Simple y eficaz administración y visualización de micropartículas en el sistema circulatorio de peces pequeños con inyección de riñón

Summary

Este artículo demuestra los principios de una inyección rápida, mínimamente invasiva de micropartículas fluorescentes en el circulatory system de peces pequeños y la visualización en vivo de las micropartículas en sangre de peces.

Abstract

La administración sistémica de tamaño de micro partículas en un organismo vivo puede aplicarse para la visualización de la vasculatura, drogas y vacunas entrega, implantación de células transgénicas y diminutos sensores ópticos. Sin embargo, microinyecciones intravenosa en animales pequeños, que se utilizan principalmente en laboratorios biológicos y veterinarios, son muy difíciles y requieren de personal capacitado. Aquí, demostramos un método robusto y eficiente para la introducción de micropartículas en el sistema circulatorio del adulto pez cebra (Danio rerio) por inyección en el riñón de peces. Para visualizar las micropartículas introducidas en la vasculatura, proponemos una simple técnica de imagen intravital en branquias de peces. En vivo monitoreo del pH de sangre del pez cebra se logró mediante un fluorescente microencapsulado inyectado sonda, SNARF-1, para demostrar una de las posibles aplicaciones de la técnica descrita. Este artículo proporciona una descripción detallada de la encapsulación de tinte pH-sensible y demuestra los principios de la inyección rápida y visualización de las microcápsulas obtenidas para la grabación en vivo de la señal fluorescente. El método de inyección propuesto se caracteriza por una tasa de mortalidad baja (0-20%) y alta eficiencia (70-90% de éxito) y es fácil de Instituto con equipamiento disponible comúnmente. Pueden realizarse todos los procedimientos descritos en otras especies de peces pequeños, como lebistes y medaka.

Introduction

La administración de partículas micro-tamaño en un organismo animal es una tarea importante en áreas tales como drogas y vacunas entrega¹, vasculatura visualización², célula transgénica implantación³e implantación minúsculo sensor óptico ^{4 , 5}. sin embargo, el procedimiento de implantación para las partículas de la microescala en el sistema vascular de los animales de laboratorio pequeños es difícil, especialmente para los organismos acuáticos delicados. Para muestras de investigación populares como el pez cebra, se recomienda que estos pr....

Protocol

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo con arreglo a la Directiva 2010/63/UE para experimentos con animales y han sido aprobados por Animal temas investigación Comité del Instituto de biología en la Universidad Estatal de Irkutsk.

1. fabricación de microcápsulas

Nota: Microcápsulas con un colorante fluorescente se preparan con un conjunto de capa por capa de polielectrolitos cargados opuestamente^7,8. Todos los procedimientos fueron realizados a temperatura ambiente.

1. Para sintetizar poroso CaCO₃ microcores adjuntand....

Results

Los resultados obtenidos provienen de una de las tres categorías principales del protocolo presentado: la formación de micropartículas fluorescentes por encapsulación de un colorante fluorescente (figura 1), la inyección de riñón de microcápsulas con mayor visualización en Gill capilares (figura 2 y 3) y, finalmente, la en vivo espectral grabación de SNARF-1 fluorescencia para monitorear.......

