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Artículo de método

CARIP-Seq y ChIP-Seq: métodos para identificar cromatina asociada RNAs y las interacciones DNA proteína en las células madre embrionarias

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DOI:

10.3791/57481

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25 de mayo de 2018

1Department of Oncology, Wayne State University School of Medicine, 2Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos los métodos para realizar ChIP-Seq y mapas de CARIP-Seq, incluyendo preparación de biblioteca para secuenciación de próxima generación, generar global epigenómica y RNA asociada a la cromatina en células madre embrionarias.

Resumen

Auto-renovación de células madre embrionarias (ES) y diferenciación se rige por señales extrínsecas e intrínsecas redes de factores de transcripción, reguladores epigenéticos y traducción posteriores modificaciones de las histonas que influyen combinatorially en el gene Estado de expresión de los genes cercanos. RNA se ha demostrado también al interactuar con diversas proteínas para regular la dinámica de la cromatina y expresión génica. Asociada a la cromatina RNA inmunoprecipitación (CARIP) seguida por secuenciación de próxima generación (CARIP-Seq) es un método novedoso para la encuesta de ARN asociado a proteínas de cromatina, mientras que de inmunoprecipitación de cromatina, seguida por secuenciación de próxima generación ( ChIP-Seq) es una técnica poderosa genómica para asignar la ubicación de modificaciones post-traduccionales de las histonas, factores de transcripción y epigenéticos modificadores a escala mundial en células madre embrionarias. Aquí, describimos los métodos para realizar CARIP-Seq y ChIP-Seq, incluyendo la construcción de la biblioteca para secuenciación de próxima generación, para generar ARN cromatina asociado global y mapas epigenómicos en células madre embrionarias.

Introducción

Las decisiones de destino de células madre embrionarias (ES) son reguladas por la comunicación entre las señales extracelulares y un anfitrión de transcripcional reguladores, como modificadores de histonas, modificación post traducción de colas de las histonas. Estas interacciones facilitan la accesibilidad de la cromatina y empaquetado de la cromatina en uno de dos Estados: eucromatina, que es abierto y transcripcionalmente activo, y la heterocromatina, que es compacto y generalmente transcripcionalmente inactiva. Factores de transcripción con afinidades de unión de la secuencia específica de ADN y modificadores epigenéticos asociados con regiones euchromatic para participar en el control de la expresión génica. Métodos de secuenciación de próxima generación, incluyendo ChIP-Seq1, han sido fundamentales en la asignación de redes transcripcionales del genoma que son fundamentales para ES celular auto renovación y pluripotencia2,3,4 ,5,6. Por otra parte, mientras que immunopreciation RNA seguido por generación de secuenciación (RIP-Seq)7 las evaluaciones de las interacciones RNA-proteína sugieren que proteínas ADN interactuarán con RNAs regulación transcripcional eventos7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, pocos estudios han investigado la localización de todo el genoma de ARN asociado con cromatina12o interacciones globales entre el ARN y la histona modificación. ARN largo no codificante (lncRNAs) es una clase de RNAs que se han encontrado para regular la actividad de las proteínas asociadas a cromatina13,14,15. Por ejemplo, Xist es un lncRNA que regula, en células de mamífero femenino, la inactivación de un cromosoma de X, a través de la contratación de represores epigenéticos16,17. Sin embargo, el espectro completo de RNAs asociados con cromatina es desconocido. Aquí, describimos un protocolo nuevo, asociada a la cromatina RNA inmunoprecipitación (CARIP) seguida por secuenciación de próxima generación (CARIP-Seq), para identificar ARN cromatina asociados sobre una base de todo el genoma en células madre embrionarias, incluyendo preparación de biblioteca para secuenciación de próxima generación y ChIP-Seq mapa ocupación global de modificaciones de las histonas, factores de transcripción y modificadores de la epigenéticos. A diferencia de otros métodos de RIP-Seq7, CARIP-Seq incluye pasos de reticulación y sonicación, que permiten la identificación directa de ARN asociada a la cromatina. Juntos, ChIP-Seq es una poderosa herramienta para identificar las interacciones de la proteína del genoma-ADN, mientras que CARIP-Seq es un método poderoso para RNAs asociados con componentes de la cromatina.

