Artículo de método

Un análisis de Microarray de proteínas para la determinación serológica de anticuerpos las respuestas siguientes infección por Clostridium difficile específica de antígeno

DOI:

10.3791/57399

⸱

15 de junio de 2018

 ,  , 
1Breast Surgery Group, Division of Medical Sciences and Graduate Entry Medicine, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham, 2Medical Microbiology and Immunology Department, Faculty of Medicine, Mansoura University, 3Nottingham Digestive Diseases Centre and NIHR Nottingham Digestive Diseases Biomedical Research Centre, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham

En este artículo

Resumen

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Este artículo describe un método de microarrays de la proteína simple para perfiles de respuesta inmune humoral a un panel de 7-plex de altamente purificaron antígenos de Clostridium difficile en suero humano. El protocolo puede ampliarse para la determinación de las respuestas de anticuerpos específicos en los preparados de inmunoglobulina intravenosa policlonal.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le ofrecemos una descripción detallada de un análisis de microarray de la novela de alto rendimiento de proteína para la determinación de anti -Clostridium difficile los niveles de anticuerpos en suero humano y en preparaciones separadas de inmunoglobulina policlonal intravenosa (IgIV). El protocolo describe los pasos metodológicos involucrados en la preparación de muestras, impresión de matrices, procedimiento de ensayo y análisis de datos. Además, este protocolo podría ser desarrollado para incorporar diversas muestras clínicas incluyendo plasma y sobrenadantes de cultivo de células. Mostramos cómo microarrays de la proteína se pueden utilizar para determinar una combinación de isotipo (IgG, IgA, IgM), subclase (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), y anticuerpos específicos de cepa altamente purificaron toda C. difficile toxinas A y B (toxinotype 0, tensión VPI 10463, ribotipo 087), la toxina B de una C. difficile toxina B-sólo expresando su cepa (CCUG 20309), una forma precursora de un fragmento de B de la toxina binaria, pCDTb, proteínas específicas ribotype de toda la superficie de la capa (PHL, 001, 002, 027) y control de las proteínas (tétanos tetánico y Candida albicans). Durante el experimento, microarrays están sondeados con sueros de individuos con infección por C. difficile (CDI), las personas con fibrosis quística (FQ) sin diarrea, controles sanos (HC) y de individuos pre- y post-IgIV tratamiento para la tratamiento de la CDI, el trastorno de inmunodeficiencia combinada y Polirradiculopatía desmielinizante inflamatoria crónica. Encontramos diferencias significativas en eficacia de neutralización de la toxina y los niveles de anticuerpos específicos de isotipo multi entre los grupos de pacientes, preparados comerciales de IVIg y sera antes y después administración de IVIg. También, hay una correlación significativa entre el microarray y análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) para los niveles de antitoxina IgG en muestras de suero. Estos resultados sugieren eso microarray podría convertirse en una herramienta prometedora para perfilar las respuestas del anticuerpo a los antígenos de C.difficile en seres humanos infectados o vacunados. Con el mayor refinamiento de los paneles de antígeno y una reducción en los costos de producción, esperamos que la tecnología de microarrays puede ayudar a optimizar y seleccionar las inmunoterapias más clínicamente útiles para la infección de C. difficile en un modo específico para cada paciente.

Introducción

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Este protocolo describe el desarrollo y validación de un ensayo de microarray de proteínas novedosas y personalizadas para la detección y semi-cuantificación de cepa bacteriana y las respuestas de anticuerpos isotipo-específicos a los antígenos de C. difficile . Utilizamos con éxito nuestro C. difficile-análisis de microarrays específicas como una nueva herramienta prometedora para el Bioanálisis composición de contenido de anticuerpos específicos en el suero del paciente1,2, preparaciones de IVIg3, y identificación de especificidades de anticuerpos que se correlacionan con resultados deficientes en el CDI4. Demostramos cómo biobanked sueros y preparados comerciales de IVIg pueden ser analizadas en microarray diapositivas, permitiendo alta calidad reproducible de perfiles de las respuestas de anticuerpos patógenos específicos de C. difficile en este ensayo.

