Un análisis de Microarray de proteínas para la determinación serológica de anticuerpos las respuestas siguientes infección por Clostridium difficile específica de antígeno

Resumen

Este artículo describe un método de microarrays de la proteína simple para perfiles de respuesta inmune humoral a un panel de 7-plex de altamente purificaron antígenos de Clostridium difficile en suero humano. El protocolo puede ampliarse para la determinación de las respuestas de anticuerpos específicos en los preparados de inmunoglobulina intravenosa policlonal.

Resumen

Le ofrecemos una descripción detallada de un análisis de microarray de la novela de alto rendimiento de proteína para la determinación de anti -Clostridium difficile los niveles de anticuerpos en suero humano y en preparaciones separadas de inmunoglobulina policlonal intravenosa (IgIV). El protocolo describe los pasos metodológicos involucrados en la preparación de muestras, impresión de matrices, procedimiento de ensayo y análisis de datos. Además, este protocolo podría ser desarrollado para incorporar diversas muestras clínicas incluyendo plasma y sobrenadantes de cultivo de células. Mostramos cómo microarrays de la proteína se pueden utilizar para determinar una combinación de isotipo (IgG, IgA, IgM), subclase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), y anticuerpos específicos de cepa altamente purificaron toda C. difficile toxinas A y B (toxinotype 0, tensión VPI 10463, ribotipo 087), la toxina B de una C. difficile toxina B-sólo expresando su cepa (CCUG 20309), una forma precursora de un fragmento de B de la toxina binaria, pCDTb, proteínas específicas ribotype de toda la superficie de la capa (PHL, 001, 002, 027) y control de las proteínas (tétanos tetánico y Candida albicans). Durante el experimento, microarrays están sondeados con sueros de individuos con infección por C. difficile (CDI), las personas con fibrosis quística (FQ) sin diarrea, controles sanos (HC) y de individuos pre- y post-IgIV tratamiento para la tratamiento de la CDI, el trastorno de inmunodeficiencia combinada y Polirradiculopatía desmielinizante inflamatoria crónica. Encontramos diferencias significativas en eficacia de neutralización de la toxina y los niveles de anticuerpos específicos de isotipo multi entre los grupos de pacientes, preparados comerciales de IVIg y sera antes y después administración de IVIg. También, hay una correlación significativa entre el microarray y análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) para los niveles de antitoxina IgG en muestras de suero. Estos resultados sugieren eso microarray podría convertirse en una herramienta prometedora para perfilar las respuestas del anticuerpo a los antígenos de C.difficile en seres humanos infectados o vacunados. Con el mayor refinamiento de los paneles de antígeno y una reducción en los costos de producción, esperamos que la tecnología de microarrays puede ayudar a optimizar y seleccionar las inmunoterapias más clínicamente útiles para la infección de C. difficile en un modo específico para cada paciente.

Introducción

Este protocolo describe el desarrollo y validación de un ensayo de microarray de proteínas novedosas y personalizadas para la detección y semi-cuantificación de cepa bacteriana y las respuestas de anticuerpos isotipo-específicos a los antígenos de C. difficile . Utilizamos con éxito nuestro C. difficile-análisis de microarrays específicas como una nueva herramienta prometedora para el Bioanálisis composición de contenido de anticuerpos específicos en el suero del paciente^1,2, preparaciones de IVIg³, y identificación de especificidades de anticuerpos que se correlaciona....

Protocolo

1. preparar una placa de microchips

1. Diluir los antígenos de C. difficile con un tampón de impresión [PBS-Tween-trehalosa (50 mM)] a la concentración óptima (que estaba predefinida antes de ejecutar el suero del paciente): toxina (200 μg/mL) y la toxina B (100 μg/mL), pCDTb (200 μg/mL) y natural purificada SLP todo deriva de Benito 001, 002 y 027 (200 μg/mL).
   Nota: La toxina B se obtuvo de una toxina B-expresión cepa CCUG 20309 (90 μg/mL).
   1. Diluir los controles positivos, lisados de C. albicansy toxoide tetánico con el tampón de impresión a 100 μg/mL. Por último, diluir la inmunoglobulina humana purificada que empareja el isotipo d....