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Protocolo

1. cultura de ES de ratón células en condiciones libres de alimentador.

Nota: Las células de ratón ES convencionalmente son cultivadas en medios de comunicación en una placa de cultivo celular recubierta de gelatina y una mono capa de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), que han sido inactivados mitotically (iMEFs). Sin embargo, MEFs deben eliminarse antes de abajo análisis epigenéticos o expresión para evitar la contaminación de la cromatina asociados por el MEF y el ARN.

  1. Preparación de una capa de alimentador: gelatina cubra una placa de cultivo celular 6-bien mediante la adición de 2 mL de 0.1% de gelatina en agua e incubar la placa a 37 ° C durante 20-30 minutos.
  2. Preparación de medios de alta glucosa 10% DMEM que contenía 2 mM L-glutamina, 10% suero bovino fetal (FBS) y 1 x penicilina/estreptomicina.
  3. Aislar la MEFs de E13.5 E14.5 ratones18,19 o adquirir de un vendedor comercial. Inactive mitotically MEFs por tratamiento con mitomicina C o irradiación gamma utilizando protocolos estándar19. Por otra parte, mitotically inactivado MEFs (iMEFs) pueden ser adquiridos de un vendedor comercial.
  4. Cultivo de MEFs. Caliente previamente la media de la MEF a 37 ° C, descongelar vial congelado de iMEFs y cultura en 10% los medios de comunicación FBS MEF a 37 ° C con 5% CO2. Placa de MEFs en el ~ 200.000 células por pocillo de una placa de cultivo de 6 pozos.
  5. Cultivo de células madre embrionarias en una capa de células de alimentador (iMEFs).
    1. 12-24 h después de la iMEFs, la galjanoplastia caliente previamente un tubo de 50 mL de medios de comunicación de la célula ES (DMEM alta glucosa, LIF (10 ng/mL), 15% ES calificado de célula FBS, calificado de cultivo de células de 1 × 2-Mercaptoetanol, 1 × glutamina, aminoácidos no esenciales (AANE), 1 × penicilina/estreptomicina), a 37 ° C con 5% CO2.
    2. Aspire los medios de comunicación de las placas de cultivo celular que contiene iMEFs, Resuspenda las células madre embrionarias en 2 mL de medio (después de la descongelación a 37 º C) y las células de la capa de iMEFs de la placa. Al colocar la placa de cultivo en la incubadora, es importante mover el plato en forma de "t" para distribuir las células y a prevenir la agregación hacia el centro del plato.
  6. Paso de las células madre embrionarias en platos libres de alimentador cubierto de gelatina. Paso de las células madre embrionarias antes de que sean confluentes. Colonias de células ES mantienen la auto renovación mejor si las colonias son uniformemente espaciados y no confluentes. La presencia de muchas colonias de células ES que están tocando indica que la densidad celular es demasiado alta.
    1. Cubrir una placa de cultivo de 6 pocillos con gelatina como se describió anteriormente. Incubar 0.25% tripsina-EDTA a 37 ° C por aproximadamente 10-15 minutos de precalentamiento tripsina.
    2. Paso a continuación, las células madre embrionarias primer lavado con 1 x de tampón fosfato salino (PBS) y añadiendo 1 mL de solución al 0.25% tripsina-EDTA. Esperar 1-2 min para las colonias separar. Disociar las colonias a una suspensión unicelular mediante pipeteo con una punta de 1 mL para ~ 5 veces.
    3. Utilice un microscopio para confirmar la disociación de la célula de las células madre embrionarias. Para calmar la reacción, o para "neutralizar" la tripsina, añadir media de 10% FBS MEF. Centrifugar las células a 300 x g a temperatura ambiente durante 3-5 min y aspire los medios de comunicación.
    4. Resuspenda el sedimento celular en 2 mL de medio (células ES) complementado con inhibidor de glicógeno sintasa quinasa 3 (GSK3) (CHIR99021; GSK3i), o 2i (MEKi/GSK3i) las condiciones (2-3 μm GSK3i: CHIR99021, 1 μm MEKi: PD0325901).
    5. Aspirar la gelatina de la placa de cultivo celular, agregar 2 mL de medio conteniendo CES al plato y coloque el plato en la incubadora de 37 ° C (figura 1A-D). Inhibición dual de GSK3i y MEKi promueve estado ingenuo pluripotencia de células madre embrionarias en ausencia de células de alimentador (iMEFs) y sin suero20. Células madre embrionarias deben ser los dos a tres veces para quitar MEFs antes de proceder a la reticulación.

