Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para ablación de una subpoblación genéticamente marcada de neuronas por un láser de dos fotones de larvas de pez cebra.

Resumen

Para identificar el papel de una subpoblación de neuronas en el comportamiento, es esencial para poner a prueba las consecuencias de bloquear su actividad en animales vivos. Ablación láser de las neuronas es un método eficaz para este propósito cuando las neuronas son selectivamente marcadas con sondas fluorescentes. En el presente estudio, se describen los protocolos para láser ablación una subpoblación de neuronas utilizando un microscopio de dos fotones y la prueba de sus consecuencias funcionales y conductuales. En este estudio, el comportamiento de captura de presas en las larvas de pez cebra se utiliza como un modelo de estudio. El circuito hipotalámico pretecto se conoce para ser la base de esta presa visualmente impulsado por captura de comportamiento. Pez cebra pretectum fue quitado por ablación láser, y la actividad neuronal en el lóbulo inferior del hipotálamo (ILH; el objetivo de la proyección pretectal) fue examinada. Comportamiento de captura de presas después de la ablación pretectal también fue probado.

Introducción

Para entender cómo el comportamiento surge de la actividad neuronal en el cerebro, es necesario identificar los circuitos neuronales que intervienen en la generación de ese comportamiento. En la etapa larval, el pez cebra proporciona un modelo animal ideal para estudiar la función cerebral asociado con el comportamiento porque sus cerebros pequeños, transparentes permiten investigar la actividad neuronal en una resolución de celular en una zona amplia de la cerebro mientras observa el comportamiento¹. Proyección de imagen de la actividad neuronal en las neuronas específicas ha sido posible a través de la invención de indicadores genético codifi....

Protocolo

1. ablación de una subpoblación de neuronas utilizando un microscopio de dos fotones láser

Nota: Si los usuarios plan realizar ablación siguiente imagen Ca, utilice la línea de UAShspzGCaMP6s²¹. Si los usuarios plan realizar grabación comportamiento después de la ablación, use la línea de UAS:EGFP, como la ablación de las células positivas de EGFP es más fácil de realizar que la de las células GCaMP6s expresan.

1. Comenzar por establecer el apareamiento de una línea de Gal4 etiqueta a neuronas específicas para ser estudiada y UAS:EGFP o UAShspzGCaMP6s. Asegúrese de utilizar el fondo de nác....

Resultados

Neuronas específicas fueron etiquetadas genéticamente con EGFP o GCaMP6s, cuya expresión fueron conducidos en líneas de Gal4. Un gSAIzGFFM119B de la línea de Gal4 fue utilizada para etiquetar un núcleo en el área pretectal (núcleo pretectal superficial magnocelulares) y una subpoblación de neuronas del bulbo olfatorio. Otra línea de Gal4, hspGFFDMC76A, fue utilizado para etiquetar el ILH. Laser-ablación las neuronas pretectal bilateral (panel de la izquierdafigura 2

Discusión

Aunque el régimen de dos fotones láser tiene una excelente resolución espacial a ablar específicamente las neuronas individuales, gran debe tener precaución para evitar daños no deseados en el tejido cerebral debido a la calor. El paso más importante en el experimento de ablación es determinar la cantidad óptima de la irradiación del laser. Insuficiente irradiación no mata a las neuronas. Demasiada irradiación será daño por calor el tejido circundante, que darán lugar a efectos no deseados. El rango óptimo de irradiación.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NuSieve GTG Agarosa	Lonza	Cat.#50080	agarosa de baja temperatura de fusión
6 cm placa de Petri	FALCON	Producto#:351007
aguja de disección	AS ONE Corporation	Cat. Nº 2-013-01	https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MP	Carl Zeiss		microscopio de barrido láser de dos fotones
W Plan-Apochromat 63x/1.0	Carl Zeiss		63X
objetivo lente Imager.Z1	Carl Zeiss		un microscopio de epifluorescencia
ZEN	Carl Zeiss Software de adquisición de		imágenes para microscopios confocales
de cámara de hibridación Secure-Seal, 8 cámaras, 9 mm de diámetro x 0,8 mm de profundidad	Catálogo de Sondas	Moleculares # S-24732	Utilizado como cámara de registro en cámaras de imagen de Ca
de imagen Grace	Bio-Labs	CoverWell PCI-A-2.5	Utilizado como cámara de registro de comportamiento
bisturí quirúrgico	MANI	Cuchillo oftálmico MST15
ORCA-Flash4.0	Modelo de Hamamatsu Photonics	:C11440-22CU	una cámara CMOS científica
HCImage	Hamamatsu Photonics		software de acusión de imágenes
Módulo de grabación de disco duro	Hamamatsu Photonics	Un módulo de software que permite guardar los archivos de película en una unidad de disco duro en poco tiempo
			lente de objetivo para SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio	FLIR Systems, Inc.	N.º de producto GS3-U3-41C6NIR-C	CMOS cámara
XIMEA xiQ cámara	XIMEA	N.º de producto Cámara	CMOS
un anillo de luz LED	CCS	Modelo: LDR2-100SW2-LA	LED
Malla de nailon 32µ m	Tokyo Screen	N-No.380T	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Malla de nylon 13µ m	Pantalla de Tokio	N-No. 508T-K	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Pantalla de metal con apertura de 150 micras	Pantalla		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
de metal con apertura de 75 micras	Pantalla		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS	Asahi Food & Cuidado de la salud, Co. Ltd.		levadura de cerveza seca
LabVIEW	National Instruments		un entorno de desarrollo integrado para la programación
de Mai-Tai HP	Spectra Physics		láser de dos fotones

Junta CámarasSZX7 Olympus estereoscopio DF PL 0.5X Olympus MQ042RG-CM blanco de de ,