Gene-dirigido mutagénesis al azar para seleccionar a mutantes de proteasoma desestabilizadoras de la heterocromatina en la levadura de fisión

Genética directa es un método clásico en el que los investigadores buscan a mutantes naturales que muestran un fenotipo particular y realizan análisis genéticos. En la genética reversa, se introducen mutaciones en un gen de interés y se examina el fenotipo. En este último caso, mutagénesis al azar de un gene de la blanco se utiliza a menudo para generar un grupo de mutantes que son posteriormente seleccionados para fenotipos deseados, tales como sensibilidad de temperatura o altera la actividad enzimática. Diversos métodos pueden utilizarse para mutagénesis al azar, incluyendo error-prone PCR¹; De irradiación UV²; mutágenos químicos, tales como Metanosulfonato de etilo (EMS) o ácido nitroso³; el uso de cepas mutator temporal, tales como sobre-expresando mutD5 ⁴; y barajado de ADN⁵.

Aquí, describimos una estrategia genética inversa en la cual utilizamos error-prone PCR para generar piscinas mutantes para un gen blanco en la levadura de fisión. Como uno puede imaginar por su nombre, este método genera mutaciones introduciendo deliberadamente errores durante el PCR. A diferencia de otros métodos de mutagénesis, error-prone PCR permite al usuario definir la región a ser mutagenized. Esto es particularmente útil en esfuerzos para estudiar la función de dominio y una proteína de interés.

Para demostrar este procedimiento mutagénesis al azar, en este documento utilizamos rpt4 +, que codifica la subunidad de proteasoma 19S, como un ejemplo. Rpt4 se ha demostrado que tienen funciones independientes de la proteólisis en organismos distintos de fisión levaduras^6,7,8,9, y un defecto en la proteólisis puede causar efectos indirectos mediante la alteración de las proteínas niveles. Nosotros, por lo tanto, para los mutantes que desencadenó cambios independientes de la proteólisis, con el objetivo de investigar la función del proteasoma en la heterocromatina.

Error-prone PCR puede aplicarse a cualquier región del gene de templar la situación en la que se unen los cebadores. Mutantes que exhiben el cambio fenotípico deseado pueden identificarse con los reporteros apropiados. Aquí, utilizamos un ade6 + reportero insertado en el centrómero 1 exterior repita (otr) región¹⁰. Heterocromatina constitutiva es formada en esta región¹¹, por lo que el reportero ade6 + está silenciado en la condición de tipo salvaje; Esto es indicado por las colonias rojo¹⁰. Una mutación que desestabiliza la heterocromatina constitutiva en el centrómero dará lugar a la expresión de la ade6 + reporter, que se visualiza como colonias blancas.

1. preparación de medios de

1. Preparar Extracto de levadura con suplementos (sí), sí sin adenina (Ade baja de sí), media de Pombe Glutamate (PMG¹²) y PMG sin adenina (Ade-PMG) mezclando los componentes como se describe en la tabla 1. SÍ-Ade (bajo Ade) y placas PMG-Ade tienen todos los mismos componentes, pero la adenina se omite de este último.
   1. Utilice el siguiente stock de sal (50 x): 52,5 g/L MgCl₂·6H₂O 2 g/L CaCl₂·2H₂O 50 g/L de KCl, 2 g/L Na₂para₄ en agua destilada. Filtro esterilice usando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C.
   2. Utilizar la vitamina siguiente (1, 000 x) stock: 10 g/L de ácido nicotínico, pantotenato de 1 g/L, biotina 10 mg/L en agua destilada, 10 g/L inositol. Filtro esterilice usando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C.
   3. Utilice el siguiente mineral (10, 000 x) stock: 5 g/L de ácido bórico, 4 g/L MnSO₄, 4 g/L ZnSO₄·7H₂O, 2 g/L FECLAS₂·4H₂O 0.4 g/L MoO₃, KI, 0.4 g/L CuSO₄·5H₂O de 1 g/L , 10 g/L de ácido cítrico en agua destilada. Filtro esterilice usando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C.
      Nota: Medio líquido sí puede realizarse omitiendo el agar.
2. Medio de autoclave y enfriar a continuación 60 ° C mientras revuelve con una barra de agitación, a una velocidad de 200 rpm.
3. Para las placas sí + G418 (geneticin), agregue solución 1 mL/L G418 al medio sí.
   1. Utilice el siguiente G418 (1, 000 x) stock: G418 100 mg/mL en agua destilada. Filtro de esterilización usando un filtro de tamaño de poro de 0.22 μm, alícuota a tubos de centrífuga de 1.5 mL y almacenar a-20 ° C.
4. Revuelva con otro 5-10 min y alícuota los medios platos de Petri de 90 mm (a 1 L de medio alícuotas a aproximadamente 40 placas de Petri. Almacenar las placas a 4 ° C.

