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Artículo de método

Asamblea y purificación del prototipo Virus espumoso de los Intasomes

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DOI:

10.3791/57453

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19 de marzo de 2018

 ,  , 
1Department of Cancer Biology and Genetics, The Ohio State University College of Medicine

En este artículo

Resumen

Integrasa de retrovirus recombinante y oligómeros de ADN mímico extremos de DNA virales pueden formar un complejo enzimático activo conocido como un intasome. Intasomes puede ser usada para estudios bioquímicos, estructurales y cinéticos. Este protocolo detalla cómo montar y purificar el prototipo virus espumoso de los intasomes.

Resumen

A definición de función y paso necesario del ciclo de vida de retrovirus es la integración del genoma viral en el genoma del anfitrión. Los retrovirus codifican enzima integrasa (IN) que cataliza la unión covalente de viral a anfitrión DNA, que se conoce como transferencia de cadena. Integración puede ser modelada en vitro con IN retrovirus recombinante y oligómeros de ADN mímico los extremos del genoma viral. Con el fin de recapitular más de cerca la reacción de integración que se presenta en vivo, integración complejos son ensamblados de oligómeros sintéticos y recombinante IN por diálisis en un tampón de menor concentración de sal. La integración compleja, llamada un intasome, puede ser purificada por cromatografía por exclusión de tamaño. En el caso de virus espumoso de los prototipos (PFV), el intasome es un tetrámero de IN y oligómeros de ADN dos y se separa fácilmente en monomérica y oligómero gratuito ADN. La eficacia de la integración de intasomes PFV puede ensayarse bajo una variedad de condiciones experimentales para comprender mejor la dinámica y la mecánica de integración retroviral.

Introducción

Integración del genoma viral en el genoma del anfitrión es un paso obligatorio en el ciclo de vida de todos los retrovirus1. La enzima viral integrasa (IN) cataliza la unión covalente de los extremos del genoma viral de la DNA al anfitrión DNA. Durante una infección celular, en forma parte de un complejo de pre-integración que media integración. Recombinante en complexed con oligómeros de ADN de doble trenzados mímico los extremos del ADN virales también puede realizar la integración en un ADN en vitrode objetivo2. Un común integración análisis en vitro utiliza un plásmido superenrollado como el ADN diana. Integración de ambos oligómeros de ADN virales (vDNA) para el plásmido da lugar a un producto lineal y se denomina integración concertada (figura 2A). La integración análisis de vitro también se pueden producir productos con sólo un vDNA covalentemente unido al plásmido de blanco dando como resultado un círculo relajado. Este producto de la integración de medio sitio parece ser un artefacto del ensayo in vitro.

Recombinante en y vDNA pueden realizar integración en vitro, pero no son reactivos ideal para el estudio de la dinámica o estructura de los complejos de integración cuando IN monomérica oscurecería visualización pertinente. Complejos de integración purificado, o "intasomes," son necesarios para estudios de análisis o estructural dinámico a la sola molécula. EN PFV y vDNAs puede ser montada por diálisis de un búfer relativamente alta concentración de sal a una baja concentración de sal3,4. Durante la diálisis, un precipitado formas. Este precipitado se elimina de la diálisis y se aumenta la concentración de sal. La mayor concentración de sal solubiliza el precipitado que contiene intasomes PFV. El intasomes entonces se purifican por cromatografía por exclusión de tamaño (SEC). Prototipo recombinante virus espumoso (PFV) IN se ha demostrado que existe como monómero en solución a concentraciones de hasta 225 μm5. Fraccionamiento s efectivamente separa la intasomes PFV (225,5 kDa), que incluye un tetrámero en PFV y dos vDNAs, PFV monomérica en (44,4 kDa) y vDNA gratis (24.0 kDa). La intasomes PFV pueden congelar y conservar actividad de integración para al menos seis meses de almacenamiento a-80 ° c.

Recombinante intasomes PFV también puede ser modificada para incluir en las substituciones del aminoácido o mutaciones de truncamiento o vDNAs con fluoróforos o biotina4,6. Las intasomes PFV purificados fácilmente realizar integración en un objetivo de plásmido superenrollado ADN en vitro. Ensayos de integración bioquímica a granel con intasomes pueden probar los efectos de en mutaciones, inhibidores, o otros aditivos químicos. Biotinilado intasomes puede utilizarse para sonda afinidad con proteínas o ácidos nucleicos. Intasomes PFV funcionan a temperatura ambiente permitiendo análisis de microscopia sola molécula por pinza magnética para medir el tiempo entre la Unión de los dos extremos de vDNA o fluorescencia de la reflexión interna total para visualizar la búsqueda intasome en blanco De ADN6. Además, PFV intasomes fueron los primeros en ser estructuralmente caracterizan impactando significativamente el campo de la integración retroviral3.

