Adaptación de la tecnología de matriz de microelectrodos para el estudio de la neurotoxicidad inducida por la anestesia en el cerebro intacto cochinillo

Cada año, millones de niños se someten a anestesia para procedimientos invasivos y no invasivos en los Estados Unidos¹. Durante años, proveedores de anestesia han tranquilizado a los padres la seguridad de los anestésicos, incluso en niños pequeños y recién nacidos. Sin embargo, en 1999 se encontró que transitorio bloqueo del subtipo N-metil-D-Aspartato (NMDA) receptores de glutamato durante la vida temprana puede causar apoptosis neuronal generalizada en ratas². Recientemente, la FDA publicó una comunicación de seguridad de medicamentos que se requiere las etiquetas de los fármacos anestésicos para incluir una advertencia acerca de los anestésicos generales y su potencial efecto negativo sobre el cerebro en desarrollo de los niños menores de 3 años de edad (alimentos de Estados Unidos y Drug Administration, 2017). Sin embargo, todavía hay una necesidad de dilucidar los mecanismos posibles y potenciales medidas neuroprotectoras.

Actividad normal de los neurotransmisores como glutamato y gamma-amino butírico (GABA) son cruciales para el desarrollo neurológico normal que ocurra. Aunque la mayoría de las vías implicadas en AIN son todavía elusiva, sistemas de neurotransmisores están muy probables que estar involucrados ya que los anestésicos se saben que modulan estas vías para producir inconsciencia. En particular, el neurotransmisor excitatorio glutamato provoca excitotoxicidad cuando su actividad se altera. Este neurotransmisor participa normalmente en neurogénesis, plasticidad neuronal, crecimiento neuronal y sináptico y un número de otras funciones del cerebro muy importante. Sin embargo, puede causar activación prolongada de los receptores de glutamato excitotoxicidad y apoptosis neuronal, particularmente bajo condiciones de estrés como cirugía, privación de oxígeno y de la disponibilidad de energía³. Unión de glutamato a la NMDA receptor ha demostrado causar Na⁺ y Cl⁻ afluencia. La posterior despolarización se piensa para conducir a la apertura de canal de Ca^{2 +} y liberación de Ca intracelular^{2 +} almacena⁴. Esta probable disfunción conduce a una cascada de derangements metabólicos que eventualmente disminuir proliferación neuronal, aumentar la inflamación y conducir a la muerte neuronal. A pesar de estas hipótesis, los verdaderos mecanismos de AIN siguen claro⁵. Debido a su papel en la apoptosis, dysregulation de glutamato representa una vía nueva que puede contribuir al mecanismo de apoptosis neuronal previamente documentada, una característica de la AIN.

Uno de los obstáculos en el estudio de procesos neuronales es su alta complejidad, especialmente en el entorno de desarrollo neuronal. Los primeros meses de vida son el período de máxima vulnerabilidad a las lesiones, durante el cual la mayoría de las etapas importantes del desarrollo neuronal como apoptosis fisiológica (poda neuronal), gliogenesis y sinaptogénesis y mielinización toman lugar⁶ . Dada la naturaleza compleja de la comunicación neuronal y la dificultad de estudiar estos procesos sin alterar la función normal de la CNS, las nuevas tecnologías se han desarrollado que tienen como objetivo la en vivo detección y cuantificación de elementos importantes de la comunicación neuronal.

Enzima-ligado MEA tecnología fue utilizada en este estudio como una forma novedosa para el estudio de los mecanismos de la AIN en un modelo de cochinillo clínicamente relevantes. Esta tecnología puede utilizarse para estudiar complejo en vivo procesos electroquímicos del cerebro, incluyendo glutamato dysregulation. Los sitios de platino de 4 canales incorporado de la AMMA (2 sitios sensibles a glutamato y sitios centinela 2) permiten la referencia, que contribuye a la precisión de detección. Además, una capa de exclusión se aplica a los electrodos, que confiere selectividad mediante la prevención de otras moléculas que interfieren detectaron⁷. Por otra parte, el diseño de bajo perfil del MEA permite trauma mínima del tejido respecto a tecnologías anteriores. Esta misma característica confiere MEAs una resolución espacial más alta, que facilita el estudio de regiones microscópicas en el cerebro. Por ejemplo, regiones discretas del hipocampo (giro dentado, CA1, CA2) pueden ser específicamente estudiado⁸. Detalles específicos sobre la funcionalidad de los AMUMA han sido previamente descritos⁹.

