentrífuga que contiene 100 μl de tampón salino de insectos.
   4. Piscina midguts de seis cucarachas en el mismo tubo y el vortex por 10 s.
   5. Centrifugar 10 min a 1.000 x g a 4 ° C para girar por los hemocitos y los tejidos del intestino. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio.
   6. Cuantificar la concentración de proteína total utilizando un espectrofotómetro de UV-Vis de micro volumen midiendo A280¹⁵.
   7. Ajustar cada muestra para tener la misma concentración de proteína (6 mg/μl de proteínas totales).

4. Análisis de la degradación de dsRNA

1. Recién preparar 4 μL de dsARN desnuda o dsRNA lipoplexes (1 μg).
2. Mezcla de enzimas de soluciones con 10 μl de tampón salino insectos (control), extraídas de dsRNA de hemolinfa o midgut jugo.
3. Añadir 2 μl de EGTA (20 mM) o agua libre de ARNasa para separar las muestras como los controles para la inhibición de actividades enzimáticas.
4. Incubar durante 1 hora o más (6, 12 o 24 horas) a 25 ° C.
5. Añadir 200 μL de reactivo de extracción y 40 μl cloroformo, entonces el vórtice.
6. Centrifugar durante 10 min a 13.000 x g a 4 ° C, y luego recoger sobrenadante (150 μL) en un nuevo tubo de microcentrífuga.
7. Precipitar el dsRNA agregando 150 de μl isopropanol y incubar durante 15 minutos en hielo.
8. Centrifugar durante 15 min a 13.000 x g a 4 ° C, luego retire el sobrenadante.
9. Añadir 200 μL de etanol 70% para lavar dsARN pellets. Centrifugar 10 min a 13.000 x g a 4 ° C.
10. Eliminar el etanol y repita los pasos de lavado del etanol.
11. Eliminar el etanol y el dsRNA seco pellet por concentradores de vacío centrífugos de dsRNA de resuspender 3 minutos con 10 μl de agua libre de ARNasa.
12. Comprobar la integridad del dsRNA tratada mediante electroforesis en gel de agarosa 1.5%.

5. oral Administración de dsRNA

1. Mantener las cucarachas en una dieta ad libitum de alimento seco (chow del perro). Privar de abastecimiento de agua de las cucarachas un día antes experimentos de ingestión de dsRNA.
2. Mantenga una cucaracha por el acaparamiento de sus alas con el fórceps flexible (figura 1, paso 5).
   Nota: No agarre las partes del cuerpo de las cucarachas.
3. Preparar el dsRNA lipoplexes, así como el dsRNA desnuda, para la alimentación, como se describe en la sección 2.
   Nota: Recién se preparara los lipoplexes dsRNA antes de alimentar.
4. Alimentación 4 μL de dsARN lipoplexes o dsRNA desnuda (250 ng) con una micropipeta.
5. Lentamente pipetee la gota de la solución de dsRNA cerca de las piezas bucales de las cucarachas y que las cucarachas ingieren la gota completamente.
6. Realizar los experimentos de ingesta dos veces al día (1 h después de luces y 1 h antes de apagar las luces) de 8 días o 16 días continuamente.
   Nota: Todas las cucarachas adquirieron agua sólo a través de la alimentación manual con reactivos con solución o control de dsRNA (p. ej., agua libre de nucleasa, solución de glucosa y reactivo de liposomas) durante experimentos de ingestión.
7. Ofrecen botellas de agua a las cucarachas después de 16 días de la ingestión del dsRNA experimentos.

6. evaluar la caída

1. En el tiempo escogido puntos (2, 9 y 17 días después análisis de dsARN ingestión), recoger los insectos tratados con dsEGFP y dsTub y disecar los tejidos solicitados(por ejemplo, el intestino medio).
2. Realizar PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). Las condiciones de amplificación qRT-PCR e información de la cartilla por Lin et al. (2017) ¹².
3. Evaluar el control y trató de dsARN insectos diariamente para verificar la mortalidad y eliminar las cucarachas que ya no se están moviendo.