Muchos niños y adultos sanos tienen anticuerpos IgG e IgA sérica detectable las toxinas de C. difficile A y B5,6. Éstos se piensan para presentarse después de la exposición transitoria durante la infancia y después de la exposición a C. difficile en la edad adulta. Por esta razón, inmunoglobulina policlonal intravenosa ha sido utilizado apagado-etiquete para tratar recurrentes y fulminante CDI7,8,9. Sin embargo, su papel definitivo y modo de acción está claro. Varios estudios han demostrado que la respuesta inmunitaria humoral a las toxinas de C. difficile desempeña un papel en la presentación de la enfermedad y el resultado. En concreto, pacientes asintomáticos muestran una mayor concentración del suero antitoxina A IgG en comparación con los pacientes que desarrollan enfermedad sintomática10. Una asociación demostrable se ha divulgado para mediana antitoxina IgG A títulos y todas las causas mortalidad a 30 días11. Varios informes también han revelado una asociación con una protección contra respuestas recurrencia y anticuerpos a la toxina A, B y varios antígenos no toxina (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD y proteínas de la capa superficial (SLPs))12,13 , 14 , 15. estas observaciones han estimulado el desarrollo de la primera inmunoterapia pasiva de drogas dirigida a C. difficile toxina B (bezlotuxumab), que recientemente ha sido aprobado por el alimento y administración de drogas y los medicamentos europeos Agencia para la prevención de la recurrente de la CDI16. Estrategias de vacunación con toxinas inactivadas o fragmentos de toxina recombinante también están actualmente bajo desarrollo17,18,19. Estos nuevos enfoques terapéuticos sin duda estimulará el requisito para la evaluación de la respuesta inmune humoral a múltiples antígenos en tamaños de muestra grandes.

Hoy en día, hay una notable falta de ensayos de alto rendimiento disponibles en el mercado capaz de evaluar simultáneamente la cepa bacteriana y las respuestas de anticuerpos isotipo-específicos a los antígenos de C. difficile . Hay una necesidad para el desarrollo de estos ensayos para facilitar esfuerzos de futuras investigaciones y aplicaciones clínicas. Microarrays de la proteína son un método para inmovilizar grandes cantidades de proteínas purificadas individualmente como una matriz espacial organizada de puntos sobre una superficie microscópica basada en diapositivas utilizando un sistema robótico, que puede ser un20 de contacto o sin contacto herramienta21de la impresión. Los puntos pueden representar mezclas complejas como los lysates de la célula, los anticuerpos, homogenados de tejido, proteínas endógenas o recombinantes o péptidos, fluidos corporales o drogas22,23.

Tecnología de microarrays de proteínas ofrece distintas ventajas sobre ELISA interna estándar técnicas, que tradicionalmente se han utilizado para evaluar las respuestas de anticuerpos de anti -C. difficile . Estos incluyen un aumento de la capacidad para detectar una gama de los multi-isotipo-específicos anticuerpos contra un panel más amplio de objetivos de la proteína, volumen reducido requisitos para antígenos, las muestras y reactivos y una mayor capacidad para incorporar una mayor número de repeticiones técnicas, además de múltiples control interno de calidad (QC) mide1. Microarrays son por lo tanto más sensibles, precisos y reproducibles y tener un mayor rango dinámico. Estos factores hacen microarrays una alternativa más barata y potencialmente favorable a ELISA para la detección a gran escala de las proteínas conocidas. Sin embargo, desventajas de la tecnología de microarrays resultan principalmente de los grandes costos iniciales asociados con establecer un panel de antígenos altamente purificados y configuración de la plataforma tecnológica.