2. entrecruzamiento de ES Cells ChIP y CARIP

  1. Cosechar las células madre embrionarias por lavado con PBS, luego agregar 0.25% tripsina calentado previamente a 37 ° C. Incube las células durante varios minutos a temperatura ambiente. No tripsinización de células madre embrionarias, que conducirá a la muerte celular. Utilice un microscopio para evaluar disociación unicelular.
  2. Calmar la digestión tripsina como se describió anteriormente para pases de células madre embrionarias y centrifugar las células a 300 x g a temperatura ambiente durante 3-5 minutos.
  3. Resuspenda las células en medios de comunicación MEF precalentado (37 ° C) (10% FBS/DMEM) 2 × 106 células/ml.
  4. Para reticular las células, Agregar solución de formaldehído 37% a una concentración final de 1% e incubar las células en un tubo cónico (15 mL o 50 mL) a 37 ° C por 8 minutos invertir el tubo varias veces durante el período de 8 minutos para lograr la fijación homogénea.
    Nota: El tiempo de fijación puede ser empíricamente optimizado de CARIP. Si se altera el tiempo de fijación, también se debe ajustar el número de ciclos de sonicación. También, la temperatura de 37 ° C aumenta la eficiencia de la reticulación en comparación con el cura a temperatura ambiente. La temperatura de fijación puede optimizarse empíricamente.
  5. Para detener la reacción de fijación, agregar 1,25 M glicina (previamente enfriada a 4 ° C) a una concentración de 0,125 M. invertir el tubo a 8 rpm usando un agitador durante 5 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar la muestra a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar los medios de comunicación.
  6. Lavar el precipitado de células con PBS previamente refrigerada (4 ° C), centrifugar la muestra a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar PBS. Lavar las células con PBS otra vez. A continuación, alícuota 15 × 106 células por tubo de 15 mL.
  7. Congelar el precipitado de células colocando en nitrógeno líquido durante 1 minuto, en hielo seco durante 5 minutos, o poner inmediatamente a-80 ° C.
    Nota: ES fijo celular pellets pueden almacenarse por hasta 6 meses sin disminución calidad en experimentos posteriores.

3. sonicación cromatina ChIP y CARIP

  1. Descongelar el precipitado de células ES fijo en el hielo. Resuspenda el precipitado de células en tampón de sonicación (2,5 mL). Para factores de transcripción o reguladores epigenéticos (Factores proteicos), vuelva a suspender el sedimento en TE 1 x, 1 mM PMSF, 1 x inhibidor de la proteinasa cóctel. Para modificaciones de las histonas, vuelva a suspender el sedimento en 1 x TE, 0.1% SDS, 1 mM PMSF, inhibidor de la proteinasa de 1 x.
    Nota: Mientras que la adición de SDS mejora la eficiencia de la sonicación, puede no ser beneficioso para la evaluación de ciertos componentes de la cromatina o factores de transcripción.
  2. Someter a ultrasonidos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), cromatina con ciclos de 14-18 (30 s en 30 resto de s) en amplitud 40%. Para cromatina asociado RNA inmunoprecipitación (CARIP), reducir el número de ciclos de sonicación (8-10 ciclos). Celular, la fijación y variabilidad sonifier, condiciones para la sonicación deben determinarse empíricamente.
  3. Suplemento el búfer de sonicación con 28 μl de SDS 10% por factores proteicos, 28 μl de desoxicolato de sodio y 0,28 mL de 10% Triton-X100 y mezclar bien.
    Nota: Además de estos componentes en el búfer de sonicación genera almacenador intermediario RIPA.
  4. Centrifugar la muestra a 10.000 x g por 10 min a 4 ° C para eliminar previamente la cromatina. Trasladar el sobrenadante a un tubo nuevo y proceder a inmunoprecipitación de cromatina.
  5. Como alternativa, cromatina sonicación puede almacenarse a-80 ° C hasta su uso. Sin embargo, el almacenamiento de la cromatina sonicado a-80 ° C puede llevar a disminución de la calidad para ChIP de proteína-factor.