En comparación con la electroquímica de la MEA, microdialysis incorpora una membrana situada entre la solución de interés y una solución de composición similar, que permiten la detección de líquido extracelular cambia¹⁰. Aunque microdiálisis es uno de los pilares de la neuroquímica y ha sido utilizada para la detección de los neurotransmisores, tiene la desventaja del tiempo baja resolución, tardía detección de cambio de glutamato y tejido significativo trauma¹¹.

MEAs pueden detectar indirectamente neurotransmisores como el glutamato, la acetilcolina y la colina, utilizando enzimas oxidasa apropiado que producen electroactivos reportero moléculas tales como H₂O₂ o O₂^12,13 .

Tecnología MEA ha sido ampliamente utilizada en ratas y primates no humanos para el estudio de la neurotoxicidad en el contexto de procesos fisiopatológicos distintos AIN^7,14. Entre algunos de estos procesos fisiopatológicos, MEA tecnología ha sido utilizada para el estudio de la enfermedad de Alzheimer, epilepsia, traumatismo craneoencefálico y el efecto de compuestos farmacológicos en la comunicación sináptica^{8,15 , 16 , 17}. aunque MEAs se han utilizado para estudiar estas patologías en ratas y primates no humanos, la alta similitud de desarrollo entre los seres humanos y los cerebros de cochinillo hace la adaptación de la tecnología MEA en lechones de una técnica muy adecuada para el estudio de mecanismos AIN¹⁸.

Cerdos (Sus scrofa) se reciben a través de una granja local aprobada por la Universidad de estatal de Ohio (OSU) institucional Animal Care y Comité uso (IACUC). Tras la aprobación del Protocolo, se realizan experimentaciones animales según política IACUC.

1. lechones y manejo de lechones

1. Utilizar lechones machos y hembras de una manera sistemática y al azar para eliminar cualquier sexo basado en factores de confusión potenciales según directrices de llegada¹⁹.
   Nota: Dado que el período de crecimiento cerebral máxima es entre 3-5 días del nacimiento de lechones, experimentación se realiza únicamente con lechones de 3-5 días de edad.
2. Garantizar lechones llegan en el vivero al menos 24 h antes de experimentación para permitir la aclimatación al medio ambiente.
   Nota: El personal veterinario proporciona cuidado rutinario de los animales. Los lechones se mantienen en jaulas individualmente temperatura permanente y continuamente vigilados y reciban un replacer de leche nutricionalmente completa ad libitum para evitar la hipoglucemia. Los lechones se mantienen también sin reemplazo de la leche (nil por sistema operativo), durante al menos 3 horas antes de la anestesia y están provistos de mantas y juguetes para niveles normales de estimulación. Si es posible, mantener los cochinillos múltiples en la misma jaula para permitir socialización.

2. desarrollo y adaptación de medidas para los estudios de la AIN en un modelo de cochinillo

Nota: Esta tecnología utiliza MEAs base enzimática cubiertos primero con enzima y electrochapados con m-fenilendiamina dihidrocloruro (mPD). Los electrodos fueron personalizados diseñado con un eje rígido de 40 mm y fabricado para su uso en lechones (figura 1).

1. Para evitar la redundancia, por favor vea la descripción detallada de MEA preparación y calibrado como describió anteriormente¹⁵ (figura 2).

