Artículo de método

CARIP-Seq y ChIP-Seq: métodos para identificar cromatina asociada RNAs y las interacciones DNA proteína en las células madre embrionarias

DOI:

10.3791/57481

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25 de mayo de 2018

1Department of Oncology, Wayne State University School of Medicine, 2Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Aquí, describimos los métodos para realizar ChIP-Seq y mapas de CARIP-Seq, incluyendo preparación de biblioteca para secuenciación de próxima generación, generar global epigenómica y RNA asociada a la cromatina en células madre embrionarias.

Resumen

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Auto-renovación de células madre embrionarias (ES) y diferenciación se rige por señales extrínsecas e intrínsecas redes de factores de transcripción, reguladores epigenéticos y traducción posteriores modificaciones de las histonas que influyen combinatorially en el gene Estado de expresión de los genes cercanos. RNA se ha demostrado también al interactuar con diversas proteínas para regular la dinámica de la cromatina y expresión génica. Asociada a la cromatina RNA inmunoprecipitación (CARIP) seguida por secuenciación de próxima generación (CARIP-Seq) es un método novedoso para la encuesta de ARN asociado a proteínas de cromatina, mientras que de inmunoprecipitación de cromatina, seguida por secuenciación de próxima generación ( ChIP-Seq) es una técnica poderosa genómica para asignar la ubicación de modificaciones post-traduccionales de las histonas, factores de transcripción y epigenéticos modificadores a escala mundial en células madre embrionarias. Aquí, describimos los métodos para realizar CARIP-Seq y ChIP-Seq, incluyendo la construcción de la biblioteca para secuenciación de próxima generación, para generar ARN cromatina asociado global y mapas epigenómicos en células madre embrionarias.

Introducción

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Las decisiones de destino de células madre embrionarias (ES) son reguladas por la comunicación entre las señales extracelulares y un anfitrión de transcripcional reguladores, como modificadores de histonas, modificación post traducción de colas de las histonas. Estas interacciones facilitan la accesibilidad de la cromatina y empaquetado de la cromatina en uno de dos Estados: eucromatina, que es abierto y transcripcionalmente activo, y la heterocromatina, que es compacto y generalmente transcripcionalmente inactiva. Factores de transcripción con afinidades de unión de la secuencia específica de ADN y modificadores epigenéticos asociados con regiones euchromatic para pa....

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Protocolo

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1. cultura de ES de ratón células en condiciones libres de alimentador.

Nota: Las células de ratón ES convencionalmente son cultivadas en medios de comunicación en una placa de cultivo celular recubierta de gelatina y una mono capa de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), que han sido inactivados mitotically (iMEFs). Sin embargo, MEFs deben eliminarse antes de abajo análisis epigenéticos o expresión para evitar la contaminación de la cromatina asociados por el MEF y el ARN.

  1. Preparación de una capa de alimentador: gelatina cubra una placa de cultivo celular 6-bien mediante la adición de 2 mL de 0.1% de gelatina en agua e incuba....

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Resultados

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Nos interrogó con éxito la Unión de todo el genoma de H3K4me3, H3K4me2 y KDM5B en células madre embrionarias usando este ChIP-Seq protocolo6. Células madre embrionarias fueron cultivados en condiciones libres de alimentación (figura 1) y reticulado como se describió anteriormente. Sonicación fue posteriormente realizado como se describe en el paso 3.2 del protocolo ChIP-Seq y evaluada mediante la ejecución de DNA en gel de agarosa al 2.......

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Discusión

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ChIP-Seq es un método útil para evaluar la situación de las interacciones proteína-ADN global (por ej., factores de transcripción/histona modificación de enzimas/histona modificaciones y ADN) en células madre embrionarias, mientras que el nuevo protocolo de CARIP-Seq es útil en interrogatorio de Asociación de genoma de ARN con los componentes de la cromatina. ChIP-Seq es una herramienta fundamental que se utiliza para evaluar paisaje epigenético de células madre embrionarias y otros tipos de células. La calidad .......