4. chIP y proceso CARIP

  1. Agregar 40 μl de proteína A o G de perlas magnéticas a un 1,5 mL, tubo de baja obligatoria. Añadir 600 μl de PBS para lavar los granos. Coloque el tubo en un rack que contiene un imán, incubar el tubo durante 1 min a temperatura ambiente, quitar PBS y vuelva a suspender las bolas magnéticas en 100 μl de PBS.
  2. Añadir 2-4 μg de anticuerpo al tubo con granos magnéticos. Incubar y gire el tubo a temperatura ambiente durante 40 min a 8 rpm usando un agitador para facilitar la Unión de anticuerpos a las bolas magnéticas. Inserte el tubo sobre la rejilla magnética, incubar durante 1 min a temperatura ambiente y luego retire PBS.
  3. Añadir 200 μL de PBS para lavar las bolas magnéticas. Se realiza lavado con PBS para eliminar depósitos gratis. Incubar y gire el tubo a temperatura ambiente durante 5 minutos entre pasos de lavado. Conecte el tubo al imán y retirar el PBS.
  4. Immunoprecipitate proteínas de cromatina-limite por incubando la cromatina sonicación extracción (4 × 106 células por ChIP), con las bolas magnéticas y giran la muestra a 4 ° C (noche).
  5. Lavar las bolas magnéticas. Incubar la muestra a temperatura ambiente con los siguientes buffers y rotar la muestra durante 10 min con cada tampón: dos veces con 1 mL de tampón RIPA (pH de TE (10 mM Tric-HCl, 1 mM EDTA) 8.0, 1% Tritón X-100, deocycholate de sodio 0.1%, 0.1% SDS), dos veces con 1 mL de RIPA buffer c ontaining 0,3 M NaCl, dos veces con 1 mL de tampón de LiCl (0.5% sodio deocycholate, 0.5% NP40, 0.25 M LiCl), una vez con 1 mL de TE del almacenador intermediario con 0,2% Tritón X-100 y una vez con 1 mL de TE.
  6. De-reticulación para ChIP. Vuelva a suspender las bolas magnéticas en 100 μl de TE. Agregar 3 μl de SDS 10% y 5 μl de proteinasa K (20 mg/mL). Incubar la muestra a 65 ° C (noche).
    Nota: Es importante cubrir los tubos durante este paso con parafilm o envoltura de plástico para evitar la evaporación.
    1. Al día siguiente, invertir el tubo varias veces para mezclar. A continuación, use la parrilla de imán para transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Para lavar las bolas magnéticas, añada 100 μl de TE que contiene 0.5 M NaCl y posteriormente se combinan los dos sobrenadantes.
  7. De-reticulación de CARIP. Vuelva a suspender las bolas magnéticas en 100 μl de TE. Agregar 3 μl de SDS 10% y 5 μl de proteinasa K (20 mg/mL). Incubar la muestra a 65 ° C durante 4 a 12 h. incubación hora a 65 ° C debe ser determinado empíricamente debido a la variabilidad entre los tipos de células, sonicación y fijación de las condiciones, etcetera.
    1. Invertir el tubo de 3 - 5 veces para mezclar, aplicar el tubo a la rejilla magnética y posteriormente pasar el sobrenadante a un tubo nuevo.
    2. Para lavar las bolas magnéticas, añada 100 μl de TE que contiene 0.5 M NaCl y posteriormente se combinan los dos sobrenadantes.
      Nota: Es importante utilizar reactivos libres de nucleasas (e.g., buffer TE, SDS, etcetera.) para evitar la pérdida de ADN o ARN durante la etapa de reticulación.
  8. Extracto de ADN/ARN con 200 μL de fenol: cloroformo: isoamílico alcohol (PCI) (25:24:1, v/v).
    Nota: RNA puede también ser extraído utilizando kits comerciales utilizando las instrucciones del fabricante. Agitar durante 30 s, centrifugado a 10.000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos y pasar el sobrenadante a un tubo nuevo.
    1. Para precipitar el ADN/ARN, añadir 2 μl de GlycoBlue, 20 μl de acetato de sodio de 3 M y 600 μl de etanol. Mezclar por inversión 5 ~ 8 veces y coloque la muestra en hielo seco o a-80 ° C durante al menos 1-2 h.
    2. Centrifugar la muestra a 10.000 x g durante 30 minutos utilizando una centrífuga de mesa refrigerada (4 ° C). Secar el pellet para < 1 min y resuspender en 40 μl de EB buffer (10 mM Tris-HCl). Para la preparación de la biblioteca de ChIP-Seq, continúe con paso 6.
  9. Sacar ADN de muestras de ARN IP asociada a la cromatina con DNasa. Añadir el tampón de DNasa de 10 x a 1 concentración de x en la muestra CARIP. Añadir 1 μl de DNasa para hasta 10 μg de ARN (reacción de 50 μL). Incubar la muestra a 37 ° C durante 30 minutos de extracto de la muestra de RNA con PCI. Resuspender en libre de nucleasa H2O.