3. anestesia y uso de aparatos estereotáctica personalizados para el cochinillo

1. Anestesiar los animales utilizando una estación de trabajo de anestesia con un ventilador apropiado y dispositivos de control y monitor de parámetros fisiológicos como la oximetría de pulso, presión arterial no invasiva, Electrocardiografía y temperatura a lo largo de la totalidad del experimento como describió anteriormente¹⁹. Intubar y ventilar los lechones y administre anestesia de sevoflurano a 1 concentración alveolar mínima (MAC) (aproximadamente 2.5-3%) de 3,5 h. asegurarse de que personal del laboratorio capacitado integran actualmente para estos experimentos. La piel que recubre que el área quirúrgico se extrae usando cortauñas eléctricos antes de la preparación de la piel.
   Nota: La concentración y la duración del anestésico utilizado permite el experimento simular la duración de la exposición real de la anestesia durante un procedimiento quirúrgico. Además, el sevoflurano es más comúnmente utilizaron anestesia general en la población pediátrica que la investigación que rodea su seguridad de suma importancia.
2. Antes de la colocación en el bastidor estereotáxicas, iniciar un rocuronio de carga dosis de 2,5 mg/kg y una infusión de 1,5 mg/kg/h para prevenir el movimiento animal y asegurado en el marco.
   1. Colocar el cochinillo en el marco de específicas de cochinillo estereotáxicas confirmando una adecuada profundidad de la anestesia del dedo del pie-pizca.
   2. Proporcionar acolchado adecuado marco estereotáxicas colocando el cochinillo en una almohadilla de calentamiento de aire forzado con el acolchado adicional (p. ej., posicionador fluidizado) para prevenir las úlceras por presión.
   3. Coloque los dientes de la mandíbula superior sobre los dientes de la barra (figura 3).
      Nota: La barra del diente debe ser a un nivel suficiente para sostener el cráneo muy firmemente en su lugar.
   4. Fijar y apretar las barras oído penetrante dentro de las orejas, teniendo cuidado para que el cochinillo esté en la posición de la línea media. Posición de las puntas puntiagudas de los laterales tiene en el canal auditivo e insertar el oído bares firmemente bastante para oír el sonido "pop" asociado con la penetración de la membrana timpánica. Firmemente conectar las barras del oído en el cráneo e insertar a igual profundidad a cada lado para evitar el movimiento del cráneo durante el experimento (figura 4Panel A).
      Nota: Es de vital importancia mantener caliente el cochinillo (~ 37,8-38,6 ° C) y monitorear la temperatura durante todo el procedimiento para el mantenimiento de la normotermia. Esto puede ser logrado a través de una manta o una lámpara de calor. Asegúrese de colocar la lámpara de calor a una distancia apropiada para evitar la quema de la piel del animal.
3. Crear una incisión de línea media 4-6 cm a lo largo del cráneo con precaución para evitar marcar el cráneo con el bisturí. Una vez hecha la incisión, utilizar retracción suave y disección Roma para elevar el cuero cabelludo del cráneo. Frote suavemente el cráneo con una gasa para retirar cualquier tejido conectivo y exponer las líneas de sutura (figura 4Panel B).
   Nota: No es necesario mantener la esterilidad durante experimentos de no supervivencia. Sin embargo, se debe mantener la esterilidad durante los experimentos de supervivencia.
4. Reflejan más el cuero cabelludo, si es necesario, para exponer el área de interés y determinar la ubicación deseada para la craneotomía (figura 5Panel A). Usar un taladro quirúrgico para crear una ventana de craneotomía de aproximadamente 0,25 cm² (puede ser mayor o menor dependiendo de los objetivos experimentales) que cubre la estructura de interés, con precaución de no para lesionar la duramadre o cerebro subyacente (figura 5 , Panel B). Utilice tijeras quirúrgicas finas para suprimir la duramadre que cubre el tejido cerebral (figura 5Panel C).
5. Coloque el electrodo verticalmente como sea posible sobre el bregma asegurando el brazo metálico de la headstage para el instrumental quirúrgico de la stereotax de cochinillo. Bajar el electrodo tanto como sea posible sin tocar la superficie del cráneo. Registrar las coordenadas del vértice (figura 6Panel A).
   1. Determinar la antero-posterior y medial-lateral coordenadas así como la profundidad de la estructura de interés en relación con el bregma. Determinar las coordenadas estereotáxicas utilizando un atlas estereotáxicas apropiados para la edad y especie. En este caso, usa un atlas estereotáxicas desarrollado específicamente para lechones²⁰.
   2. Vuelva a colocar el electrodo para que tenga la ubicación antero-posterior y medial-lateral adecuada, asegurando que el microelectrodo y el aparato es perpendicular a la superficie. Coloque el electrodo de referencia pseudo debajo del cuero cabelludo, asegurando un contacto con el animal (figura 6Panel B).
   3. Lenta y suavemente, bajar el electrodo hasta la profundidad apropiada en el cerebro el brazo estereotáctica. Para el final de 2 mm, utilizar un microdrive hidráulico para conducir el electrodo a la ubicación exacta (figura 6Panel C).
      Nota: La colocación de los electrodos debe cubren la ventana de la craneotomía. La profundidad del electrodo varía dependiendo de la estructura cerebral de interés. No es necesario cerrar la incisión sobre la terminación de la recolección de datos en experimentos de supervivencia no.

