Aquí, presentamos la evaluación preclínica de cumarinas contra el Cáncer utilizando el pez cebra y cultura 3D.
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Artículo de método
Evaluación preclínica de la bioactividad de la OT48 contra el cáncer de la cumarina por esferoides, ensayos de formación de Colonia y xenoinjertos de pez cebra
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Resumen
Resumen
Investigación preclínica in vitro e in vivo de nuevos agentes terapéuticos son una herramienta esencial en el descubrimiento de fármacos de cáncer. Aunque las líneas celulares de cáncer humano responden a compuestos terapéuticos en cultivos de células de la monocapa (dimensional) 2D, 3D cultura sistemas fueron desarrollados para comprender la eficacia de fármacos en modelos más fisiológicamente relevantes. En los últimos años, se observó un cambio de paradigma en investigación preclínica para validar la potencia de nuevas moléculas en sistemas de cultivo 3D, concretamente imitando el microambiente tumoral. Estos sistemas caracterizan el estado de la enfermedad de una manera más fisiológico relevante y ayudan a obtener mejor visión mecanicista y la comprensión de la potencia farmacológica de una molécula dada. Por otra parte, la tendencia actual en la mejora de modelos de cáncer en vivo , pez cebra ha surgido como un modelo vertebrado importante a evaluar en vivo formación de tumor y estudiar el efecto de agentes terapéuticos. Aquí, hemos investigado la eficacia terapéutica de hidroxicumarina OT48 solo o en combinación con BH3 miméticos en línea de células de cáncer de pulmón A549 utilizando tres sistemas diferentes cultura 3D incluyendo ensayos de formación de Colonia (CFA), ensayo de formación esferoide (SFA) y en vivo xenoinjertos de pez cebra.
Introducción
El cáncer es causado por mutaciones celulares y como consecuencia bioquímicas vías de señalización se interrumpen provocando división celular incontrolada y resistencia a la muerte celular. Tumores de interfieran en las funciones fisiológicas del aparato digestivo, nervioso, circulatorio y posteriormente vecinos de tejidos1. A pesar de los esfuerzos de investigación extensa, el cáncer sigue siendo la enfermedad mortal más frecuente en el mundo2. Medicina de precisión ha sido reconocida como el fundamento de la terapéutica de cáncer futuro. Nuevas entidades moleculares se prueban rutinariamente en combinación con los medicamentos existentes para mejorar el resultado clínico.
Sin embargo, una de las limitaciones significativas asociadas con el desarrollo de nuevas terapias dirigidas eficientes es la falta de ensayos utilizados para simular el resultado biológico exacto de drogas exposición3. Descubrimiento de fármacos de cáncer todavía sobre todo se basa en la prueba de la eficacia de agentes terapéuticos en líneas celulares de cáncer cultivadas en cultivos monocapa 2D, que son difíciles de validar en ensayos clínicos4. Por lo tanto, hay un interés creciente para desarrollar mejores modelos de cáncer que imitan mejor las características nativas de tumores en vivo5. En los últimos años un creciente interés en los modelos 3D de la cultura dio lugar al desarrollo de mejores metodologías para producir tumor 3D modelos5.
Aquí, presentamos un enfoque con tres técnicas de cultivo celular 3D diferentes lo que permite para mejorar la comprensión de la potencia de la hidroxicumarina OT486 en combinación con BH3 miméticos antes más en profundidad en vivo ensayos. Nuestro método consiste en combinar la Colonia y SFAs con una en vivo tumor formación prueba basada en un modelo de pez cebra para validar la eficacia de la combinación de OT48 y BH3 miméticos en las células de cáncer de pulmón y monitorear la progresión del cáncer en una vida organismo.
Ensayos de formación de Colonia se utilizan habitualmente para evaluar la eficacia de los agentes contra el cáncer para los cánceres tanto sólidos como hematopoyéticos. El ensayo determina la capacidad de una célula a proliferar indefinidamente y forman colonias7. El efecto de un agente contra el cáncer sobre la capacidad de las células formadoras es determinado por la disminución del número o tamaño de las colonias.