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Protocolo

1. recocido de vDNA

  1. Combinar 1 X Buffer 10 (10 X 10 stock: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 μm 1 Oligo (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 acciones μm) y 10 μm 2 Oligo (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 acciones μm) en un volumen final de 1.5 mL . Alícuota de 25 μL en tubos de reacción en cadena (PCR) de 0.2 mL polimerasa sesenta.
    Nota: Dependiendo de la aplicación, oligómeros pueden modificarse con fluoróforos o etiquetas en el extremo 5'-2 Oligo o como un interno amino-T 13 base desde el extremo 5' de Oligo 1. Oligómeros modificados deben ser purificados por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) antes del recocido. Hemos encontrado que 5'-end Cy3 o Cy5 fluoróforo etiquetado de Oligo 2 reduce la eficacia de la Asamblea de intasome 10 veces. Fluoróforo interno etiquetado no reduce la eficiencia de montaje.
  2. Recueza utilizando un termociclador con los siguientes tiempos y temperaturas: 1 ciclo a 94.0 ° c 3 min, 99 ciclos en (94.0 ° c 1 min, ° c 93,6 1 min) disminuyendo ambas temperaturas por 0,8 ° c por ciclo (el último ciclo es de 14,8 ° c 1 min, 14,4 ° c 1 min) y conservarlo a 4.0 ° c.
  3. Se combinan las reacciones recocidas de sesenta todos los tubos. Carga de 500 μl a dos 0.5 mL 3 kDa peso molecular límite (MWCO) filtro ultracentrífugo concentración unidades. El recocido vDNA se concentran mediante centrifugación en una microcentrífuga a 14.000 x g por 10 min a temperatura ambiente (RT).
    Nota: El volumen retenido debe ser ~ 50 μL en cada unidad de concentración.
  4. Deseche el flujo a través. Añadir 250 μl de la restante vDNA recocido a cada unidad de filtro. Repetir la vuelta y desechar el flujo a través. De búfer lavándola tres veces con 450 μl TE intercambio en buffer TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA).
  5. Invierta la unidad de filtrado y centrifugado a 1.000 x g durante 2 min a TA. El volumen retenido final para cada unidad de filtro debe ser ~ 50 μl. combinar el retentates y transfiéralo a un tubo de tapón de rosca de 1.5 mL.
  6. Medir la absorbancia de 260 nm ultravioleta (UV) de la vDNA. Utilice este valor para calcular la concentración molar final de la DNA. El coeficiente de extinción (ε260) de este vDNA es 622.803 cm-1 M-1 y su peso molecular es 23.972 da. tienda a-20 ° c.