4. medición del glutamato extracelular bajo anestesia de sevoflurano

1. Asegúrese de que el cochinillo está bajo monitorización fisiológica continua a lo largo de la totalidad de este procedimiento. Lechones son anestesiados inhalationally (mediante cono de cara) en preparación para el procedimiento.
2. Después de la implantación de la MEA, espere 30 minutos para que el electrodo llegar a línea de fondo para garantizar la obtención de medida correcta para 3 h (figura 7).
3. bupivacaína 0.25% (1 mL/kg) se administra por vía subcutánea en el sitio de la cirugía para el tratamiento del dolor postoperatorio. Además, liberación sostenida buprenorfina se administra por vía subcutánea q72h según sea necesario.

5. perfusión y sacrificio

1. Realizar la perfusión y procedimientos de recogida de tejido de cerebro como describieron anteriormente²¹. Para las cirugías sin supervivencia, los animales son sacrificados inmediatamente después de la experimentación mientras que aún bajo anestesia general.
2. Tomar brutos cortes transversales del cerebro cochinillo fijo y usar microscopía óptica para visualizar la pista del electrodo como se describió anteriormente²² para permitir la verificación de la colocación de la MEA, asegurando la colocación correcta de la zona de interés.

Este estudio de prueba de concepto con enzima cerámica MEA la tecnología basada en un modelo de lechones puede proporcionar un conocimiento excepcional en la dinámica de glutamato que AIN. Este estudio además demuestra que tecnología MEA enzima puede ser adaptada con éxito en el modelo de cochinillo para medir los cambios fisiológicos y asociada a la anestesia en la actividad de neurotransmisores con alta sensibilidad y su altura espacial y temporal resolución. Homeostasis fisiológica se mantuvo a lo largo de nuestros experimentos utilizando estándares y métodos clínicamente relevantes, y ningún lechón exhibió signos de perturbaciones fisiológicas.

Los datos obtenidos indican la capacidad de los AMUMA para precisamente y espacialmente resolver medidas de neurotransmisor en las estructuras corticales y subcorticales del cerebro. El uso de un aparato estereotáctica permite identificación clara de una estructura de superficie de referencia (bregma) para localizar constantemente la región de interés, independientemente de las diferencias individuales en la anatomía y tamaño de lechones. Visualización clara de las suturas facilita colocación regional consistente de la MEA con precisión en la gama del micrómetro (figura 4). Obtener acceso a la superficie cortical del cerebro es mínimamente traumática con sangrado insignificante, asegurando que cualquier dinámica de glutamato en vivo no es debido a la accidental insulto sistémico o local (figura 5). La MEA personalizado, rígido entonces se alinea perpendicular al plano frontal del lechón (figura 6). No alinear correctamente el MEA antes de la inserción puede prevenir registro espacial exacto de la región de destinada, especialmente para regiones subcorticales.

Se tomaron en tiempo real en vivo mediciones de glutamato en el hipocampo de lechones viejo 3-4 días (n = 4) bajo anestesia de sevoflurano 2.5-3% (aproximadamente 1 MAC). Amperometría mediciones fueron registradas a 4 Hz y convertidas a concentración mediante una regresión lineal basada en los parámetros de calibrado (figura 8Panel A). Para cada punto del tiempo, las señales de los dos sitios sensibles a glutamato fueron hechas un promedio antes de restar la señal de centinela promedio para producir una señal corregida glutamato. Estas mediciones continuas fueron suavizadas mediante la aplicación de una media móvil para visualizar mejor la tendencia general en el tiempo (figura 8Panel B). La concentración de glutamato basal promedio fue calculada 4.61 ± 0.02 μm y se mantuvo relativamente estable a lo largo de la exposición anestésica. Actividad glutamatérgica transitoria fue identificado en un animal mediante el análisis de picos en la señal de que no se correlacionaron con la señal de Centinela (R2 < 0.5) y una relación señal a ruido de 3 (figura 9Panel A). Un total de 116 picos transitorios fueron detectados en un periodo de 3,5 h (figura 10Panel A). La amplitud de los picos transitorios resultantes generalmente se observó que del rango 1 μm (figura 10Panel B). Para cuantificar la duración de cada transeúnte, se obtuvo el tiempo (t80) requerido para que cada valor de pico máximo a la descomposición de 80% (figura 9Panel B). Media t80 de los transitorios de glutamato durante el período de grabación de 3,5 h fue de 4.68 ± 0.82 s (figura 10Panel C). Estos datos demuestran que es posible medir con precisión tanto actividad del neurotransmisor transitoria y prolongada en una región subcortical del cerebro anestesiado cochinillo.