Microarrays de la proteína se han utilizado en las últimas dos décadas como una herramienta de diagnóstico investigación básica en aplicaciones clínicas. Aplicaciones específicas incluyen la expresión de la proteína de perfiles, el estudio de las relaciones enzima-sustrato, investigación de biomarcadores, análisis de las interacciones huésped-microbio y perfiles de anticuerpos de especificidad de23,24, 2526,de,27,28. Se han establecido muchos nuevos microarrays de proteínas antígeno patógeno, incluyendo la malaria (Plasmodium)29,30de VIH-1, influenza31, síndrome respiratorio agudo severo (SARS)32, fiebre hemorrágica viral33 , herpesviruses34y35de la tuberculosis.

El presente Protocolo se relaciona con el establecimiento de un fácil funcionamiento C. difficile reactivo antígeno microarray ensayo, que permite la cuantificación exacta, precisa y específica de multi-isotipo y las respuestas de anticuerpos específicos de cepa a C. difficile antígenos en suero e inmunoglobulina intravenosa policlonal. En este documento, se incluyen resultados representativos pertenecientes a un funcionamiento de ensayo de microarray aceptable comparado con ELISA, así como análisis de precisión y reproducibilidad perfiles. Este análisis podrían desarrollarse aún más para otras muestras clínicas de perfil y establece un nuevo estándar para la investigación en bases moleculares de la CDI.

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Protocolo

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1. preparar una placa de microchips

  1. Diluir los antígenos de C. difficile con un tampón de impresión [PBS-Tween-trehalosa (50 mM)] a la concentración óptima (que estaba predefinida antes de ejecutar el suero del paciente): toxina (200 μg/mL) y la toxina B (100 μg/mL), pCDTb (200 μg/mL) y natural purificada SLP todo deriva de Benito 001, 002 y 027 (200 μg/mL).
    Nota: La toxina B se obtuvo de una toxina B-expresión cepa CCUG 20309 (90 μg/mL).
    1. Diluir los controles positivos, lisados de C. albicansy toxoide tetánico con el tampón de impresión a 100 μg/mL. Por último, diluir la inmunoglobulina humana purificada que empareja el isotipo de anticuerpo probado en serie, a partir de 50 μg/mL a través de 10 diluciones en el buffer de impresión para crear una curva de calibración.
  2. Transferir 10 μl de las diluciones en el búfer de impresión en una placa de 384 pozos.
  3. Cubra la placa con un sello de placa y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.