2. Intasome Asamblea

  1. Si es posible, realizar la Asamblea de intasome en una pequeña habitación con un termostato variable. Ajuste el termostato entre 18-22 grados centígrados.
    Nota: En nuestra experiencia, montaje de intasome a 4 ° c es ineficiente.
  2. Preparar 1 L de tampón de diálisis (Bis-tris propano de 20 mM, pH 7,5, 200 mM NaCl, 2 mM Ditiotreitol (DTT), 25 μm vivencias2) en un vaso de precipitados de 2 L con una barra de agitación en una placa de agitación. Equilibrar el búfer en la sala de 18-22 ° c durante al menos 6 h.
  3. Para montar el intasomes, combinan propano 50 mM Bis-tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 120 μm en PFV y 50 μm vDNA en un volumen total de 150 μL.
    Nota: El en PFV debe estar libre de contaminantes actividad nucleasa de7,8. Si la concentración de PFV es demasiado diluida para dar cabida a 120 μm IN en volumen de 150 μL, entonces es posible aumentar el volumen final a 200 μl. Los factores críticos de este paso son para mantener la proporción molar de IN a vDNA (2.4:1) y tener suficiente complejo visualizar durante la cromatografía.
  4. Limpiar un pedazo largo de ~ 10 cm de tubo de diálisis de 10 mm 6-8 kDa MWCO y clips con agua bidestilada (ddH2O), o agua de pureza más alto disponible. Clip de uno de los extremos de la tubería.
    Nota: La tubería de la diálisis debe manejarse con cuidado para evitar cualquier posible contaminación del espacio lab.
  5. Tomar 15 mL de solución de enjuague de tubo de diálisis (propano 50 mM Bis-tris, pH 7,5, 500 mM NaCl). Enjuague el interior de la tubería de la diálisis tres veces con 1-2 mL de tampón de enjuague. Eliminar gran parte de la solución de enjuague como sea posible con una pipeta y gel fina punta de carga.
  6. Si es necesario, use una limpia hoja de afeitar o bisturí para cortar el tubo de diálisis de forma que una carga de gel fina punta puede alcanzar el extremo de la tubería.
  7. Transferir el conjunto de intasome de paso 2.3 a la tubería de la diálisis con una pipeta y un gel fino carga punta. Enganche el extremo abierto del tubo de diálisis, minimizando la cantidad de aire introducido en el tubo. Coloque el tubo en el buffer de diálisis.
  8. Dializarse durante la noche (16-20 h) con agitación suave para que el tubo gira, pero no es en un vórtice. Asegúrese que el tubo de diálisis sumergida y móviles. Después de aproximadamente una hora, observar un precipitado visible dentro de la tubería.
    Nota: Con Cy3 y Cy5 fluorescencia etiquetada vDNA el precipitado es más obvio. Esto es cierto para finalizar etiquetado e internamente etiquetado vDNA fluorescente.

3. Intasome solubilización

  1. Preparar dos alesaje ancho puntas de pipeta mediante la eliminación de 2-4 mm del extremo de una punta de 200 μL con una cuchilla de afeitar o bisturí nuevo sobre una superficie limpia.
    Nota: Las puntas se utilizará en el paso 3.3 y 3.5.
  2. Quite los tubos de diálisis desde el buffer de diálisis. Con el fin de evitar la dilución de la muestra intasome con buffer de diálisis que puede permanecer en el extremo de la tubería cerca del clip, utilice una micropipeta con una pequeña pipeta para quitar cualquier buffer de diálisis exceso. Retire el clip de uno de los extremos de la tubería de la diálisis.
  3. Uso una amplia agujereada pipeta de paso 3.1 para transferir la muestra incluyendo el precipitado dentro de la tubería de la diálisis a un tubo de 1,5 mL en hielo. Tenga en cuenta el volumen total del material recuperado; el volumen total es típicamente ~ 140 μl.
  4. La muestra con precipitado es a 200 mM de NaCl; aumentar la sal a una concentración final de 320 mM de NaCl añadiendo el volumen adecuado de una solución de NaCl de 5 M madre. Por ejemplo, para una muestra de 150 μL, añadir μl 3,9 5 M NaCl y 1,1 μl ddH2O para un volumen final de 155 μl. transferencia de cubo de hielo con la muestra en una cámara fría de 4 ° c.
  5. Uso una amplia agujereada pipeta de paso 3.1 a suspender y solubilizar el precipitado mediante pipeteo. Repetir cada 20 min para por lo menos 1 h. Observe que la mayor parte del precipitado en solución.
    Nota: Pipeteo para Resuspender el precipitado puede suspenderse cuando es evidente que el precipitado no perceptiblemente se reduce entre puntos de tiempo. Cuando vDNA internamente es indicado o no está etiquetado, el precipitado se reduce por el ~ 90% basado en la inspección visual. En el caso de Cy5 final etiquetado vDNA, el precipitado se reduce sólo ~ 20%; la mayor parte del precipitado con el fluoróforo final etiquetado vDNA no se solubilizan. La cantidad de precipitado que efectivamente es solubilizado es variable y debe determinarse empíricamente.

