Una guía paso a paso para la pérdida de acidez lysosomal en el intestino de C. elegans con el colorante vital sensible a pH 6 - carboxi - 2', 7'-Diclorofluoresceína diacetato (cDCFDA)
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Artículo de método
Evaluación de alcalinización Lysosomal en el intestino de vivir Caenorhabditis elegans
En este artículo
Resumen
Resumen
El nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un modelo que es ampliamente utilizado para el estudio de longevidad y las vías de desarrollo. Tales estudios son facilitados por la transparencia de los animales, la capacidad de marcha adelante y atrás ensayos genéticos, la relativa facilidad de generar proteínas fluorescencia de etiquetado y el uso de tintes fluorescentes que tampoco puede ser microinyectados en el temprano embrión o incorporado en su alimento (e. coli cepa OP50) etiquetar organelos celulares (e.g. 9-dietilamino-5 H-benzo (a) fenoxazina-5-one y (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Aquí, presentamos el uso de un fluorescente tinte pH-sensible que tiñe lisosomas intestinales, proporcionando una lectura visual de los cambios dinámicas, fisiológicas en acidez lysosomal en gusanos vivos. Este protocolo no mide pH lisosomal, sino más bien tiene por objeto establecer un método confiable de evaluación fisiológicas variaciones relevantes en acidez lysosomal. cDCFDA es un compuesto celular florescente que es convertido a fluorescente fluoróforo 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) al producirse la hidrólisis por esterasas intracelulares. Protonación dentro de lisosomas trampas cDCF en estos orgánulos, donde se acumula. Debido a su bajo pKa de 4.8, este colorante se ha utilizado como un sensor de pH en la levadura. Aquí describimos el uso de cDCFDA como suplemento del alimento para determinar la acidez de lisosomas intestinales en C. elegans. Esta técnica permite la detección de alcalinizantes lisosomas en animales vivos, y tiene una amplia gama de aplicaciones experimentales, incluyendo estudios sobre envejecimiento, autofagia y biogénesis lisosomal.
Introducción
La aparición de agregados proteicos es ampliamente aceptada que un sello de envejecimiento en las células eucariotas1,2,3y la formación de los cuales se cree que entre los conductores de principio de senescencia celular4 , 5 , 6 , 7. Existe creciente evidencia que como células edad, catabolismo proteico se deteriora, provocando un aumento en la agregación de la proteína. El colapso de la proteólisis en el envejecimiento de las células conlleva una d....
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Protocolo
1. Mancha y lisosomas intestinales de la imagen
- Medios de cultivo nematodos de semilla (NGM) placas con OP50
- Preparar platos para NGM según el protocolo recomendado19 y permita que las placas cerradas secar por 2 días a temperatura ambiente.
- Inocular las bacterias OP50 en caldo estéril caldo de Luria (LB) y crecen en un baño incubador o agitación a 37 ° C durante 36 h o hasta que el OD es entre 0.2 y 0.4. Evitar el uso de un cultivo bacteriano con OD > 1 o OD < 0,2.
- Una vez seco planchas NGM, coloque una gota (30 μL) del inóculo OP50 en el centro de la placa y luego la gota en un parche....
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Resultados
cDCFDA lisosomas tiñe de manera dependiente del pH y su pKa bajo y lista absorción en lisosomas es un sensor de pH ideal21. cDCFDA coloración de intensidad es inversamente proporcional al pH lisosomal (es decir, tinción intensidad los aumentos como disminuciones de pH)18,22. las señales cDCFDA son siempre débiles en los lisosomas de los animales tratados con 20 mM de la cloroquina, un inhibidor de .......
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Discusión
Una variedad de eventos celulares y moleculares que contribuyen al envejecimiento, influenciado por características de historia de vida y factores genéticos. Nuestro reciente estudio22 sugiere que el ciclo reproductivo juega un papel importante en el control de la aptitud del soma a través de la regulación de la dinámica de pH lisosomal. Hemos mostrado que proteolisis lisosomal mediada es promovido mientras que animales se reproducen activamente upregulation de la transcripción de la v-ATPasa, que.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a centro Caenorhabditis genética de las cepas, las ciencias naturales y Consejo de investigación Ingeniería (NSERC) y la Fundación de Canadá para la innovación (CFI) para la financiación. Nos gustaría agradecer a Dr. Lizhen Chen (Departamento de sistemas celular y anatomía, UT salud San Antonio) para permitir el uso irrestricto de sus instalaciones de laboratorio para todos los experimentos de C. elegans , así como el Dr. Exing Wang (Director asociado, centro de la proyección de imagen óptica UT salud San Antonio) para obtener ayuda con microscopía confocal. También nos gustaría agradecer a Dr. Myron Ignatius para proporcionar ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| OP50 (E. coli) | Centro de Genética de Caenorhabditis | Haga su pedido en línea en https://cgc.umn.edu/strain/OP50 | |
| ThermoFisher | C369 | Comúnmente conocido como cDCFDA | |
| 9-dietilamino-5H-benzo(a)fenoxazina-5-ona y (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipirrol-5-il-kappaN(1))metilideno]-2H-pirrol-5-il-kappaN}-N-[2-(dimetilamino)etil]propanamidato)(difluoro)boro | ThermoFisher | L7528 | Comúnmente conocido como Lysotracker |
| Microscopio confocal rojo (p. ej., Zeiss LSM 510) | |||
| ImageJ | Descargar gratis desde https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| LB Caldo en polvo | ThermoFisher | 22700041 | |
| Bacto Agar Sigma | A5306-1KG | ||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Bacto Peptone | Fisher Scientific | S71604 | |
| Colesterol en polvo | Sigma | C3045 | |
| CaCl2 | Sigma | 449709 | |
| MgSO4 Sigma | M7506 | ||
| K3PO4 | Sigma | P5629 | |
| Azida de sodio | Sigma | S2002 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Portaobjetos de microscopio | VWR | 48311-703 | |
| Cubreobjetos | ThermoFisher | 3406 | |
| Agarosa | Sigma | A6013 | |
| Incubadora | |||
| Espejo u otra superficie |
Referencias
- Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants. Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).
- Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. Autophagy for the avoidance of neurodegeneration. Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).
- Rubinsztein, D. C.
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Reimpresiones y permisos
