Artículo de método

La secuencia retrospectiva MicroRNA: ADN complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de ARN de parafina-encajado formalina-fijo

DOI:

10.3791/57471

⸱

5 de mayo de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Research, Hackensack University Medical Center, 2Department of Medical Sciences, Seton Hall University, 3Department of Epidemiology and Population Health, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Nephrology and Hypertension, Hadassah - Hebrew University Medical Center

En este artículo

Resumen

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Muestras de parafina-encajado formalina-fijos representan una valiosa fuente de biomarcadores moleculares de las enfermedades humanas. Aquí presentamos un protocolo de preparación Biblioteca de cDNA en laboratorio, inicialmente diseñado con ARN congelado fresco y optimizado para el análisis de los microRNAs de tejidos almacenan hasta 35 años.

Resumen

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– Archivar, clasificar clínicamente formalina-fijo tejidos parafina-encajados de (FFPE) pueden prever ácidos nucleicos estudios moleculares del desarrollo del cáncer. Mediante el uso de no-invasiva lesiones malignas o premalignas en pacientes que posteriormente desarrollan enfermedad invasiva, análisis de expresión génica podrán ayudar a identificar alteraciones moleculares tempranas que predisponen al riesgo de cáncer. Se ha descrito también que los ácidos nucleicos de los tejidos FFPE han sufrido graves daños y modificaciones químicas, que dificultan su análisis y generalmente requiere ensayos adaptados. MicroRNAs (miRNAs), sin embargo, que representan una pequeña clase de moléculas de ARN que abarca sólo a ~ 18-24 nucleótidos, se han demostrado para soportar el almacenamiento a largo plazo y se han analizado con éxito en muestras FFPE. Aquí presentamos un 3' con código de barras ADN (cDNA) Biblioteca preparación Protocolo complementario específicamente optimizado para el análisis de small RNAs extraído de tejidos archivados, que recientemente fue demostrado para ser robusto y altamente reproducible cuando uso de archivada especímenes clínicos almacenados hasta por 35 años. Esta preparación de biblioteca se adapta bien al análisis multiplex de material comprometido/degradados donde las muestras de RNA (hasta 18) ligadas con los adaptadores de código de barras individual de 3' y entonces agruparon para posteriores preparaciones enzimáticas y bioquímicas antes del análisis. Se realizan purificaciones todos por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), que permite selecciones específicas de tamaño y riquezas de especies pequeñas de RNA con código de barras. Esta preparación de la biblioteca de cDNA se adapta bien a minuto entradas de RNA, como una reacción en cadena de piloto de la polimerasa (PCR) permite la determinación de un ciclo de amplificación específica para producir cantidades óptimas de material para la secuenciación de próxima generación (NGS). Este enfoque se ha optimizado para el uso de degradados de FFPE de ARN de muestras archivadas de hasta 35 años y proporciona datos NGS altamente reproducibles.

Introducción

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miRNAs son notablemente bien conservadas en formalina-fijo parafina-encajado (FFPE) muestras1,2,3. Trabajo previo ha demostrado que la expresión de estos cortos no codificantes solo trenzado RNA moléculas reguladoras puede ser evaluado con éxito utilizando ARN total de las muestras FFPE y proporcionar datos de expresión de genes relevantes en comparación con el fresco original los tejidos4,5,6,7,8. En comparación c....

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Protocolo

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1. preparación de los reactivos e imprimaciones

  1. Ordenar todos los cebadores y adaptadores como se describe en la figura 1.
  2. Preparar el calibrador stock cóctel, que se enriquecieron en la ligadura de cada individuo.
    1. Resuspender el oligonucleótido portador (figura 1) a 0,5 μm con agua libre de ARNasa. Resuspender los oligonucleótidos calibrador 10 (figura 1) a 100 μm usando la solución de oligonucleótidos 0,5 μm portador.
    2. Combinar 10 μl de cada uno de los 10 calibradores en una microcentrífuga siliconado para obtener un sto....

