Una pantalla de alto rendimiento de pequeñas moléculas sintéticas se llevó a cabo en las especies de plantas modelo Arabidopsis thaliana. Este protocolo, desarrollado para un robot de manejo de líquidos, aumenta la velocidad de pantallas genética química hacia delante, acelerando el descubrimiento de nuevas moléculas pequeñas que afectan a la fisiología vegetal.
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Artículo de método
Optimizar el uso de un Robot de manipulación de líquidos para llevar a cabo un alto rendimiento adelante química genética pantalla de Arabidopsis thaliana
En este artículo
Resumen
Resumen
Genética química cada vez más se emplea para descifrar rasgos en las plantas que pueden ser recalcitrantes a la genética tradicional debido a la redundancia génica o mortalidad. Sin embargo, la probabilidad de que una pequeña molécula sintética ser bioactivos es baja; por lo tanto, se deben probar miles de moléculas para encontrar de interés. Robótica sistemas están diseñados para manejar grandes números de muestras, aumenta la velocidad con que puede someterse a una biblioteca química además minimizar/estandarización de error para manejo de líquidos. Para lograr una pantalla adelante genética química de alto rendimiento de una biblioteca de 50.000 moléculas pequeñas en Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocolos utilizando un líquido multicanal Banco manejo de robot fueron desarrollados que requieren un mínimo participación del técnico. Con estos protocolos, 3.271 pequeñas moléculas fueron descubiertas que causaron alteraciones fenotípicas visibles. compuestos de 1.563 inducida por raíces cortas, coloración de 1.148 compuestos alterados, pelos 383 compuestos causados y otras, no categorizado, alteraciones y germinación 177 compuestos inhibidas.
Introducción
En los últimos 20 años los investigadores en el campo de la biología vegetal han hecho grandes progresos utilizando enfoques de genética química, adelante y atrás, mejorar nuestra comprensión de la biosíntesis de la pared celular, citoesqueleto, biosíntesis de la hormona y señalización, Gravitropismo, patogenesia, biosíntesis de purinas y endomembranoso trata de1,2,3,4,5. Empleando técnicas de genética química hacia adelante permite la identificación de fenotipos de interés y permite a los investigadores a ....
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Protocolo
1. creación de una biblioteca de dilución
- La etiqueta 625 placas de dilución biblioteca a mano, asegurando que coinciden con su placa correspondiente de la biblioteca de química. Además, conecte en el flujo y las mangueras de flujo para el multicanal punta lavado automatizado laboratorio posicionador (montan@A) atravesando el disco de la consola para el depósito de 5 galones (véase Tabla de materiales).
- Acceder al ordenador y encienda la bomba de lavado a través de la conexión del controlador de dispositivo a la ALP de lavado punta de multicanal para circular el agua. Esto apagará automáticamente al final del protocolo.
- C....
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Resultados
La capacidad con precisión y eficiencia caracterizan fenotipos basados en la adición de pequeñas moléculas en concentraciones debajo de un microscopio de disección de detección es el objetivo final de este método de avance genética química en Arabidopsis. Los fenotipos observados cuando todos los compuestos de 50.000 habían sido defendidos era diversos y podría ser dividido en varias clases distintas (figura 2). Figura 3A
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Discusión
Este protocolo está diseñado para ayudar a los investigadores a lograr una pantalla adelante genética química en Arabidopsis. Proporcionamos resultados representativos desde una pantalla de 50.000 compuestos (figura 2 y figura 3), una de las más grandes pantallas adelante genética química realizada en Arabidopsis a fecha9,13,23. El uso de un robot para manejo de líquido.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Agradecemos a Jozsef cigüeña, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue y Andrea Sánchez para la discusión crítica y constructiva. El Dr. Sharyn Perry para las fotografías fenotípicas. Este material está basado en trabajo apoyado por la National Science Foundation bajo cooperativa acuerdo no. 1355438.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Proveedor local | teclado | N/A | Se utiliza para el diseño de protocolos y el funcionamiento del proveedor local de ratón Biomek FX |
| N/A | Se utiliza para el diseño de protocolos y el funcionamiento del proveedor local de pantalla de ordenador Biomek FX | ||
| N/A | utiliza para el diseño y el funcionamiento de protocolos Proveedor local de ordenadores Biomek FX | ||
| N/A | utiliza para el diseño y el funcionamiento de protocolos el Biomek FX | ||
