Gene-dirigido mutagénesis al azar para seleccionar a mutantes de proteasoma desestabilizadoras de la heterocromatina en la levadura de fisión

Resumen

Este artículo describe una metodología detallada para la mutagénesis al azar de un gene de la blanco en la levadura de fisión. Por ejemplo, apuntamos rpt4 +, que codifica una subunidad del proteasoma 19S y defender para las mutaciones que desestabilizan la heterocromatina.

Resumen

Mutagénesis al azar de un gene de la blanco se utiliza comúnmente para identificar las mutaciones que producen el fenotipo deseado. De los métodos que pueden utilizarse para lograr la mutagénesis al azar, error-prone PCR es una estrategia conveniente y eficiente para la generación de un diverso grupo de mutantes (es decir., una biblioteca mutante). Error-prone PCR es el método de elección cuando un investigador intenta mutar una región previamente definida, como la región codificante de un gen dejando otras regiones genómicas inafectado. Después de que la biblioteca mutante se amplifica por PCR propensa a errores, debe ser clonado en un plásmido adecuado. El tamaño de la biblioteca generado por error-prone PCR está limitado por la eficiencia de la clonación del paso. Sin embargo, en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe, el paso de la clonación puede reemplazarse por el uso de una fusión de un solo paso muy eficiente PCR para generar construcciones para la transformación. Mutantes de fenotipos deseados pueden seleccionarse entonces usando reporteros apropiados. Aquí, describimos esta estrategia en detalle, tomando como ejemplo, un reportero insertado en centromérica de la heterocromatina.

Introducción

Genética directa es un método clásico en el que los investigadores buscan a mutantes naturales que muestran un fenotipo particular y realizan análisis genéticos. En la genética reversa, se introducen mutaciones en un gen de interés y se examina el fenotipo. En este último caso, mutagénesis al azar de un gene de la blanco se utiliza a menudo para generar un grupo de mutantes que son posteriormente seleccionados para fenotipos deseados, tales como sensibilidad de temperatura o altera la actividad enzimática. Diversos métodos pueden utilizarse para mutagénesis al azar, incluyendo error-prone PCR¹; De irradiación UV²; mutáge....

Protocolo

1. preparación de medios de

1. Preparar Extracto de levadura con suplementos (sí), sí sin adenina (Ade baja de sí), media de Pombe Glutamate (PMG¹²) y PMG sin adenina (Ade-PMG) mezclando los componentes como se describe en la tabla 1. SÍ-Ade (bajo Ade) y placas PMG-Ade tienen todos los mismos componentes, pero la adenina se omite de este último.
   1. Utilice el siguiente stock de sal (50 x): 52,5 g/L MgCl₂·6H₂O 2 g/L CaCl₂·2H₂O 50 g/L de KCl, 2 g/L Na₂para₄ en agua destilada. Filtro esterilice usando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm y almacenar a ....

Resultados

Los mutantes Rpt4 adquiridos siguiendo los procedimientos descritos en la figura 1 se pueden analizar mediante la evaluación de los colores de las colonias. Los colores de las colonias se han manchado en las placas correspondientes en la disminución de número de células en la figura 2. El reportero ade6 + insertado en la región de heterocromatina es silenciado en el tipo salvaje y colonias rojo muestra en la placa sí-Ade.......

Discusión

Mutagénesis al azar mediante error-prone PCR es una poderosa herramienta para la generación de un diverso grupo de mutantes en una región determinada. Esta técnica es especialmente útil para estudios que intentan evaluar la función de una proteína en una circunstancia específica. Por ejemplo, en el presente documento utilizamos error-prone PCR para evaluar la función de la subunidad del proteasoma 19S, Rpt4, en mantenimiento de heterocromatina. Variando la región dirigida por el error-prone PCR y ajustar las condiciones .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1. Medios
Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270-10KG
Extracto de levadura	BD Biosciences	212720
L-Leucina	JUNSEI	87070-0310
Sulfato de adenina	ACR	16363-0250
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
L-Histidina	Sigma-Aldrich	H8125
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1.05108.0050
NaCl	JUNSEI	19015-0350
MgSO4• 7H2O	Sigma-Aldrich	63140
CaCl2	Sigma-Aldrich	12095
Ftalato de potasio	Sigma-Aldrich	P6758-500g
Inositol	Sigma-Aldrich	I7508-50G
Biotina	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
Ácido Bórico	Sigma-Aldrich	B6768-1KG
MnSO4	Sigma-Aldrich	M7634-500G
ZnSO4• 7H2O	JUNSEI	83060-031
FeCl2• 4H2O	KANTO	CB8943686
Molibdato de sodio dihidratado	YAKURI	31621
KI	JUNSEI	80090-0301
CuSO4• 5H2O	YAKURI	09605
D-mio-inositol	MP biomédicos	102052
Pantotenato	YAKURI	26003
Ácido nicotínico	Sigma-Aldrich	N4126-500G
(NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Agarosa	Biobasic	D0012
G418, geneticina	LPS	G41805
2. Reacciones enzimáticas
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase	Aglient	600380	Para mutagénesis dirigida al sitio
GeneMorphII Kit de mutagénesis aleatoria	Aglient	200500	Para PCR propensa a errores
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad	Thermo Fisher	F-530L	Para PCR
de fusión Ex Taq  ADN polimerasa	Takara	RR001b	Para PCR general
BamH1	New England BioLabs	R0136S
Xho1	New England BioLabs	R0146S
Dpn1	New England BioLabs	R0176S
3. Equipo
Terciopelo cuadrado, negro	VWR	89033-116	Para réplica
Réplica de la herramienta de recubrimiento	VWR	25395-380	Para réplica
MicroPulsador Electroporador	Biorad	1652100	Para la transformación de levaduras de fisión
Cubetas de electroporación, espacio de 0,2 cm	Biorad	1652086	Para la transformación de levaduras de fisión
Termociclador	Bioer BYQ6078		para la reacción en rampa de PCR por fusión