Figura 1: comparación Visual de los tipos de matrices microelectrodo SG-2. SG-2 matrices contienen dos sitios sensibles a glutamato y dos sitios centinela glutamato-insensible (150 μm μm x 20 por sitio). (A) se muestra una matriz de microelectrodos de eje flexible en la izquierda. La matriz rígida eje microelectrodo fue diseñado para su uso en lechones y permisos más profunda implantación en grandes animales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Resumen del proceso de preparación y calibración de matriz microelectrodo. La preparación total de MEA y calibración duran aproximadamente una semana. La enzima de la capa, capa de exclusión y calibración analitos son específicos para el neurotransmisor de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: colocación de lechones en el aparato estereotáxicas. La boca del lechón se coloca en la barra de boca directamente posterior a los dientes caninos. Las barras penetrante de oído se insertan en los canales de oído para sujetar la punta posterior del cráneo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: colocación de lechones en el aparato estereotáctica para craneotomía. (A) el cochinillo de cabeza está asegurada firmemente dentro del marco estereotáctica personalizado, asegurando la colocación coherente de la MEA. Colocación equidistante de barras penetrante de oído es visible. (B) incisión de línea media antero-posterior a lo largo del cuero cabelludo. Puntuación del cráneo fue evitada para visualizar las suturas coronales y sagitales y optimizar la visualización de bregma. La barra de escala se muestra para indicar el tamaño relativo de la incisión y la ubicación de ventana de craneotomía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: craneotomía para acceder al hipocampo. (A) del cuero cabelludo refleja más exponer la ubicación aproximada de la inserción de MEA según coordenadas estereotáxicas. El área dentro de un círculo está marcado (punto negro) para guiar la craneotomía. (B) la ventana de la craneotomía (0,25 cm2) con el cráneo colgajo removido para exponer la duramadre subyacente. (C) las meninges cuidadosamente removido para exponer la corteza cerebral superficial sin trauma tisular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: MEA posicionamiento e inserción en el hipocampo. (A) colocación de MEA en el vértice para determinar una relativa localización estereotáctica del hipocampo. (B) colocación estereotáctica de la MEA en la superficie del cerebro para determinar la profundidad de inserción del hipocampo. Electrodo de referencia plata de pseudo firmemente colocado debajo del cuero cabelludo (indicado por flecha). (C) el MEA había insertado a la profundidad adecuada para obtener en tiempo real, en vivo las mediciones de glutamato extracelular en el hipocampo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: comportamiento MEA durante el período de 30 min base. El rápido aumento inicial corresponde a la pendiente de la MEA en el hipocampo con el micromanipulador. El período de línea de base comienza una vez que la MEA ha llegado a la profundidad adecuada (línea punteada). Mediciones de glutamato extracelular disminuyen durante un período de 30 min y no deben interpretarse como lecturas fisiológicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: mediciones de glutamato extracelular en tiempo real en el hipocampo de un cerdo neonatal bajo anestesia de sevoflurane. (A) el movimiento promedio de la concentración de glutamato en el hipocampo de un cerdo neonatal bajo anestesia de sevoflurano (con 10 puntos de datos). Las mediciones se realizaron en 4Hz durante 3 horas después de un período base de breve de 30 minutos. (B) atenuación de glutamato mediciones usando una media móvil de 100 puntos cada 15 min para visualizar mejor la tendencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: identificación de actividad transitoria de glutamato en el hipocampo de un cerdo neonatal bajo anestesia de sevoflurane. Picos de transitorios de glutamato (A) (en rojo) se indican en el trazo de glutamato en tiempo real. Picos se consideraron significativos cuando la relación señal a ruido supera 3 y su señal no se correlacionó con la señal de Centinela (R2 < 0.5). (B) un representante transitorio pico identificado en la figura 9Panel A. Las líneas punteadas indican la duración total necesaria para que el pico al 80% del decaimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: caracterización de transitorios de glutamato en el hipocampo de un cerdo neonatal bajo anestesia de sevoflurane. (A) A número de picos transitorios de glutamato en contenedores de 15 minutos. Picos se consideraron significativos cuando la relación señal a ruido supera 3 y su señal no se correlacionó con la señal de Centinela (R2 < 0.5). (B) la amplitud del glutamato transitorio picos. Barras de error indican el error estándar de la media. (C) significa T80 de picos transitorios de glutamato. Barras de error indican el error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Greg Gerhardt es el principal propietario de Quanteon LLC. Jorge Quintero y Jason Burmeister han servido como asesores de Quanteon LLC.