Un esquema simplificado del protocolo para la entrega oral de dsARN se presenta en la figura 1, donde se muestran los pasos para la preparación de dsARN lipoplexes.

Con el fin de investigar la protección otorgada por las compañías de liposomas sobre degradación de dsARN en el jugo del midgut de B. germanica, un ensayo ex vivo de donde se llevó a cabo dsTub lipoplexes se incubaron con el jugo del midgut y la integridad de lo dsRNA Posteriormente se analizó en gel de agarosa 1.5%. La figura 2 muestra que la fuerte actividad de nucleasa de RNA estaba presente en el jugo del midgut de B. germanica (figura 2A), mientras que los liposomas portadores eran capaces de proteger dsRNA contra la degradación por lo menos durante 1 hora en el ex vivo incubación (figura 2A, B). Como resultado, la ingesta oral de dsARN lipoplexes se aplicó dos veces al día para aumentar la susceptibilidad de los tejidos del intestino medio a ARNi en los siguientes experimentos.

Validación de la respuesta de RNAi por administración oral de dsARN se evaluó midiendo el efecto del agotamiento de la expresión de mRNA de tina en el midgut en diferentes puntos temporales después de la ingestión continua de dsRNA (figura 3A). La expresión de tina en el midgut significativamente fue agotada después de la ingestión continua de dsTub lipoplexes para 8 días. Mientras que la alimentación continua de dsRNA duró 16 días, la expresión de tina en el midgut fue significativamente reducida en dsTub desnuda los dsTub lipoplexes grupos (aproximadamente por 24 y 60%, respectivamente) en contraste con los controles. Figura 3 B muestra un incremento consistente y significativa de la mortalidad después de la administración oral de lipoplexes dsTub durante 16 días.

Figura 1 : Esquema simplificado de la administración oral de dsARN lipoplexes para las cucarachas. Los pasos clave para la preparación de dsARN lipoplexes son representados para los pasos 1 a 4. La técnica de alimentación (paso 5) se muestra en la foto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ex vivo degradación de dsRNA de B. germanica hemolinfa (Hemo) o jugo del midgut. (A) 1 μg del desnudo o liposomas cojugated dsTub se incubó por 1 h con solución salina buffer y enzimas extraídas de hemolinfa (hemo) o jugo del midgut, respectivamente. DsTub desnuda, pero no de liposomas conjugados dsTub, fue degradada completamente cuando se incuban con 1 x jugo del midgut. Se indican los factores de dilución diferente del original jugo de midgut (1 x). La degradación fue inhibida por quelación de iones debido al tratamiento de EGTA como control. (B) protección de Time-dependent de dsTub encapsuladas en liposomas (1 μg) contra la ex vivo degradación en hemolinfa o midgut jugo. De la nota, el dsTub liposomas conjugados se degradó completamente cuando se incuban con el jugo del midgut después de 24 h. La hemolinfa y midgut jugo fueron utilizados en la concentración original para diferentes períodos de tiempo de incubación. Los resultados están adaptados de Lin et al. (2017) 12. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Efectos de la respuesta de RNAi por ingestión de dsARN en B. germanica. (A) PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) para determinar la expresión relativa de tina en el midgut de la cucaracha alemana después de diferentes tratamientos de alimentación. Se normalizaron los niveles de expresión de los diferentes tratamientos para el grupo de glucosa al día 2. Los valores son el promedio ± SE de tres experimentos independientes (n = 3), cada uno con 3-5 repeticiones biológicas. Letras diferentes sobre las barras indican diferencias significativas a p < 0.05 (siguiente Post Hoc HSD de Tukey ANOVA) entre los grupos de tratamiento diferentes. (B) supervivencia de las cucarachas que ingiere dsTub desnuda o dsTub lipoplexes para 8 días (8 d) o 16 días (16d) (cada cohorte de individuos de 12-15; n = 3 experimentos independientes). Los valores son la media ± SE. diferentes letras en el grupo de tratamiento indican diferencias significativas a p < 0.05 (prueba de Kruskal-Wallis) para la supervivencia. Los resultados están adaptados de Lin et al. (2017) 12. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.