Discussion

Para demostrar la inyección de micropartículas en el riñón del pez cebra, utilizamos microcápsulas semipermeables cargadas con un colorante indicador. Así, el protocolo contiene las instrucciones para la fabricación de las microcápsulas con el conjunto de capa por capa de polielectrolitos cargados opuestamente^{7,8,15,16,17 ,18}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SNARF-1-dextrano, 70000 MW	Thermo Fisher Scientific	D3304	Sonda fluorescente. Se puede utilizar cualquier otro colorante fluorescente unido a polímero apropiado como relleno de microcápsulas
Conjugado de isotiocianato de albúmina-fluoresceína (FITC-BSA)	SIGMA	A9771	Sonda fluorescente
Isotiocianato de rodamina B-Dextrano (RITC-dextrano)	SIGMA	R9379	Sonda fluorescente
Cloruro de calcio	SIGMA	C1016	Formación
de plantillas de CaCO3Carbonato de sodio	SIGMA	S7795	CaCO3 formación de plantillas
Clorhidrato de poli(alilamina), MW 50000 (PAH)	SIGMA	283215	Polímero catiónico
Poli(4-estirenosulfonato de sodio), MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	Polímero aniónico
Poly-L-lisina [20 kDa] injertado con polietilenglicol [5 kDa], g = 3,0 a 4,5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)- g[3.5]-PEG(5)	Polímero final para aumentar la biocompatibilidad de las microcápsulas
Cloruro de sodio	SIGMA	S8776	Para disolver polímeros aplicados
Sistema de purificación de agua	Millipore	SIMSV0000	Para preparar agua desionizada
Agitador magnético	Stegler		Para la formación
de plantillas de CaCO3Eppendorf  Investigación  pipeta plus, 1000 y micro; L	Eppendorf		Soluciones de dosificación
Eppendorf  Investigación  pipeta plus, 10 y micro; L	Eppendorf		Soluciones de dosificación
Puntas de pipeta, rango de volumen de 200 a 1000 y micro; L	F.L. Medical	28093	Soluciones de dosificación
Puntas de pipeta, rango de volumen 0,1-10  μ L	Eppendorf	Z640069	Soluciones de dosificación
Minicentrífuga Microspin 12, BioSan			Para el procedimiento de centrifugación-lavado de microcápsulas
Microtubos de centrífuga, 2 mL	Eppendorf	Z666513	Síntesis y almacenamiento de microcápsulas
Agitador Intelli-mezclador RM-1L	ELMY Ltd.		Para reducir la agregación de microcápsulas
		ultrasónico	Para reducir la agregación de microcápsulas Auriculares
			Para proteger los oídos de los ultrasonidos
Ácido etilendiaminotetraacético	SIGMA	EDS	Para disolver las plantillas de CaCO3
Fosfato monosódico	SIGMA	S9638	Preparación de tampones de pH
Fosfato disódico	SIGMA	S9390	Preparación de tampones de pH
Hidróxido de sodio	SIGMA	S8045	Para ajustar el pH de la solución de EDTA y los tampones
Cámara del termostato			Para secar microcápsulas en portaobjetos de vidrio
Hemotómetro Cámara			Para investigar el tamaño, la distribución y la concentración de las microcápsulas preparadas
Microscopio fluorescente Mikmed 2	LOMO		Visualización in vivo de microcápsulas en sangre
de pescadoJuego de filtros fluorescentes para SNARF-1 (debe elegirse en función del modelo de microscopio; se proporciona un ejemplo)	Chroma	79010	Visualización de microcápsulas con sondas fluorescentes
Espectrómetro de fibra QE Pro	Ocean Optics		Calibración de microcápsulas bajo microscopio
Fibra óptica QP400-2-VIS NIR, 400 μ m, 2 m	Ocean Optics		Para conectar el espectrómetro con el puerto del microscopio
Colimador F280SMA-A	Thorlabs	Para conectar el espectrómetro con el puerto del
Portaobjetos de vidrio para microscopio Fisherbrand		12-550-A3	Calibración de microcápsulas bajo microscopio
Cubreobjetos, 22 x 22 mm	Pearl	MS-SLIDCV	Calibración de microcápsulas bajo microscopio
Microcapilares de vidrio Intra MARK, 10 y micro; L	Blaubrand	BR708709	Para recoger sangre de pescado
Aceite de clavo	SIGMA	C8392	Anestesia de pescado
Lanceta nº 11	Apexmed international B.V.	P00588	Para cortar la cola de pescado y liberar la aguja de acero de la punta del autoinyector de insulina
Heparina, 5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	Para tratar todas las superficies que entran en contacto con la sangre de los peces durante la extracción de sangre de los peces
Seven 2 Go Pro Medidor de pH con un microelectrodo	Mettler Toledo		Para determinar el pH de la sangre de los peces
Agujas de la pluma de insulina Micro-Fine Plus, 0,25 x 5 mm	Becton, Dickinson and Company		Para el procedimiento de inyección. Cualquier aguja fina (Ø 0,33 mm o menos) es apropiada
Capilares de vidrio, 1 x 75 mm	Hirschmann Laborgerä te GmbH & Co	9201075	Para el procedimiento de inyección
Antorcha			Para soldar aguja de acero a capilar de vidrio
Microinyector IM-9B	NARISHIGE		Para la dosificación precisa de microcápsulas suspensión
Placas de Petri, 60 mm x 15 mm, poliestireno	SIGMA	P5481	Para manipulaciones con peces bajo anestesia
Cuchara			de plásticoPara manipulaciones con peces bajo anestesia
Esponja			Para manipulaciones con peces bajo anestesia
Tijeras de disección	Thermo Scientific	31212	Para quitar la cubierta branquial de la cabeza de pescado
Pipeta Pasteur, 3,5 mL	MARCA	Z331767	Para humedecer las branquias de los peces