Esferoides representan modelos de tumores en vitro y servir como una plataforma de proyección de bajo costo para agentes anticancerígenos. Esferoides son agregados de células en suspensión o embebidas en una matriz 3D. Este enfoque es ampliamente utilizado para la detección de drogas y estudios del tumor crecimiento, proliferación e inmune interacción8.
Para entender completamente las propiedades de un nuevo medicamento, es esencial para llevar a cabo experimentos en vivo en roedores. Sin embargo, este método convencional es costoso y desperdiciador de tiempo. En los últimos años, pez cebra (Danio rerio) se convirtió en un organismo de laboratorio ampliamente estudiado que es más barato y más rápido para subir. Tumores se convirtieron en el enfoque de cultura de pez cebra representan un 3D celular pero en el marco de en vivo de un vertebrado9.
En conjunto, utilizamos aquí tres enfoques diferentes cultura 3D incluyendo CFAs, SFAs y pez cebra en vivo tumor formación para demostrar la capacidad anticancerígena de hidroxicumarina OT48 en un modelo de celular A549 el cáncer de pulmón en combinación con BH3 miméticos.
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Protocolo
1. Colonia formación ensayos
- Células A549 en cultivo en una concentración de 20.000 células/cm2 en 15 mL de RPMI1640 celular medio de cultivo suplementado con 10% FBS (suero bovino Fetal) y 1% antibióticos en un matraz de2 75 cm en un incubador de CO2 a 37 ° C y 5% CO2.
- En el día del experimento, determinar la concentración de células usando un hemocitómetro. Recoger 50.000 células por centrifugación a 400 x g por 7 min en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y resuspender las células en 100 μl de PBS estéril x 1 (fosfato tampón salino) en tubos de 1,5 mL.
- Distribuir 1,1 mL de medio semisólido metilcelulosa-basado (MCBM) en tubos de 15 mL con una pipeta múltiple. Preparar un tubo para cada condición.
- Agregar 110 μl de FBS a 1,1 mL de MCBM utilizando una micropipeta P200.
- Células de las semillas en 1.000 células/mL. Recoger la solución (50.000 células en 100 μl de PBS 1 x) 2.4 μL de suspensión celular con una micropipeta de P2 y añadir a 1,1 mL de MCBM suplementado con 10% FBS.
- Después de añadir las células, vórtex los tubos durante 1 minuto, mantiene verticalmente a la máxima velocidad para mezclar MCBM y células bien.
- Añadir compuestos de prueba (OT48 solos o en combinación con A1210477). Preparar un tubo separado como un control para que el disolvente utilizado (aquí dimetilsulfóxido (DMSO)). Dependiendo de la concentración de los compuestos y el volumen añadido para cada condición, el control solvente incluirá la mayor concentración de solvente utilizado para las diluciones de la sustancia, de ensayo para evaluar los efectos adversos causados por el solvente.
- Tubos Vortex durante 1 minuto.
- Para cada ensayo, añadir 1 mL de la mezcla con una micropipeta P1000 al centro de una placa de cultivo celular 12-bien.
- Llenar vacíos pozos con 1 mL de agua estéril o 1 x PBS para estabilizar la humedad.
- Incubar las placas de cultivo durante 10 días en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2.
- Después de 10 días de incubación, añadir 200 μL de una solución de stock (bromuro de methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio) de MTT (5 mg/mL) a cada pocillo para alcanzar una concentración final de 1 mg/mL.
- Incubar 10 minutos en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2. Colonias viables se pondrá violeta.
- Capturar la imagen utilizando una cámara digital usando la placa de fondo blanco (bandeja de LAS dia blanco). Utilice la siguiente configuración: método, digitalizar; Tipo de exposición, precisión; Tiempo de exposición, manual, 1 segundo; Sensibilidad/resolución, alta resolución. Guarda la imagen en formato tiff.
- Cuantificar las colonias viables utilizando el software ImageJ. Seleccionar el menú "imagen | Tipo | 8 bits". Seleccionar el menú "ajuste | Umbral". Ajuste umbral para controlar y mantener constantes para todas las condiciones; Seleccionar el menú "analizar | Analizar las partículas". Guardar los datos y analizar con un software de estadísticas para la representación gráfica.
