Aquí, presentamos un protocolo para determinar la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón crudo usando MALDI-TOF espectrometría de extractos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Los extractos de la determinación de la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón por espectrometría de masas MALDI-TOF: manipulando PH para causar cambios de la especificidad
En este artículo
Resumen
Resumen
Las proteasas tienen varias funciones biológicas, incluyendo digestión de comida y la activación/inactivación de proteínas. Identificar la especificidad de la proteasa es importante para revelar la función de la proteasa. El método propuesto en este estudio determina la especificidad de la proteasa midiendo el peso molecular de sustratos únicos mediante desorción/ionización del Laser asistida por matriz de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF). Los sustratos contienen iminobiotin, mientras que el sitio hendido consiste en aminoácidos, y consiste en el separador de glicol de polietileno. El sustrato exfoliado generará un único peso molecular utilizando un aminoácido exfoliado. Uno de los méritos de este método es que se puede llevar a cabo en una maceta utilizando muestras de crudo, y también es adecuado para evaluar las muestras múltiples. En este artículo, describimos un método experimental sencillo optimizado con muestras extraídas de tejido de pulmón de ratón, incluyendo extracción de tejido, colocación de sustratos digestivos en muestras, depuración de digestivos sustratos bajo condiciones de pH diferentes y la medición del peso molecular de los sustratos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. En Resumen, esta técnica permite la identificación de la especificidad de la proteasa en muestras de crudo derivados de extractos de tejidos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, que puede fácilmente ampliarse para el procesamiento de las muestras múltiples.
Introducción
Proteasas regulan procesos fisiológicos por unirse a las proteínas, y el inicio de la actividad de la proteasa en momentos concretos y lugares es regulada1. Por lo tanto es importante identificar la expresión y actividad de los tejidos que están reguladas localmente y para desarrollar un nuevo método para detectar las proteasas. El método propuesto en este estudio tiene como objetivo identificar la especificidad de la proteasa en paralelo a la detección de las proteasas.
Existen algunos métodos para detectar la especificidad de la proteasa. El método de azocasein es bien sabido para su uso en la detección de las prot....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Protocolos experimentales animales fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad de Nihon en industria farmacéutica y a cabo conforme a las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la Universidad de Nihon Pharmaceutical. El protocolo ha sido ajustado para los extractos de tejidos derivados de ratones ICR. Ratones ICR fueron comprados de Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japón)
1. preparación del sustrato marcado con Iminobiotin
El sustrato pasa por síntesis en fase sólida usando grupo 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-protegidas aminoácidos como se describe a continuación
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Evaluación del método para la identificación de la especificidad de la proteasa por proteasa de modelo
Se evaluó la eficacia de este sistema utilizando TPCK-tripsina y proteasa V8, cuyas especificidades de sustrato se obtuvieron. Se estimaron TPCK-tripsina y proteasa V8 hender la secuencia de aminoácidos en el c-terminal de los residuos de lisina y arginina y en el lado carboxilo del ácido aspártico y residuos de ácido glutámico, r.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo utiliza la espectrometría de masas MALDI-TOF para identificar la especificidad de la proteasa en muestras de crudo derivados de extractos de tejido y puede fácilmente ampliarse para el procesamiento de las muestras múltiples. En particular, manipulamos pH para causar un cambio en la especificidad de sustrato.
Se utilizó el método de (ABC) complejo avidina-biotina, que ha sido ampliamente utilizado en Bioquímica debido a su especificidad de Unión, en nuestro protocolo. Debido a l.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por la beca de investigación Universidad Farmacéutica Nihon Nihon Pharmaceutical University (2016) y el MEXT KAKENHI concesión número JP17854179.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Resina Fmoc-NH-SAL (-[2,4-dimetoxifenil-N-(9-fluorenilmetoxicarbonilo) aminometil]fenoxiresina) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimetilformamida (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidina | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-hexafluorofosfato de tetrametiluronio (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-hidroxi-1H-benzotriazol, monohidrato (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropiletilamina (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropilsilano (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| ácido trifluoroacético (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrilo | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 columna de cartucho Waters | WAT051910 | ||
| éter de poli(oxietileno) octilfenilo | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| homogeneizador de mezcla | Kinematica | PT3100 | homogeneizador de polytron |
| Coomassie Azul Brillante (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glicerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosil-L-fenilalanina clorometilcetona (TPCK)-tripsina | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimetilsulfóxido (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| estreptavidina sefarosa | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-ácido ciano-4-hidroxicinámico (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| Espectrometría de masas MALDI-TOF | Bruker Daltonics, Alemania | autoflex | |
| 2-iminobiotina | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-aminoácidos | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
Referencias
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vop....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