5. double-stranded cDNA síntesis de CARIP-Seq

  1. Síntesis de cDNA de primera línea. Para la reacción de transcripción reversa, establecer la siguiente reacción en un tubo diseñado para una máquina PCR: 10.5 μl de ARN y 1 μl al azar del hexamer primers (3 μg/μl).
  2. Incubar el tubo a 65 ° C por 5 min desnaturalizar la estructura secundaria y almacenar en hielo durante 2 minutos mezcla los siguientes componentes: 4 μL de tampón de primera-filamento, 2 μl de 0,1 M TDT, 1 μl de dNTP y 0.5 Rnasa a. A continuación, en el tubo PCR, añadir 7,5 μl de la mezcla principal. Incubar los tubos durante 2 min a 25 ° C. Añadir 1 μl de superíndice II (200 U/μL) y se incuba como sigue: 25 ° C durante 10 min, 42 ° C por 50 min, 70 º C durante 15 minutos y mantenga a 4 º C.
  3. Síntesis de la segunda cadena de cDNA. Coloque el tubo en hielo. A continuación, agregue los siguientes componentes en orden: 91 de μl de dietil pirocarbonato (DEPC) tratado de agua, 30 μl de 5 x buffer de reacción del segundo filamento, 3 μl de mezcla de dNTP (10 mM), 1 μl de ligase de la DNA de e. Coli (10 U/μL), 4 μL de polimerasa de la DNA de e. Coli (10U/μL) y 1 μl de Rnasa H de E.coli (2U/μL). Mezcle suavemente Vortex e incubar a 16 ° C por 2 h.
    Nota: Mezcla por chasquear o por inversión del tubo puede no ser suficiente para mezclar bien los reactivos.
  4. Añadir 2 μl de T4 DNA polimerasa e incubar a 16 ° C por 5 min Purify cDNA (bicatenario, dscDNA) utilizando el kit de purificación de PCR. Eluir la dscDNA en 40 μl de tampón de EB.
  5. Fragmento de cDNA de doble hebra. Corte cDNA (dscDNA) usando un sonifier del baño de agua y un tubo de 1,5 mL a un tamaño de 250-500 BP sonicación de dscDNA es fundamental para reducir el tamaño de fragmento para facilitar la secuencia de la transcripción de RNA total.
  6. Cuando se utiliza un modelo estándar de un sonifier baño de agua, someter a ultrasonidos la muestra para el 3 × 10 min o 4 × 10 min.
    Nota: Tres ciclos se deben usar para hasta 1 μg de ARN total, mientras cuatro ciclos se recomiendan 1-5 μg de ARN total. El tubo de centrífuga brevemente después de cada ciclo de sonicación y mantener un baño de agua fría añadiendo hielo fresco.
  7. Cuando se utiliza un Pico sonifier, se recomienda usar seis ciclos de 1-5 μg de ARN total y las siguientes condiciones de ciclismo (30 s en 90 s apagado). El tubo de centrífuga brevemente después de 2-3 ciclos de sonicación. La eficacia de la sonicación se puede determinar por la carga de una fracción de la dscDNA esquilado (3-4 μL) en un gel de agarosa (2%). Es importante probar empíricamente las condiciones sonicación debido a la variabilidad entre sonifiers.
  8. Realizar preparación de biblioteca como se describe en el paso 6 para secuenciación de próxima generación.