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Divulgaciones

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Los autores no declaran conflicto de intereses.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por Wayne estado Universidad, Karmanos Cancer Institute, una beca de la National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01A1) a B.L.K. Este trabajo utiliza el Wayne estado Universidad alto rendimiento Computación Grid de recursos computacionales (< https://www.grid.wayne.edu/>). Agradecemos Jiji Kurup ayuda con análisis de datos de CARIP-Seq.

CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES:

B.L.K. concibió el método de CARIP-Seq, diseñado y llevado a cabo los experimentos de ChIP-Seq y CARIP-Seq, analizó los datos de secuenciación y redactó el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado la versi....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Factor inhibidor de la leucemia en ratón (ESGRO LIF)EMD Millipore106 o 107 units
GSK3β inhibidor CHIR99021 (GSK3i)Disolvente derivante: DMSO 10mM
Inhibidor de MEK PD0325901 (MEKi)Disolvente derivante: DMSO 10mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto contenido de glucosaInvitrogen11965092
PBS (solución salina tamponada con fosfato)Invitrogen10010031
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo de fenolGibco25200056
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140122
2-Mercaptoetanol (50 mM)Gibco31350010
MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X)Gibco11140076
EmbryoMax ES Suero Fetal Bovino Calificado para Células, 500 mlEMD MilliporeES-009-B
EmbryoMax 0.1% Solución de GelatinaEMD MilliporeES-006-B
GlycineSigmaG7126-500G1.25 M caldo de conentración en agua
Solución de formaldehídoSigmaF8775-500ML
TE (Tris EDTA) pH 8.0 1XCalidad Biológico351-011-131
Solución de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF)Sigma93482-250ML-F
cOmplete Cóctel de inhibidores de proteasaRoche11697498001
Solución de dodecil sulfato de sodio (20%)Calidad BiológicoA611-0837-10
Q125 sonificador Qsonica4422
Triton X-100 soluciónSigma93443-100ML
Desoxicolato de sodioSigma30970
NaClSigmaS7653
Dynabeads Proteína G para inmunoprecipitaciónInvitrogen10004D
Dynabeads Proteína A para inmunoprecipitaciónInvitrogen10002D
Dynabeads Proteína A/Proteína G y Paquete de inicio de imanesInvitrogen10015D
Cloruro de litioSigmaL4408
IGEPAL CA-630SigmaI8896
RNeasy Mini KitQiagen74104
Dynabeads Kit de purificación de ARNm (para la purificación de ARNm a partir de preparaciones totales de ARN)Invitrogen61006
SuperScript Síntesis de ADNc de doble cadena KitInvitrogen11917010
QIAquick PCR Kit de purificaciónQiagen28104
End-It DNA End-Repair KitLucigenER81050
Klenow Fragment (3'→ 5' exo-)NEBM0212L
dATP (10 mM)Invitrogen18252015
T4 ADN ligasaNEBM0202L
TrackIt 1 Kb Plus DNA LadderInvitrogen10488085
E-gel EX geles de agarosa, 2%InvitrogenG402002
Phusion mezcla maestra 2X de alta fidelidad con tampón HFThermo Fisher
ChIPAb+ Trimetil-Histona H3 (Lys4) - Anticuerpo validado por ChIPEMD Millipore17-614
Anti-histona H3 (di metil K4) anticuerpo [Y47] - Grado ChIP (ab32356)Abcamab32356
Corning Costar Placas de cultivo celular de fondo plano (6 pocillos)Fisher720083
Falcon Placas de cultivo de tejidos estándar (10 cm)Fisher08772E
Bioruptor picoDiagenodeB01010001
Qubit Flurometer 2.0Thermo Fisher
Qubit dsDNA HS Kit de ensayoThermo FisherQ32851
MinElute Reaction Cleanup KitQiagen28204
MinElute Kit de extracción de gelQiagen28604
Anti-histona H4 (tri metilo K20) anticuerpo - Grado ChIP (ab9053)Abcamab9053
Rotador LabquakeThermo Fisher400110Q
Illumina Plataforma HiSeqIllumina
TURBO DNaseInvitrogenAM2238
F531LPM

Referencias

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  1. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  2. Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells....

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Etiquetas

Inmunoprecipitaci n de la cromatinasecuenciaci n de nueva generaci nmodificaciones de las histonasfactores de transcripci nreguladores epigen ticos

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