2. esferoide formación ensayo
- Células A549 en cultivo en una concentración de 20.000 células/cm2 en2 frascos de 75 cm con 15 mL de Medio RPMI 1640 suplementado con 10% FBS y 1% antibióticos.
- En el día del experimento, preparar un 96 bien placa de U-inferior.
- Placa de 10.000 células en un pozo que ya contiene el compuesto de interés (aquí 50 μm de OT48) y 20 μm de A1210477. Ajustar el volumen final a 100 μl de medio de cultivo celular. El número de células que forman esferoides uniforme con un límite exterior intacto se considera esferoides de forma adecuado.
- Incubar durante 3 días en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2.
- Después de 3 días de incubación, capturar imágenes de los esferoides con un microscopio óptico de 4 aumentos.
3. pez cebra xenoinjerto ensayo
Nota: Este planteamiento técnico se visualiza como un esquema (figura 1).
-
Preparación de los reactivos comunes
- Preparar 1 L de 30 x solución de Danieau: 1740 mM NaCl, KCl de 21 mM, 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (NO3)2y 150 mM HEPES. Ajustar el pH del buffer a 7.6 usando un medidor de pH.
- Preparar solución de Metanosulfonato 1% (50 x): disolver 20 mg de metanosulfonato de 3-aminobenzoato de etilo (Metanosulfonato) en 2 mL de agua destilada.
- Preparar la solución de rojo de fenol-PBS 1%: Añadir 2 μl de solución de sal de sodio rojo de fenol a 198 μl de solución de PBS esterilizada en un tubo de 1,5 μl.
- Preparar 3% metilcelulosa: Añadir a 100 mL de solución de Danieau 1 x 3 g de metilcelulosa.
-
Incubación y producción de huevos de pez cebra
- Separado una hembra y un pez cebra macho en un tanque de partición llenan con agua del grifo filtrada y esterilizada por rayos UV a 28,5 ° C en la oscuridad. Después de 24 h de separación, mezclar peces de ambos sexos para iniciar el apareamiento. Transferencia de óvulos fecundados del tanque del acoplamiento a una placa Petri que contiene 5 mL de solución de Danieau fresco.
- Lavar los huevos tres veces con 5 mL de solución de Danieau. Para el lavado, Aspire cuidadosamente los huevos con una pipeta de transferencia a 5 mL de solución fresca. Incubar durante 8 h a 28,5 ° C.
- Después de 8 h de incubación en la solución de Danieau, cambiar a solución de Danieau que contiene 0.03% 1-fenil-2-tiourea (PTU) para inhibir la pigmentación. Arreglar huevos opacos (no fecundados o que contienen embriones sin desarrollar) para evitar la contaminación.
-
Embrión dechorionation
- 24 horas post fecundación (hpf), embriones de pez cebra de dechorionate con unas pinzas afiladas. Incubar Incubar embriones en solución de Danieau con 0,03% PTU a 28,5 ° C hasta 48 hpf.
-
Preparación de la célula tratada con compuesto
- Células A549 de semilla a 20.000 células/cm2 en frascos de cultivo de 25 cm2 . Después de 24 h de la siembra, añadir compuestos (aquí OT48 a 50 μm y o A1210477 a 20 μm) por 24 h en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2. Configurar el tiempo de tratamiento para cada uno de ellos para mantener la viabilidad de las células pero cometer hacia la muerte celular. Esta vez punto deben configurarse individualmente basado en la viabilidad celular, morfología y marcadores moleculares.
- 2 h antes de finalizar el tratamiento, mancha las células con 4 μm del rastreador de celular fluorescente tinte CM Dil a 37 ° C y 5% CO2. Después de 2 h de incubación, trypsinize células con 0.05% tripsina-EDTA y diluya 106 células en 50 μl de solución de rojo de fenol-PBS antes de la inyección.
-
Microinyección de células cancerosas para formación de xenoinjerto
- Anestesiar el pez cebra en una solución de metanosulfonato de 0,02% por 5 min hasta que establecen en una placa de agar.
- Tire un 1,0 mm (fuera del diámetro (OD) capilar de vidrio) por un tirador de la micropipeta (programar ajustes: P: 300, calor: 260, tire: 60, VEL: 50 y el tiempo: 200). Corte el microcapillary con una jeringa para producir un borde afilado. Carga de microcapilares con 20 μl de células/fenol rojo-solución de PBS. Presión de inyección y el tiempo para dispensar 2 nL por inyección.