2. impresión de matrices con un Robot contacto

  1. Calor el pin de silicio usando el quemador de gas de mano 3 x 2 s cada y enjuague en agua limpia 3 x 3 s cada uno.
  2. Coloque la placa de microarrays en el cartucho de carga de la arrayer.
  3. Coloque el aminosilane los portaobjetos en la bandeja portaobjetos.
    Nota: La bandeja de diapositivas puede contener 27 diapositivas: tres hileras de nueve diapositivas. Las diapositivas están dispuestas en orientación vertical, a partir de la parte izquierda de la fila inferior y el resto de los espacios se cubren con diapositivas en blanco para asegurarse de que están cubiertos todos los agujeros en la bandeja portaobjetos.
    1. Pulse Aceptar y compruebe que se ha encendido un vacío y todas las diapositivas seguras. Dejo las diapositivas en el ambiente húmedo durante al menos 1 h antes de comenzar la impresión.
      Nota: Las diapositivas de aminosilane vienen en una bolsa sellada con desecante. Una vez abierto, cualquier diapositivas no utilizados deben devolverse inmediatamente en el desecador para almacenamiento hasta la fecha de caducidad.
  4. Establecer el programa de impresión adecuado para imprimir antígenos de Clostridium difficile . Lanzamiento de la Suite de aplicaciones de TAS y abra el archivo de parámetros de funcionamiento impresión requiere desde el directorio 'Mi red funciona'. Seleccione el archivo de Clostridium difficile para la impresión de todos los antígenos de Clostridium difficile por cuadruplicado.
  5. Al hacer doble clic en el icono de MicroArray de la ventana principal aparecerá una ventana con tres pestañas llamado 'parámetros de MicroArraying'.  Los tres son "Fuente", "Objetivo" y "Opciones". La ficha "Fuente" muestra detalles del número de muestras utilizado en la placa de microarrays. La pestaña "Destino" muestra detalles de cómo son las diapositivas que cargarse, cuando la matriz se deben imprimir en la diapositiva y editar el diseño de la diapositiva (16 formatos de submatriz). La pestaña de "Opciones" muestra detalles del Protocolo de lavado y de herramienta para ser usada por ejemplo. Lave después de cada muestra completa. Limpiar el pin de silicio entre muestras para evitar cualquier contaminación cruzada entre muestras.
  6. Las opciones de programación se encuentran en Opciones > Preferencias de ejecutar en la barra de herramientas de la Suite de aplicaciones de TAS. Hay 9 fichas para trabajar a través de esta sección y que completa una ficha pasar a la siguiente haciendo clic en él. Clic el el botón "OK" le llevará fuera de «Ejecutar preferencias.» En la pestaña "General" de las "preferencias de ejecución", hay un número de casillas de verificación disponibles bajo esta sección relativa a cómo se comportará el instrumento cuando se inicia un programa. Marque la casilla de "Baño de primer antes de comienzo de ejecución", todas las estaciones de lavado de tres serán sometido a una secuencia de oscurecimiento corto antes del comienzo de ejecución. Marque la casilla de "Lavar a Inicio de gestión", la herramienta pin va a lavarse antes de visita de la primera fuente. Casilla "Lavado final de carrera", la herramienta pin va a lavarse después de visitar la última fuente. El usuario puede establecer el número de ciclos de lavado. En la pestaña de "Clima" de las "preferencias de ejecución", comenzar la humidificación. La configuración que utilizamos son los siguientes: Inicio tasa de 55%, ejecutar tasa de 55%, mínima humedad 55%, objetivo humedad 60%. No arranque la carrera hasta que ha alcanzado la humedad del destino, de lo contrario los puntos será el tamaño incorrecto y la biblioteca se evaporará rápidamente.
  7. En la barra de menú de la TAS, haga clic en el botón ir.  Iniciar el funcionamiento y observar periódicamente arrayer durante la tirada que seguro todo está bien.
    Nota: Esto permite el análisis de 15 muestras en paralelo en cada diapositiva como una submatriz se utiliza como un control negativo. El diseño de submatrices se determina por el número de las impresas proteínas (antígenos) y el número de la biológica impreso Replica.
    Nota: Después de imprimir cada muestra, la cabeza se mueve hacia los baños de lavado para permitir la inmersión múltiples del perno en dos baños de lavado con agua destilada y 0.002% Tween 20 para 1.5 s en cada baño, seguido por el pin con agua ultra pura de enjuagar y secar el pasador en la estación de lavado para 4 s.

3. almacenamiento de las matrices

  1. Mantenga las diapositivas impresas almacenadas durante la noche a temperatura ambiente en el desecador.
    Nota: Las diapositivas impresas pueden almacenarse hasta por una semana.