4. Intasome purificación

  1. Preparar 250 mL de cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) funcionamiento tampón (propano 20 mM Bis-tris, pH 7,5, 320 mM NaCl, 10% glicerol). Filtro estéril el buffer con un 0.2 μm filtro unidad y almacenar a 4 ° c.
    Nota: Todos los pasos de purificación se realizan en una cámara fría de 4 ° c.
  2. Equilibrar una columna de agarosa reticulado SEC (diámetro = 10 mm; longitud = 300 mm, volumen de la cama = 24 mL, volumen de muestra = 25-500 μl; presión máxima = 1,5 MPa, límite de exclusión = 4 x 107 Da; separa pesos moleculares entre 5.000 y 5 kDa, ver la de la estera de tabla erials) con el almacenador intermediario corriente seg con un caudal de 0,4 mL/min.
    Nota: Esta purificación puede adaptarse a columnas de exclusión de diverso tamaño si son capaces de separar eficazmente 300 kDa de 44 kDa, como Superose 12 10/300 GL Superose 6 aumentar. Superose 12 10/300 GL tiene menor resolución, llevando a más superposición de picos. Por el contrario, Superose 6 aumentar ofrece mayor resolución y mejor separación.
  3. Centrifugue la muestra de intasome en una microcentrífuga a 14.000 x g durante 10 min a 4 ° c a cualquier precipitado restante de pellets. Retire con cuidado el sobrenadante. Cargar el sobrenadante a un bucle de inyección de 200 μl (tubería que puede contener ~ 200 μL). Aplicar la muestra a la columna de seg.
    Nota: Volúmenes más pequeños de la carga permiten una mayor resolución de la SEC.
  4. Eluir con 25 mL seg funcionando del almacenador intermediario y cobrar 95 fracciones de 270 μl. observar que el cromatograma de la SEC muestra picos de260 A280/A (figura 1) tres.
    Nota: La primera debe ser un agregado (~9.0 - elución mL 11,5), seguido de la PFV tetrámero intasome pico (~12.0 - elución mL 14,75) y monómero en PFV con pico vDNA libre (~15.0 - 18,0 mL).

5. integración del filamento transferencia ensayo, selección de la fracción y almacenamiento

  1. Combinar 2 μl de cada fracción de pico intasome y 50 ng superenrollado 3 kb ADN plásmido (stock concentración es de 50 ng/μL) en buffer de reacción (gas propano 10 mM Bis-tris, pH 7,5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μm vivencias2, 10 mM DTT) en un volumen de reacción final de 15 μl. Incubar a 37 ° c durante 5 minutos.
  2. Incluir un control negativo con ningún agregado intasome PFV. Detener la reacción con proteinasa μl 0.75 K (20 mg/mL de solución stock) y 0,75 μl SDS (solución stock al 10%). Incubar a 55 ° c para las muestras de la tienda 1 h. según sea necesario en-20 ° c para posteriores análisis.
    Nota: Este ensayo es una evaluación cualitativa de la actividad de integración. Antes este análisis no es determinar la concentración molar de intasome de cada fracción. Fracciones incluidas en el análisis de transferencia de cadena de integración pueden ser almacenados en hielo (incluido el almacenamiento durante la noche) hasta integración actividad es confirmada y las fracciones alícuotas. Aquí utilizamos pMP2, un derivado de pUC199. Hemos utilizado también con éxito el 5,4 kb plásmido pcDNA 3.1. Cualquier plásmido que puede resolverse a relajado círculo, lineal, y superenrolladas formas pueden utilizarse como un objetivo de integración.
  3. Preparar un peso de 1% de 120 mL por gel de agarosa de volumen (p/v) en tampón de TAE X 1 (40 mM Tris acetato, EDTA 1 mM) con 0,1 μg/mL etidio bromuro (EtBr, solución stock de 10 mg/mL)10. La solución de agarosa del derretimiento y vierta en una bandeja de fundición de gel de 15 cm x 10 cm. Inserte un peine de 15 pozos con 5 mm ancho, 0,75 mm espesor pozos.
    Nota: Pozos de menos rendimiento mejor resolución de banda en comparación con los pozos de espesor 1,5 mm.
  4. Permita que el gel se solidifique a temperatura ambiente. Sumergir el gel en 1 X TAE con EtBr de 0.1 μg/mL.
  5. Agregar 3 μl 50% de glicerol a cada reacción de integración del paso 5.2. El volumen de reacción todo el gel de la carga. Carga 1 μl del marcador de tamaño de DNA de 10 kb (concentración stock de 150 ng/μL) a carriles a ambos lados de las muestras; en otras palabras, el marcador del tamaño de ADN debe flanquean las calles de la muestra.
  6. En un carril exterior, carga tinte de G anaranjado de 6 μl (0,25% naranja G, glicerol 30%). Correr el gel a tensión constante, 10 V/cm (100 V) a temperatura ambiente durante 1 hora o hasta que el frente de tinte naranja G llega al final del gel.
  7. Inmediatamente la imagen del gel de agarosa con un analizador fluorescente para detectar EtBr (532 nm excitación, filtro de emisión de 610 nm). Si se utilizaron fluoróforo con la etiqueta vDNAs, también imagen con ajustes de fluoróforo adecuado.
    Nota: por ejemplo detectar Cy5 etiquetado ADN, imagen con 633 nm excitación y filtros de emisión de 670 nm. Productos de integración concertada (CI, ADN lineal) deben ejecutar tallaje a ~ 3 kb plásmido superenrollado (SC) debe correr más rápido (~ 2 kb) y productos de integración de media página (HSI, círculo relajado DNA) deben ejecutar más lento (~3.5 kb). VDNA debe ejecutarse tallaje en ~ 40 bp.
  8. Cuantificar las bandas en cada carril con proyección de imagen de software7. Calcular la fracción de ADN en cada carril CI, HSI o SC; vDNA no está incluido en este cálculo.
    Nota: Eficiencia de la integración o la fracción de SC convertida en un producto lineal, se calculó dividiendo el volumen de píxeles de productos de integración concertada (IC) por el volumen total de píxeles de tres bandas (HSI + CI + SC). Si intasomes son fluoróforo con la etiqueta, los productos de HSI y CI pueden cuantificarse por fluorescencia.
  9. Seleccione fracciones que tienen la actividad de integración más concertada.
    Nota: En nuestra experiencia, la actividad de integración concertada de pico coincide con el pico de la proteína identificado como intasomes PFV tetramérica. Mida A280 de cada una de estas fracciones y calcular la concentración final de intasome. Ε280 por un tetrámero de tipo salvaje en PFV con dos vDNAs descrito aquí es 908.339 cm-1M-1 y el peso molecular es 225,5 kDa. Las concentraciones deben seguir el mismo patrón como el pico del cromatograma de SEC y en el análisis de transferencia de cadena.
  10. Distribuir cada fracción en 5 alícuotas μl y snap congelar en nitrógeno líquido. Guardar alícuotas a-80 ° c. Fracciones seleccionadas para el almacenamiento son típicamente entre 200-600 nM.