Resultados

La figura 1 muestra un diagrama de flujo que describe los principales pasos en el protocolo descrito. La figura 2 muestra pruebas de correlación de Spearman demostrar acuerdo entre microarray y ELISA para IgG e IgA los niveles A y B en los sueros de pacientes de prueba. La figura 3 muestra diferencial IgG e IgA anticuerpos clase las respuestas de anticuerpos específicos a la toxina A y toxina B toxin.......

Discusión

En este protocolo, hemos demostrado que eso microarray es una plataforma adecuada para la definición de respuesta inmune humoral a antígenos de la proteína de C. difficile en el suero del paciente (figuras 3 y 6) y preparados comerciales de IgIV (figura 5). También hemos demostrado que la técnica de microarray realiza bien en comparación con ELISA convencional (figura 2) y muestra excelente reproducibilidad, intra e int.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matriz MicroGrid II de BioRobotics	Digilab, Malborough, MA, EE. UU	N/A	Matriz de contacto utilizada para la detección automatizada de los antígenos en los portaobjetos.
Escáner InnoScan 710.	Innopsys	N/A	Un escáner de portaobjetos fluorescente de microarrays con un láser rojo (Cy5) para leer la reacción.
Software MAPIX versión 7.2.0	Innopsys	N/A	Mide las intensidades de la señal de los spots.
Pin de contacto de silicio	Parallel Synthesis Technologies	SMT-P75	Imprima las muestras en los portaobjetos.
Thermo Scientific Nalgene Deseccator	Thermo Scientific	41102426	Para almacenar las diapositivas nuevas e impresas.
Placa de 384 pocillos	Genetix	X7022UN	Para preparar los antígenos.
Cubierta de placa	Sigma Aldrich, UK	CLS6570-100EA	Para reducir la evaporación de las muestras.
Portaobjetos de aminosilano	Schott,  Alemania	1064875	La diapositiva elegida para imprimir los antígenos.
Soportes para portaobjetos	GraceBio Labs, Estados Unidos	204862	Divida los portaobjetos en 16 submatrices idénticas. Estos soportes son pozos reutilizables, extraíbles y a prueba de fugas.
Lisado de Candida albicans	NIBSC	PR-BA117-S	Control positivo
Toxoide tetánico	Atenas Investigación y Tecnología	04/150
Inmunoglobulina G (IgG) de control positivo, plasma humano normal	Investigación de Atenas y  tecnología	16-16-090707	Inmunoglobulina G IgG Humana Nativa Purificada IgG, Plasma Humano.
Inmunoglobulina G1 (IgG1), plasma humano normal	Investigación de Atenas y  tecnología	16-16-090707-1	Inmunoglobulina humana nativa purificada G1 IgG1, plasma humano.
Inmunoglobulina G2 (IgG2), plasma humano normal	Investigación de Atenas y  tecnología	16-16-090707-2	Inmunoglobulina humana nativa purificada G2 IgG2, plasma humano.
Inmunoglobulina G3 (IgG3), plasma humano normal	Investigación de Atenas y  tecnología	16-16-090707-3	Inmunoglobulina humana nativa purificada G3 IgG3, plasma humano.
Inmunoglobulina G4 (IgG4), plasma humano normal	Investigación de Atenas y  tecnología	16-16-090707-4	Inmunoglobulina humana nativa purificada G4 IgG4, plasma humano.
Inmunoglobulina A (IgA), plasma humano	Investigación de Atenas y  tecnología	16-16-090701	Inmunoglobulina A (IgA) humana nativa purificada, plasma humano.
Inmunoglobulina A1 (IgA1), plasma de mieloma humano	Investigación de Atenas y  tecnología	16-16-090701-1M	Inmunoglobulina humana nativa purificada A1 (IgA1), plasma humano.