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Resultados

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Como se describe en el método, un total de 18 muestras individuales de ARN FFPE (100 ng cada) se colocan en tubos separados a 3' adenylated con código de barras del oligonucleótido T4 la ligadura durante la noche. Al día siguiente, las reacciones enzimáticas son desactivados por calor combinadas y precipitadas en un solo tubo. Se resuspendió el pellet de RNA y las moléculas de ARN ligadas están separadas en un gel de poliacrilamida (PAGE), donde se utilizan marcadores de RNA del oligonucl.......

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Discusión

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Un protocolo de preparación de biblioteca de cDNA altamente reproducible y robusto para NGS de small RNAs en muestras de ARN FFPE se presenta en el presente Protocolo, que es una versión modificada y optimizada del procedimiento descrito por Hafner et al. 22

Todos los pasos de este protocolo han sido optimizados para el uso con mayores archivado y comprometido ARN total recuperado de muestras FFPE. El paso fundamental de este protocolo, para el procesamiento de.......

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Divulgaciones

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Los autores desean revelar que una publicación que contiene algunos de los datos presentados en este manuscrito fue publicada en la revista internacional de Ciencias moleculares por Loudig et al. 21.

Agradecimientos

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Agradecemos al Dr. Thomas Tuschl, jefe del laboratorio de biología molecular de RNA, así como los miembros de su laboratorio por su apoyo y por compartir la tecnología desarrollada en su laboratorio, proporcionando acceso a la tubería de RNAworld. También agradecemos a Dr. Markus Hafner para compartir su Protocolo y proporcionar descripciones detalladas sobre todos los pasos bioquímicos y enzimáticos utilizados en su procedimiento inicial.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1% Triton x-100InvitrogenHFH10
10mMATP AmbionAM8110G
10X dNTPsAmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14M MercaptoethanolSigmaO3445I-100
escalera de 20 ntJena BioscienceM-232S
20mg/ml Albúmina sérica bovinaSigmaB8894-5ML
50X Taq de titanioLaboratorios Clontech
FisherScientific7727-54-0
BRL Sistema de electroforesis de gel vertical con placas y peines de vidrioGIBCOV16
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD9170-5VL
Microcentrífuga Eppendorf 5424REE. UU. científica4054-4537Q
Eppndorf ThermomixerEE. UU. científica4053-8223Q
Fisherbrand™ Tubos de microcentrífuga siliconados de baja retención 1,5 mlFisher Scientific02-681-320
Tubo rompedor de gel 0,5 mlIST Engineering Inc,3388-100
Aparato de electroforesis en gel 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT con bandejas de gel y peinesBiorad
GlycoblueAmbionAM9516
Jersey-CoteLabScientific, Inc1188
KcL 2MAmbionAM9640G
MgCl2 1MAmbionAM9530G
Minifuge centrífuga personal de doble rotorUSA scientific2641-0016
Modelo V16 Aparato de electroforesis en gel de poliacrilamida, gafas, peines y espaciadoresCiore Life Science21070010
OligonucleótidosIDT Definido durante el pedido
Owl EasyCast B2 mini sistema de electroforesis- con bandejas de gel y peines ThermofisherScientificB2
Qiaquick Kit de extracción de gelQiagen28704
Enzima de restricción PmeINEBR0560S
Agua libre de ARNasaAmbionAM9932
Safe Imager 2.0Life TechnologiesG6600
Safe Imager 2.0 transiluminador de luz azulThermofisherG6600
SeaKem LE agarosaLonza50002
Superscript III kit de transcripción inversaInvitrogen18080-044
SybrGoldLife TechnologiesS11494
T4 ARN ligasa 1NEBM0204S
T4 ARN ligasa 2 Truncado K227QNEB0351L
TEMEDFisher ScientificO3446I-100
Themocycler con tapa calefactadaBiosystem aplicado4359659
Tris 1M pH 7.5Invitrogen15567027
Tris 1M pH8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sistema Sequagel concentrado, diluyente y tampónNacional DiagnósticoEC-833
Persulfato de amonio 639208 1704446

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
  2. Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D.

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