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Resultados

Intasomes PFV son ensamblados de IN recombinante y vDNA. Después del montaje, intasomes son purificadas por segundos (figura 1). Actividad de integración de cada fracción se ensayaron con un superenrollado ADN blanco y agarosa electroforesis en gel (figura 2). Este gel es reflejado con un analizador fluorescente para detectar EtBr (y fluoróforo, si se utiliza el fluoróforo vDNA). Usando software de análisis de imagen, volúmenes d...

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Discusión

Retroviral INs forman un complejo con DNA genómica viral para realizar integración y continuar el ciclo de vida viral multimérica. El número de monómeros por intasome puede ser tetrámeros, octamers o posiblemente mayor orden Multímeros11,12,13,14. Intasomes PFV son un tetrámero de recombinante con oligómeros de ADN bicatenario que imitan la DNA genomic viral termina3...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por NIH AI099854 y AI126742 a la clave.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Oligómeros de ADNIDT N/AOligos de ADN personalizados
Tris Ultra PureGojira Fine ChemicalsUTS1003
NaClP212121 RP-S23020
UltraPure EDTAInvitrogen/Gibco15575
Amicon Ultra 0.5 mL filtros centrífugosSigma-AldrichZ677094-24EA3 kDa MWCO
TDTP212121propano SV-DTT
BIS-TRIS, >=99,0% (valoración)Sigma-AldrichB6755-500G
ZnCl2Sigma-Aldrich208086
MgSO4Amresco0662
GlycerolThermo Fisher ScientificG37-20
Puntas de carga de gel, 1 - 200 μ LCorningCLS4853-400EA
Hoja de afeitar; De un solo filo; 100/paquete; Paquete de 100 unidades deestériles Fisher Scientific12-640
con membrana PES > 250 mlThermo Fisher Scientific568-0020
Pinzas para tubos de diálisisSpectrum Labs132734
6-8 kDa 10 mm Tubo de diálisisSpectrum Medical132645
Superose 6 10/300 GLGE Healthcare Ciencias de la Vida 17517201
Estándar de alta resolución AgarosaAGTC BioproductsAG500D1
Bromuro de etidioThermo Fisher ScientificBP1302
Naranja GFisher Scientific 0-267
Hyladder 10kb, 500 carrilesDenville ScientificCB4225-4
filtro desechables

Referencias

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