Inmunoglobulina A2 (IgA2), plasma de mieloma humano	Investigación de Atenas y  tecnología	16-16-090701-2M	Inmunoglobulina humana nativa purificada A2 (IgA2), plasma humano.
Inmunoglobulina M (IgM), plasma humano	Investigación de Atenas y  tecnología	16-16-090713	Inmunoglobulina humana nativa purificada M (IgM), plasma humano.
Anticuerpo IgG anti-humano de cabra biotinilado, específico de cadena gamma	Vector Labs	BA-3080	anticuerpo de biotina anti-IgG humano (específico de cadena γ) de cabra reacciona específicamente con IgG humana, pero no con otras inmunoglobulinas.
Ratón Anti-Humano IgG1 Bisagra-BIOT	Southern Biotec	9052-08	El anticuerpo de biotina IgG1 humano reacciona específicamente con la IgG1 humana, pero no con otras inmunoglobulinas.
Ratón Anti-Humano IgG2 Fc-BIOT	Southern Biotec	9060-08	El anticuerpo de biotina IgG2 humano reacciona específicamente con la IgG 2 humana, pero no con otras inmunoglobulinas.
Ratón antihumano IgG3 bisagra-BIOT-BIOT	Southern Biotec	9210-08	El anticuerpo IgG3-biotina humana reacciona específicamente con la IgG3 humana, pero no con otras inmunoglobulinas.
Ratón antihumano IgG4 pFc'-BIOT	Southern Biotec	9190-08	El anticuerpo de biotina IgG humana reacciona específicamente con la IgG humana, pero no con otras inmunoglobulinas.
Anti-IgA humana, específica de la cadena alfa, fabricada en cabra - Biotinylated	Vector Labs	BA-3030	El anticuerpo anti-IgG -biotina anti-humano de cabra reacciona específicamente con la IgG humana pero no con otras inmunoglobulinas.
El anticuerpo anti-biotina IgA1-BIOT	de Southern Biotec	9130-08	Cabra anti-IgG humana-biotina reacciona específicamente con la IgG humana, pero no con otras inmunoglobulinas.
Ratón Anti-Humano IgA2-BIOT	Southern Biotec	9140-08	El anticuerpo de biotina IgG humana reacciona específicamente con la IgG humana, pero no con otras inmunoglobulinas.
Ratón Anti-Humano IgM-BIOT	Southern Biotec	9020-08	El anticuerpo de biotina IgG humana reacciona específicamente con la IgG humana, pero no con otras inmunoglobulinas.
Filtro de jeringa de 0,2 mm	Thermo scientific	723-2520	Filtra el BSA al 5%.
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma Aldrich, Reino Unido	A7284	Utilice un 5% de BSA para bloquear los portaobjetos.
Diluyente de anticuerpos	Dako, UK	S3022	Para diluir el suero y el anticuerpo secundario.
Estreptavidina Cy5	eBioscience	SA1011	Detección de la reacción inmunitaria.
Toxinas enteras purificadas A y B de C. difficile (toxinotipo 0, cepa VPI 10463, ribotipo 087)	Grupo de Toxinas, Salud Pública Inglaterra	NA
Toxina B completa purificada de C. difficile (CCUG 20309 toxina B que solo expresa cepa)	Grupo de Toxinas, Salud Pública Inglaterra	NA
Forma precursora del fragmento B de la toxina binaria, pCDTb	Universidad de Bath	NA	Producido en E. Coli a partir de una construcción de genes recombinantes totalmente sintéticos. Secuencia de aminoácidos basada en la secuencia publicada del ribotipo 027 (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Proteínas de capa superficial nativas purificadas específicas del ribotipo completo (001, 002, 027)	Universidad de la Ciudad de Dublín
Vigam (Preparación para la IgIV 1)	Hospitales de la Universidad de Nottingham NHS Trust	N/A
Privigen (Preparación para la IgIV 2)	Hospitales de la Universidad de Nottingham NHS	Trust N/A
Intratect (Preparación para la IgIV 3)	Hospitales de la Universidad de Nottingham NHS Trust	N/A