6. chIP-Seq y construcción de biblioteca de CARIP-Seq

  1. Reparación de extremos de la DNA usando un kit de reparación final de ADN. Este kit se utiliza para generar ADN de punta Roma. Para esta reacción, configurar los siguientes de 1,5 mL, bajo tubo de enlace: 34 μl de ADN, 5 μl de 2, 5 mM dNPTs, 5 μl de 10 mM ATP, 5 μl de 10 x tampón final-reparación (5 mM DTT, acetato de magnesio de 100 mM, 660 mM potasio acetato 300 mM acetato de Tris, pH 7.8) y 1 μl de mezcla de enzima (cinasa de T4 Polinucleótido, polimerasa de la DNA de T4) final-reparación.
  2. Incubar la muestra durante 45 min a temperatura ambiente.
  3. Purificar el ADN utilizando un kit de limpieza de la reacción. Eluir el ADN reparado final en 32 μl de tampón de EB precalentado (65 ° C). Mientras que generalmente no cuantificar la concentración de la DNA después del ChIP, o RNA después de CARIP, antes de la preparación de la biblioteca, se recomienda comenzar con al menos 5-10 ng de ChIP de ADN o ARN de CARIP.
  4. Además de una proyección de 3' "A" al final reparar ADN. Agregar los componentes a un 1,5 mL, tubo de baja obligatoria: 30 μL del ADN desde arriba, 5 μl de 10 x tampón de NEB 2, 1 μl de dATP de stock de 10 mM, 11 μl de H2O y 3 μl de 5 U / fragmento de Klenow μl (3' - 5' Exo-) y mezclar pipeteando suavemente.
  5. Incubar la muestra durante 30 min a 37 ° C.
  6. Utilice un kit de limpieza de reacción para purificar DNA. Eluir el ADN en 25 μl de tampón de EB precalentado (65 ° C).
  7. Ligar el adaptador. Añadir los siguientes componentes en el hielo: 23 μl de ADN desde arriba, 3 μl de tampón de ligasa de T4 ADN de x 10, 1 μl de recocido PE o multiplexación adaptador (4 μm) y 3 μl de T4 ADN ligasa (400 U/μL) y mezclar suavemente por pipeteo.
    Nota: Las secuencias adaptador también pueden obtenerse de una fuente comercial.
    Secuencias de oligonucleótidos:
    Adaptadores de PE
    5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
    5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
    Adaptadores de multiplexación
    5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
    5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
  8. Incubar la muestra durante 30 min a temperatura ambiente.
  9. Realizar la selección del tamaño de ADN utilizando un gel de agarosa (2%) pre-cast. Correr el gel durante 10 minutos.
  10. Impuestos especiales de la región correspondiente a bp 250-450.
    Nota: al cortar el gel por encima por encima de 200 bp, existe la posibilidad de disminución de la contaminación de los dímeros de unligated adaptador. Es importante eliminar cualquier adaptadores unligated antes el paso de la polimerización en cadena.
  11. Utilice un kit de extracción de gel para purificar DNA. Eluir en 20 μl de tampón de EB.
  12. Biblioteca y PCR purificación de ADN ligado muestras con adaptadores de extremo apareado (PE). Añadir los componentes en un tubo PCR: 12 μl del 50% del ADN de arriba, 12 μl de agua, 25 μl de la mezcla principal (Phusion HF), 1 μl de la cartilla de PCR PE 1.0 y 1 μl de la cartilla de PCR PE 2.0.
    Nota: Las secuencias del oligonucleótido también pueden obtenerse de una fuente comercial.
    Secuencias de oligonucleótidos:
    Cartilla PCR PE 1.0
    5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
    Cartilla PCR PE 2.0
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT
  13. Biblioteca y PCR purificación para muestras ligadas con adaptadores índice PE. Agregar los componentes: 12 μl del 50% del ADN de arriba, 12 μl de agua, 1 μl de la cartilla PCR InPE 1.0 (diluido 1:2), 1 μl de la cartilla PCR InPE 2.0 (diluido 1:2) y 1 μl de la cartilla PCR índice (diluido 1:2).
    Nota: las secuencias del oligonucleótido también pueden obtenerse de una fuente comercial.
    Secuencias de oligonucleótidos:
    Multiplexación de PCR Primer 1.0
    5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
    Multiplexación de PCR Primer 2.0
    5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
    Secuencias de PCR Primer Índice 1-12
    Cartilla de la polimerización en cadena, Índice 1
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
    Cartilla de la polimerización en cadena, índice 2
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
    Cartilla de la polimerización en cadena, índice 3
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
    Cartilla de la polimerización en cadena, índice 4
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
    Cartilla de la polimerización en cadena, índice 5
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
    Cartilla de la polimerización en cadena, índice 6
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
    Cartilla de la polimerización en cadena, índice 7
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
    Cartilla de la polimerización en cadena, índice 8
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
    Cartilla de la polimerización en cadena, índice 9
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
    Cartilla de la polimerización en cadena, índice 10
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
    Cartilla de la polimerización en cadena, índice 11
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
    Cartilla de la polimerización en cadena, índice 12
    5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC
  14. Realizar PCR ciclo usando las siguientes condiciones (desnaturalice durante 30 s a 98 ° C, 18 ciclos de 10 s a 98 ° C, 30 s a 65° C, 30 s a 72 ° C, 5 min a 72 ° C, mantener a 4 ° C).
    Nota: El número de ciclos PCR debe determinarse empíricamente.
  15. Selección del tamaño de los productos PCR. Ejecutar el ADN en un Gel E prefabricado EX (2%) o casero 2% gel (agarosa) e impuestos especiales de la región de 300-500 bp.
  16. Utilice un kit de extracción de gel para purificar el ADN desde el gel. Eluir el producto final de PCR en 20 μl de tampón de EB.
  17. Utilice un Fluorímetro para medir la concentración de la biblioteca. Realizar la secuenciación de próxima generación.