4. matriz de sondeo

  1. Coloque cuidadosamente las diapositivas impresas en un soporte de diapositiva del formato de 16 cámaras múltiples bien.
    Nota: Las cámaras, con una profundidad de aproximadamente 7.5 mm, ofrecen una superficie generosa relación para facilitar la mezcla y pasos de lavado.
  2. Permitir que todos los reactivos a temperatura ambiente antes de usar. A menos que se especifique lo contrario, realizar los siguientes pasos a temperatura ambiente.
  3. Añada 100 μl del filtrado interpolación 5% albúmina de suero bovino (BSAT; uso un filtro de jeringa 0,2 μm) para cada bloque, cubrir las diapositivas e incubar con agitación durante 1 hora.
  4. Lavar los portaobjetos 5 x 1 min cada uno en 120 μl de tampón fosfato salina con Tween 20 (SAFT; 0,1% Tween) por pozo con agitación. No deje que los portaobjetos secar.
  5. Descongelar las muestras de suero en el hielo por 20 min y diluir cada muestra con un anticuerpo comercial diluyente con el fondo de reducción de componente (véase Tabla de materiales).
    1. Optimizar la dilución de las muestras de suero según la inmunoglobulina probada como se muestra en la tabla 2.
  6. Transferir 100 μl de las muestras de suero diluido a todos los bloques excepto uno, que se utilizará como control negativo; a este bloque, añada 100 μl de diluyente de anticuerpos solamente. Incube los portaobjetos con agitación suave durante 1 hora.
  7. Lavar los portaobjetos 5 x 3 minutos cada uno en 120 μl de SAFT (0,1% Tween) por pozo con agitación.
  8. Añada 100 μl de un anticuerpo de antihumano de cabra biotinilado diluido con diluyente de anticuerpos.
    1. Optimizar la dilución del anticuerpo secundario según la inmunoglobulina probado como se describe en la tabla 2. Cubrir las diapositivas e incubar con agitación suave durante 1 hora.
  9. Lave los portaobjetos 5 x 3 minutos cada uno en 120 μl de SAFT bien con agitación.
  10. Añada 100 μl de estreptavidina Cy5 a cada bloque diluido al 1: 2000 en 5% de BSA. Cubrir el portaobjetos con papel de aluminio para protegerlos de la luz mientras que la agitación por 15 min con agitación suave.
  11. Lave las diapositivas 5 x 1 min cada uno en 120 μl de SAFT por pozo con agitación, seguido de 2 lavados de 1 min en PBS con agitación.
  12. Girar los portaobjetos durante 5 min a 300 x g para secarlas.
  13. Mantenga los portaobjetos en una caja oscura para transporte y almacenamiento a temperatura ambiente.
  14. Proceder a escanear los arreglos inmediatamente para asegurar la consistencia de la señal después de sondeo.
    Nota: Sin embargo, sondeados diapositivas pueden almacenarse en la oscuridad y analizados dentro de una semana de ataques potenciales.

5. Análisis de las matrices

  1. Encienda el escáner láser (véase Tabla de materiales) 30 min antes de la exploración para calentar el láser. Cargar el software del escáner y conectar el ordenador con el escáner.
  2. Colocar un portaobjetos con la cara impresa boca arriba en el escáner hasta que encienda la luz de juego verde.
  3. Presione el botón de configuración y ajuste la siguiente configuración al escanear las diapositivas siguientes: modo de escaneo, mediana; Adquisición, 635 Modo de adquisición, Manual; Ganancia, 20; Potencia, bajo; Tipo de diapositiva, diapositiva sin etiqueta; Foco, foco Auto. Desactivar desplazamiento automático y establezca Barcode Reading en Pixel tamaño 10 y 35 de la exploración.
  4. Guarde las imágenes resultantes como escala de grises de 16 bits múltiples formato de imagen TIFF. Presione el botón de la Red de importación y seleccione la lista correspondiente de la matriz.
    Nota: La lista de la matriz describe el tamaño y la posición de submatrices y los nombres de las sustancias impresos relacionados con cada indicador de función.
    1. Alinear la cuadrícula a los puntos de la diapositiva.
  5. Analizar las imágenes pulsando el botón proceso de cuantificación para medir las intensidades de la señal de fluorescencia de cada lugar y guardar los resultados en un formato de texto denominado GenePix resultados (GPR).
    Nota: El archivo GPR contiene las variables de localización e identificación de los objetivos de antígeno en la matriz y también el fondo local que representa la Unión de anticuerpos y la intensidad de fluorescencia media señal los valores de cada punto.

6. Análisis de datos

  1. Calcular la mediana para las repeticiones de cada antígeno después de sustracción de fondo utilizando un software de análisis de microarrays libre llamado analizador de fase inversa proteína matriz (RPPA), un módulo en el lenguaje estadístico R en CRAN36.
  2. Trazar la curva de estándar e interpolar las señales de cada antígeno en relación con la curva estándar de inmunoglobulina utilizando software estadístico y graficación científica comercial (véase Tabla de materiales) para calcular los niveles de anticuerpos.