| DIVERSet diversa biblioteca de cribado | ChemBridge | N/A | Biblioteca química |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Ejecuta y diseña el controlador de dispositivos Biomek FX |
| Beckman | Coulter | 719366 | Opera la bomba de agua/estación de lavado de puntas |
| Apilador Carrusel Colgante | Beckman Coulter | 148240 | Manejo manual de Biomek Carrusel Apilador |
| Biomek Carrusel Apilador | Beckman Coulter | 148520 | Unidad rotativa que alberga todos los FX Stacker 10 FX Stacker |
| 10 | Beckman Coulter | 148522 | Unidad elevadora que aloja componentes para pantalla |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Unidad elevadora que aloja componentes para pantalla |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Unidad elevadora que aloja componentes para la criba |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Unidad elevadora que aloja componentes para la criba |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot que realiza las operaciones deseadas |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Marcos Brazo para colocar los componentes correctamente |
| Accesorio de encuadre | Beckman Coulter | 719415 | Centra el brazo en el Accuframe |
| Lavado de puntas multicanal ALP | Beckman Coulter | 719662 | Lava las puntas después del baño de etanol |
| Cargador de puntas ALP | Beckman Coulter | 719356 | Carga neumática de las puntas en el brazo |
| Compresor de aire Proveedor | local | N/A | Proporciona aire para la carga neumática de puntas |
| MasterFlex Console Drive | Bomba Cole-Parmer | 77200-65 | utilizada para hacer circular el agua a través de la manguera de aire de lavado de punta multicanal |
| Proveedor local | N/A | Proporciona aire desde el compresor de aire hasta | |
| Proveedor local | N/A | Proporciona agua de 5 galones Reserviour a la lavadora de volquetas | |
| Beckman Coulter | de ALP estático | Viene con Biomek FX | Soporta equipos para la pantalla |
| Reservidor de 5 galonesNuestro | proveedor local | N/A | Recircula el agua sucia de la limpieza de las puntas |
| Pinzas | Beckman Coulter | Viene con Biomek FX | Agarra y mueve el equipo a los lugares correctos |
| 96 canales 200 µ Cabeza L | Beckman Coulter | Viene con Biomek FX | Sostiene las 96 puntas utilizadas dentro de la criba |
| AP96 P200 Puntas de pipeta | Beckman Coulter | 717251 | Se utiliza para hacer la biblioteca de cribado |
| Placa de fondo plano de 96 pocillos | Costar | 9018 | Ayuda en la visulización de la pantalla 96 |
| Placa de fondo en V de pocillo | Costar | 3897 | Ayuda en el almacenamiento de la biblioteca de dilución |
| AlumaSeal 96 Película de sellado | MedSci | F-96-100 | Sella para el almacenamiento tanto de la biblioteca de chemicle como de la biblioteca de dilución |
| Bolsas de plástico con cierre hermético para sándwiches | Proveedor local | N/A | Se utiliza para garantizar un ambiente húmedo para la pantalla |
| AP96 P20 Puntas | pipeta Beckman Coulter | 717254 | Se utiliza en la creación de bibliotecas de dilución |
| Cámara de crecimiento | Percival | AR36L3 | Germina semillas para fenotípicos visulización |
| Espátula | Proveedor Local | N/A | Retiene semillas para agregarlas a pozos donde la siembra líquida falló adecuadamente |
| Proveedor Local | Palillo de Dientes | N/A | Empuja las semillas de la espátula a los pozos |
| Murashige y Skoog Mezcla de sales basales | Laboratorios de Fitotecnología | M524 | Agregar a la mezcla de medios MS |
| MES Monohidrato de ácido libre Fisher | Scientific | ICN19483580 | Añadido a los medios MS para disminuir el pH |
| Agar Polvo | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Aumenta el espesor del medio para apoyar la suspensión de semillas |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Aumenta el pH a niveles adecuados |
| Botella de almacenamiento de medios de 1L | Corning | 1395-1L | Contiene suficientes medios para una pantalla |
| Tubos de centrífuga de polipropileno | Corning | 431470 | Esteriliza las semillas antes de la vernilización |
| Sonda de pH | Davis Instruments | YX-58825-26 | Se utiliza para fabricar medios |
| ALP (posicionadores automatizados de material de laboratorio) Manual del usuario | Beckman Coulter | PN 987836 | Ayuda a configurar el equipo de acompañamiento para el Biomek FX Guía del usuario del |
| carrusel de apiladores Biomek 2000 | Beckman Coulter | 609862-AA | Ayuda a configurar el carrusel |
| de apiladoresBiomek FX y FXP Manual del usuario | Beckman Coulter | PN 987834 | Se utiliza para enmarcar la |
| estación de trabajo de automatización de laboratorio Biomek FXP | Beckman Coulter | PN B32335AB | Se utiliza para ayudar a configurar el Biomek FX |
| Manual del usuario del software Biomek | Beckman Coulter | PN 987835 | Se utiliza para configurar y comprender el Software |
Referencias
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- Mc....
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Reimpresiones y permisos