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Resultados

Nos interrogó con éxito la Unión de todo el genoma de H3K4me3, H3K4me2 y KDM5B en células madre embrionarias usando este ChIP-Seq protocolo6. Células madre embrionarias fueron cultivados en condiciones libres de alimentación (figura 1) y reticulado como se describió anteriormente. Sonicación fue posteriormente realizado como se describe en el paso 3.2 del protocolo ChIP-Seq y evaluada mediante la ejecución de DNA en gel de agarosa al 2...

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Discusión

ChIP-Seq es un método útil para evaluar la situación de las interacciones proteína-ADN global (por ej., factores de transcripción/histona modificación de enzimas/histona modificaciones y ADN) en células madre embrionarias, mientras que el nuevo protocolo de CARIP-Seq es útil en interrogatorio de Asociación de genoma de ARN con los componentes de la cromatina. ChIP-Seq es una herramienta fundamental que se utiliza para evaluar paisaje epigenético de células madre embrionarias y otros tipos de células. La calidad ...

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Divulgaciones

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por Wayne estado Universidad, Karmanos Cancer Institute, una beca de la National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01A1) a B.L.K. Este trabajo utiliza el Wayne estado Universidad alto rendimiento Computación Grid de recursos computacionales (< https://www.grid.wayne.edu/>). Agradecemos Jiji Kurup ayuda con análisis de datos de CARIP-Seq.

CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES:

B.L.K. concibió el método de CARIP-Seq, diseñado y llevado a cabo los experimentos de ChIP-Seq y CARIP-Seq, analizó los datos de secuenciación y redactó el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado la versión final de este manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Factor inhibidor de la leucemia en ratón (ESGRO LIF)EMD Millipore106 o 107 units
GSK3β inhibidor CHIR99021 (GSK3i)Disolvente derivante: DMSO 10mM
Inhibidor de MEK PD0325901 (MEKi)Disolvente derivante: DMSO 10mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto contenido de glucosaInvitrogen11965092
PBS (solución salina tamponada con fosfato)Invitrogen10010031
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo de fenolGibco25200056
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140122
2-Mercaptoetanol (50 mM)Gibco31350010
MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X)Gibco11140076
EmbryoMax ES Suero Fetal Bovino Calificado para Células, 500 mlEMD MilliporeES-009-B
EmbryoMax 0.1% Solución de GelatinaEMD MilliporeES-006-B
GlycineSigmaG7126-500G1.25 M caldo de conentración en agua
Solución de formaldehídoSigmaF8775-500ML
TE (Tris EDTA) pH 8.0 1XCalidad Biológico351-011-131
Solución de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF)Sigma93482-250ML-F
cOmplete Cóctel de inhibidores de proteasaRoche11697498001
Solución de dodecil sulfato de sodio (20%)Calidad BiológicoA611-0837-10
Q125 sonificador Qsonica4422
Triton X-100 soluciónSigma93443-100ML
Desoxicolato de sodioSigma30970
NaClSigmaS7653
Dynabeads Proteína G para inmunoprecipitaciónInvitrogen10004D
Dynabeads Proteína A para inmunoprecipitaciónInvitrogen10002D
Dynabeads Proteína A/Proteína G y Paquete de inicio de imanesInvitrogen10015D
Cloruro de litioSigmaL4408
IGEPAL CA-630SigmaI8896
RNeasy Mini KitQiagen74104
Dynabeads Kit de purificación de ARNm (para la purificación de ARNm a partir de preparaciones totales de ARN)Invitrogen61006
SuperScript Síntesis de ADNc de doble cadena KitInvitrogen11917010
QIAquick PCR Kit de purificaciónQiagen28104
End-It DNA End-Repair KitLucigenER81050
Klenow Fragment (3'→ 5' exo-)NEBM0212L
dATP (10 mM)Invitrogen18252015
T4 ADN ligasaNEBM0202L
TrackIt 1 Kb Plus DNA LadderInvitrogen10488085
E-gel EX geles de agarosa, 2%InvitrogenG402002
Phusion mezcla maestra 2X de alta fidelidad con tampón HFThermo Fisher
ChIPAb+ Trimetil-Histona H3 (Lys4) - Anticuerpo validado por ChIPEMD Millipore17-614
Anti-histona H3 (di metil K4) anticuerpo [Y47] - Grado ChIP (ab32356)Abcamab32356
Corning Costar Placas de cultivo celular de fondo plano (6 pocillos)Fisher720083
Falcon Placas de cultivo de tejidos estándar (10 cm)Fisher08772E
Bioruptor picoDiagenodeB01010001
Qubit Flurometer 2.0Thermo Fisher
Qubit dsDNA HS Kit de ensayoThermo FisherQ32851
MinElute Reaction Cleanup KitQiagen28204
MinElute Kit de extracción de gelQiagen28604
Anti-histona H4 (tri metilo K20) anticuerpo - Grado ChIP (ab9053)Abcamab9053
Rotador LabquakeThermo Fisher400110Q
Illumina Plataforma HiSeqIllumina
TURBO DNaseInvitrogenAM2238
F531LPM

Referencias

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CARIP-Seq y ChIP-Seq: métodos para identificar cromatina asociada RNAs y las interacciones DNA proteína en las células madre embrionarias
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