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Resultados

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La figura 1 muestra un diagrama de flujo que describe los principales pasos en el protocolo descrito. La figura 2 muestra pruebas de correlación de Spearman demostrar acuerdo entre microarray y ELISA para IgG e IgA los niveles A y B en los sueros de pacientes de prueba. La figura 3 muestra diferencial IgG e IgA anticuerpos clase las respuestas de anticuerpos específicos a la toxina A y toxina B toxin...

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Discusión

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En este protocolo, hemos demostrado que eso microarray es una plataforma adecuada para la definición de respuesta inmune humoral a antígenos de la proteína de C. difficile en el suero del paciente (figuras 3 y 6) y preparados comerciales de IgIV (figura 5). También hemos demostrado que la técnica de microarray realiza bien en comparación con ELISA convencional (figura 2) y muestra excelente reproducibilidad, intra e int...

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Agradecimientos

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Esta investigación fue apoyada por una beca de Hermes a Ola Negm y Tanya Monaghan y a través de fondos separados del centro de enfermedades digestivas de Nottingham y el NIHR Nottingham digestivas enfermedades centro de investigación biomédica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Matriz MicroGrid II de BioRoboticsDigilab, Malborough, MA, EE. UUN/AMatriz de contacto utilizada para la detección automatizada de los antígenos en los portaobjetos.
Escáner InnoScan 710.InnopsysN/AUn escáner de portaobjetos fluorescente de microarrays con un láser rojo (Cy5) para leer la reacción.
Software MAPIX versión 7.2.0InnopsysN/AMide las intensidades de la señal de los spots.
Pin de contacto de silicioParallel Synthesis TechnologiesSMT-P75Imprima las muestras en los portaobjetos.
Thermo Scientific Nalgene DeseccatorThermo Scientific41102426Para almacenar las diapositivas nuevas e impresas.
Placa de 384 pocillosGenetixX7022UNPara preparar los antígenos.
Cubierta de placaSigma Aldrich, UKCLS6570-100EAPara reducir la evaporación de las muestras.
Portaobjetos de aminosilanoSchott,  Alemania1064875La diapositiva elegida para imprimir los antígenos.
Soportes para portaobjetosGraceBio Labs, Estados Unidos204862Divida los portaobjetos en 16 submatrices idénticas. Estos soportes son pozos reutilizables, extraíbles y a prueba de fugas.
Lisado de Candida albicansNIBSCPR-BA117-SControl positivo
Toxoide tetánico  Atenas Investigación y Tecnología04/150
Inmunoglobulina G (IgG) de control positivo, plasma humano normal  Investigación de Atenas y  tecnología   16-16-090707Inmunoglobulina G IgG Humana Nativa Purificada IgG, Plasma Humano. 
Inmunoglobulina G1 (IgG1), plasma humano normal  Investigación de Atenas y  tecnología   16-16-090707-1Inmunoglobulina humana nativa purificada G1 IgG1, plasma humano.
Inmunoglobulina G2 (IgG2), plasma humano normal  Investigación de Atenas y  tecnología   16-16-090707-2Inmunoglobulina humana nativa purificada G2 IgG2, plasma humano.
Inmunoglobulina G3 (IgG3), plasma humano normal  Investigación de Atenas y  tecnología   16-16-090707-3Inmunoglobulina humana nativa purificada G3 IgG3, plasma humano.
Inmunoglobulina G4 (IgG4), plasma humano normal  Investigación de Atenas y  tecnología   16-16-090707-4Inmunoglobulina humana nativa purificada G4 IgG4, plasma humano.
Inmunoglobulina A (IgA), plasma humano  Investigación de Atenas y  tecnología   16-16-090701Inmunoglobulina A (IgA) humana nativa purificada, plasma humano.
