Uso de dos electroforesis del Gel de la agarosa detergente semi desnaturalización Dimensional para confirmar la heterogeneidad de tamaño de las fibras amiloides o amiloide-como

Resumen

Aquí utilizamos electroforesis en agarosa semi desnaturalización bidimensional para confirmar la presencia de fibras de amiloide como de tamaño heterogéneo y excluir la posibilidad de que la heterogeneidad de tamaño es debido a la disociación de las fibras amiloides en el gel proceso en ejecución.

Resumen

Fibras amiloides o amiloide-como han sido asociadas con muchas enfermedades humanas y ahora se están descubriendo importantes para muchas vías de señalización. La capacidad de detectar fácilmente la formación de estas fibras en diferentes condiciones experimentales es esencial para la comprensión de su función potencial. Muchos métodos se han utilizado para detectar las fibras, pero no sin algunos inconvenientes. Por ejemplo, microscopía electrónica (EM), o tinción con rojo Congo o Thioflavin T a menudo requiere purificación de las fibras. Por otra parte, la electroforesis en gel de agarosa detergente la desnaturalización (SDD-edad) permite la detección de las fibras de amiloide-como SDS-resistente en los extractos de célula sin purificación. Además, permite la comparación de la diferencia de tamaño de las fibras. Más importante aún, puede utilizarse para identificar proteínas específicas dentro de las fibras por borrar occidental. Es mucho menos tiempo y más fácilmente accesible a un mayor número de laboratorios. SDD-edad resultados a menudo muestran grados variables de heterogeneidad. Plantea la pregunta de si parte de la heterogeneidad resulta de la disociación de la proteína del compleja durante la electroforesis en presencia de SDS. Por esta razón, hemos empleado una segunda dimensión de SDD-edad para determinar si la heterogeneidad de tamaño vista en SDD-edad es realmente consecuencia de la heterogeneidad de fibra en vivo y no un resultado de la degradación o la disociación de algunas de las proteínas durante el electroforesis. Este método permite la confirmación rápida y cualitativa que las fibras de amiloide o amiloide-como no están disociando parcialmente durante el proceso de SDD-edad.

Introducción

La formación de fibras amiloides debido a mal plegamiento de proteínas ha sido conocida para jugar un papel en condiciones patológicas como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington¹. Más recientemente, la formación de fibras amiloides o amiloide-como se ha demostrado que una parte de vías de señalización en los seres humanos, incluyendo durante la respuesta inmune innata antiviral² y necroptosis^3,4y en organismos inferiores como levadura^5,6. Por lo tanto, la cap....

Protocolo

1. preparar las muestras

1. Amiloide de cultura 2 x 10⁶ produciendo las células de cáncer de colon HT-29 en un plato de cultivo de tejidos de 10 cm en 10 mL de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con suero bovino fetal 10% y penicilina-estreptomicina. Las células de cultivos durante la noche en una incubadora de 37 ° C con 5% CO₂.
   1. Después de que las células crecen al 80% de confluencia, lavan las células con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 3 mL de solución de tripsina e incubar a 37 ° C durante 3 minutos.
   2. Después de que las células están totalmente disociadas de la fuente, añadir 10 mL de....

Resultados

Después de la inducción de la necroptosis, RIPK1 y RIPK3 mostraron patrones de amiloide-como casi idénticos (carriles 2 y 4, figura 1). Sin embargo, las fibras MLKL fueron más heterogéneas y parecen ser más pequeño que las fibras RIPK1/RIPK3 (carril 6, figura 1). Nos impulsó a desarrollar el método SDD-edad 2D para hacer frente a la posibilidad o MLKL forma fibras RIPK1/RIPK3-independiente MLKL simplemente se disocia de las grand.......

Discusión

El aspecto más crítico de la SDD-edad 2D es que las condiciones de electroforesis son las mismas para la primera y la segunda dimensión. La capacidad para detectar una fuerte línea diagonal a 45° (lo que indica que no se ha producido ninguna disociación o degradación) depende de las fibras de migrar de manera idéntica durante electroforesis. Usando diferentes condiciones, por ejemplo cambiando la tensión o la longitud de tiempo de ejecución, se oscurecen estos resultados. También, como es el caso de tradicional 1D SDD-ed.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
unidad de electroforesis en gel	Fisher	HE99XPRO	appratus para correr en gel.
agrose	VWR	97062-250	Para gel de agarosa.
torre de papel	Fisher	19-120-2484	para transferencia
de papel de filtro	VWR	21427-386	para transferencia de
PVDF membrana	Bio-Rad	162-0177	para transferencia de
leche en polvo bloqueante	Bio-Rad	1706404XTU	para bloqueo en Western blot
Anticuerpo MLKL	Genetex	GTX107538	conejo anticuerpo anti-MLKL
Anticuerpo RIPK1	BD Biosciences	610459	ratón anticuerpo anti-RIPK1 anticuerpo
RIPK3	regalo del Dr. Xiaodong Wang		conejo anti-RIPK3. Véase refenence 11.
anti-Rabbit-HRP	Sigma	A6154	anticuerpo secundario
ECL	Fisher	WBKLS0500	sustrato HRP quimioluminiscente occidental
película de rayos X	Fisher	F-BX810	para resultado de Western blot
DMEM Sigma		D6429	para cultivo celular
suero fetal bovino	Sigma	F4135	para cultivo celular
penicilina-estreptomicina	Sigma	P4333	para cultivo celular
Solución de tripsina	Sigma	T4049	para cultivo celular
PBS para cultivo de tejidos	Sigma	D8662	para cultivo celular
TNF recombinante	fabricado en nuestro laboratorio		para inducir necroptosis. Véase la referencia 11.
regalo mimético del	Dr. Xiaodong Wang		para inducir la necroptosis. Véase la referencia 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	para inducir la necroptosis. Véase la referencia 11.
Contador	de células Bio-Rad	1450102	modelo TC20; para el recuento de células
Pierce™ Kit de ensayo de proteínas BCA	Thermo Scientific	23225	para medir la concentración de proteínas en lisados celulares
Elevador de células	Fisher	07-200-364	para eliminar células de la placa
Tampón de lisis (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glicerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (inhibidores de proteasas y fosfatos según se desee)
10X TAE (1 L)			48.4 g Tris base 11.42 mL ácido acético glacial 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 a 1 L
4X SDD-AGE TAMPÓN DE CARGA (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL glicerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% azul de bromofenol 31 mL tampón de transferencia TBS ddH2O
(1 L)			20 mL 1 m Tris pH 7.4 30 mL 5 m NaCl 950 mL ddH2O
Tampón de lavado PBST (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4· 2H2O 24 g KH2PO4 añadir ddH2O a 10 L