- Inyectar 100-200 células en el saco vitelino por inyección 6 a 10 nL a través de 3 a 5 inyecciones. Después de la inyección, permitir a los peces a recuperar de 10 a 30 min en 5 mL de solución de Danieau fresco que contiene solución PTU. Envío peces en placas de 24 pozos con 1 mL de solución de Danieau que contiene solución PTU son e incuban por 72 h a 28,5 ° C.
- Después de 72 h de incubación, anestesiar peces en una solución de metanosulfonato de 0,02% e inmovilizar en un portaobjeto con una gota de metilcelulosa al 3%. Tomar 5 fotos x por microscopía de fluorescencia a una longitud de onda de 620 a 750 nm.
- Cuantificar el tamaño de tumores fluorescentes por el software ImageJ. Seleccionar el menú "analizar | Medida". Guardar valores correspondientes a la señal fluorescente y analizar con un software de estadísticas para la representación gráfica.
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Resultados
En la figura 2, cáncer de pulmón de células A549 fue sembrada en MCBM a colonias de forma después del tratamiento con OT48 solo o en combinación con BH3 mimética A1210477 en las concentraciones indicadas. Los resultados mostraron que la combinación reduce significativamente número, tamaño y superficie total de las colonias después de 10 días de incubación.
En la figura 3
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Discusión
Las tasas de formación de la Colonia con MCBM depende del tipo de célula. Generalmente, para las células no adherentes, el número de colonias es mucho mayor en comparación con las células adherentes. Observamos que las células A549 formaron colonias de 30 a 40 después de 10 días. Previamente hemos reportado para las células de leucemia diferentes que el número de colonias es entre 200 a 2509. Nuestros resultados demostraron que solo OT48 no produjo una disminución significativa del número de colon...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Investigación en SNU es apoyada por la Fundación Nacional de investigación (NRF) de MEST de Corea para la concesión de microambiente Global núcleo investigación centro (GCRC) Tumor, [número de concesión 2011-0030001]; por la beca de investigación de Universidad Nacional de Seúl y Corea de cerebro (BK21) más el programa.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Materiales necesarios para los ensayos de formación de colonias | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500-20 | C° |
| Penicilina-Estreptomicina | Lonza | 17-602E-20 | C&Deg; |
| Matraz de cultivo celular T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solución | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml | tubo Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tubo | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| placa de 12 pocillos | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230-20 | C° |
| Bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo (polvo MTT) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| fuerte>Materiales necesarios para el ensayo de formación de esferoides | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500-20 | C° |
| Penicilina-estreptomicina | Lonza | 17-602E-20 | C° |
| Matraz de cultivo celular T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solución | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt placa de 96 pocillos | Microscopía Corning | 3474 | RT |
| Nikon | Eclipse TS100 | RT | |
| strong>Materiales necesarios para xenoinjertos de pez cebra | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500-20 | C° |
| Penicilina-estreptomicina | Lonza | 17-602E-20 | C° |
| Matraz para cultivo celular T25 | SPL | 70025 | RT |
| Matraz para cultivo celular T75 | SPL | 70075 | RT |
| Matraz para cultivo celular T175 | SPL | 71175 | RT |
| Tubo de 1,5 ml | Extragene | Tube-170-C | RT |
| Placa de 24 pocillos | SPL | 30024 | RT |
| Placa de Petridish | SPL | 10100 | RT |
| Solución PBS | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Cloruro de potasio (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Nitrato de calcio tetrahidratado (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| Solución HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| 3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato (tricaína) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Solución de rojo de fenol | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Metilcelulosa | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-fenil-2-tiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil colorante | Invitrogen | C7001-20 | C° |
| Capilar de vidrio | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Extractor de micropipetas | Instrumento de obturador, EE. UU | P-97 | RT |
| Microinyector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Jeringa | KOVAX | 1ml | RT |
| Microcargador | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Corredera de vidrio | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Microscopía de fluorescencia | Leica | DE/DM 5000B | RT |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