Inmunoglobulina A1 (IgA1), plasma de mieloma humano  Investigación de Atenas y  tecnología   16-16-090701-1MInmunoglobulina humana nativa purificada A1 (IgA1), plasma humano.
Inmunoglobulina A2 (IgA2), plasma de mieloma humano  Investigación de Atenas y  tecnología   16-16-090701-2MInmunoglobulina humana nativa purificada A2 (IgA2), plasma humano.
Inmunoglobulina M (IgM), plasma humano  Investigación de Atenas y  tecnología   16-16-090713Inmunoglobulina humana nativa purificada M (IgM), plasma humano.
Anticuerpo IgG anti-humano de cabra biotinilado, específico de cadena gammaVector LabsBA-3080anticuerpo de biotina anti-IgG humano (específico de cadena γ) de cabra reacciona específicamente con IgG humana, pero no con otras inmunoglobulinas.
Ratón Anti-Humano IgG1 Bisagra-BIOTSouthern Biotec9052-08 El anticuerpo de biotina IgG1 humano reacciona específicamente con la IgG1 humana, pero no con otras inmunoglobulinas.
Ratón Anti-Humano IgG2 Fc-BIOTSouthern Biotec9060-08   El anticuerpo de biotina IgG2 humano reacciona específicamente con la IgG 2 humana, pero no con otras inmunoglobulinas.
Ratón antihumano IgG3 bisagra-BIOT-BIOTSouthern Biotec9210-08     El anticuerpo IgG3-biotina humana reacciona específicamente con la IgG3 humana, pero no con otras inmunoglobulinas.
Ratón antihumano IgG4 pFc'-BIOTSouthern Biotec9190-08   El anticuerpo de biotina IgG humana reacciona específicamente con la IgG humana, pero no con otras inmunoglobulinas.
Anti-IgA humana, específica de la cadena alfa, fabricada en cabra - BiotinylatedVector LabsBA-3030El anticuerpo anti-IgG -biotina anti-humano de cabra reacciona específicamente con la IgG humana pero no con otras inmunoglobulinas.
El anticuerpo anti-biotina IgA1-BIOTde Southern Biotec9130-08Cabra anti-IgG humana-biotina reacciona específicamente con la IgG humana, pero no con otras inmunoglobulinas.
Ratón Anti-Humano IgA2-BIOTSouthern Biotec9140-08   El anticuerpo de biotina IgG humana reacciona específicamente con la IgG humana, pero no con otras inmunoglobulinas.
Ratón Anti-Humano IgM-BIOTSouthern Biotec9020-08 El anticuerpo de biotina IgG humana reacciona específicamente con la IgG humana, pero no con otras inmunoglobulinas.
Filtro de jeringa de 0,2 mmThermo scientific723-2520Filtra el BSA al 5%.
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma Aldrich, Reino UnidoA7284Utilice un 5% de BSA para bloquear los portaobjetos.
Diluyente de anticuerposDako, UKS3022Para diluir el suero y el anticuerpo secundario.
Estreptavidina Cy5eBioscienceSA1011Detección de la reacción inmunitaria.
Toxinas enteras purificadas A y B de C. difficile (toxinotipo 0, cepa VPI 10463, ribotipo 087)Grupo de Toxinas, Salud Pública InglaterraNA
Toxina B completa purificada de C. difficile (CCUG 20309 toxina B que solo expresa cepa)Grupo de Toxinas, Salud Pública InglaterraNA
Forma precursora del fragmento B de la toxina binaria, pCDTbUniversidad de Bath NAProducido en E. Coli a partir de una construcción de genes recombinantes totalmente sintéticos. Secuencia de aminoácidos basada en la secuencia publicada del ribotipo 027 (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Proteínas de capa superficial nativas purificadas específicas del ribotipo completo (001, 002, 027)Universidad de la Ciudad de Dublín 
Vigam (Preparación para la IgIV 1)Hospitales de la Universidad de Nottingham NHS TrustN/A
Privigen (Preparación para la IgIV 2)Hospitales de la Universidad de Nottingham NHSTrust N/A
Intratect (Preparación para la IgIV 3)Hospitales de la Universidad de Nottingham NHS TrustN/A
. El NA

Referencias

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