2. clonación de rpt4 + y su 5' / 3' UTRs

1. Realizar la PCR con iniciadores p1 y p2 (figura 1A) usando la fisión levadura DNA genómico (gDNA) como la plantilla en un volumen total de 50 μl (~ 1 μg ADN, enzima de U 20, 1 x buffer de reacción), y aplicando los ciclos de reacción se describe en la tabla 2 para ampliar una base de 3.315 (bp) fragmento formado por rpt4 + y su 5' / 3' UTRs. Purificar el producto PCR utilizando un kit de purificación¹³ como lo indique el fabricante (figura 1A).
2. Digerir la de vector pBlueScript KS(-)¹⁴ y el fragmento de ADN amplificado con rpt4 + con sus 5' / 3' UTRs con BamH1 y Xho1 en un volumen total de 20 μl (~ 1 μg de ADN, 20 de U de enzima, tampón de digestión x 1) a 37 ° C en un baño de agua durante 16-18 h (figura 1B).
3. Gel purifica el vector digerido (gel de agarosa al 1,2%) e inserte el ADN por realizar la electroforesis en gel de agarosa TAE-basado (100 V, 1 h), suprimir las bandas de ADN de los tamaños deseados y aislar el ADN con una de kit de extracción de gel de¹⁵.
4. Ligar el vector y el inserto de ADN con ligase de la DNA de T4 mediante la realización de una reacción de la ligadura de 20 μl que contiene 50-100 ng del vector de la DNA, una ~ 3-fold exceso molar del ADN inserto y 400 U T4 ADN ligasa 1 x buffer de la ligadura. Incubar la mezcla a 18 ° C durante 16-18 h.
5. Transformar el ADN ligado en 100 μl de e. coli DH5α mediante la aplicación de choque térmico de 70 s a 42 ° C. Añadir 1 mL de LB e incubar 1 h a 37 ° C para la recuperación. Realizar la centrifugación (13.800 x g), descartar el sobrenadante, placa de la transformada de e. coli células en placas de LB-ampicilina (LA) e incubar a 37 ° C por 16 h.
6. Tomar 4-8 colonias con palillos de dientes y crecer durante la noche a 37 ° C en medio de 3 mL LA.
7. Aislar la plásmidos con un plásmido purificación kit¹⁶ utilizado según protocolo del fabricante y realizar análisis enzimático de la restricción digestiones con 5 μl del plásmido aislada, 5 U de cada enzima de restricción (BamH1 y Xho1) y 1 x de buffer de restricción. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C en un baño de agua durante 3 h. confirmar la clonación mediante la secuenciación de los plásmidos de candidato.

3. Introducción de la mutación silenciosa (sitio de la restricción deXho1 )

1. Diseño de un par de cartillas 33-bp (p3 y p4) que contienen la mutación deseada en la secuencia complementaria de lo contrario.
2. Realizar la polimerización en cadena con polimerasa de alta fidelidad¹⁷ (figura 1) en un volumen total de 25 μl (10 ng de plásmido clonado, 2 μl de 10 pmol cartilla mezcla, enzima U 2, 1 x buffer de reacción) utilizando los parámetros ciclismo enumerados en la tabla 3.
3. Digerir el plásmido de plantilla con DpnI en un volumen total de 20 μl (20 U enzima, tampón de digestión 1 x) a 37 ° C en un agua de baño para 1 h.
4. Transformar, propagar, aislar y secuenciar el plásmido que contiene la mutación silenciosa, como se describe en pasos de 2.5-2.7.
   Nota: La mutación silenciosa también puede introducirse mediante un método de clonación que permite la Unión de varios fragmentos de la DNA en una sola reacción¹⁸.

4. al azar mutagénesis de rpt4 + por Error-prone PCR

1. Realizar PCR propensa a errores, utilizando el plásmido con la mutación silenciosa (Xho1 sitio) como la plantilla, cartillas p5 y p6, un volumen total de 50 μl (la cantidad de plantilla definida en el paso 4.1.1, 2 μl de mezcla de cartilla de 10 pmol, enzima U 2.5, tampón de reacción x 1) , y una polimerasa especial que está diseñada para generar un error de alta velocidad¹⁹ (figura 1). Realizar PCR como se describe en la tabla 2.
   1. Utilizar 4-5 μg de plásmido de plantilla para controlar la frecuencia de mutación a 1 bp/kb (kilobases).
      Nota: Una alta concentración (> 500 ng/μL) del plásmido, que se puede obtener utilizando un kit de preparación mini-para el²⁰, se requiere.
2. Utilice gel de electroforesis para confirmar un producto PCR de 2670 bp (gel de agarosa al 1,2%). Gel purifica este producto PCR como se describe en el paso 2.5.

5. preparación de los fragmentos PCR de fusión (KAN, 3' UTR)

1. Realizar PCR utilizando pFA6a-KANMX6²¹ como plantilla, cartillas p7 y p8, y las condiciones enumeran en la tabla 4 para obtener el fragmento de marcador (KAN). Gel purifica el fragmento resultante de 1.480-bp como se describe en el paso 2.5 (Figura 1E).
   1. Compruebe si el codón del gen para la mutación y la región de la codificación de su gen adyacente están separados por más de 500 bp. El terminador endógeno no puede utilizarse cuando la región es inferior a 500 bp; algo, el terminador de ADH puede usarse en lugar del terminator endógena. Los cambios de protocolo necesarios para utilizar el terminador de ADH se presentan en la tabla 5.
      Nota: Estos cambios sólo se aplican cuando el terminador de la ADH , que está disponible en el plásmido pFA6a-3HA-KANMX6, se utiliza en lugar del terminator endógena.
2. Realizar la PCR con la clonada rpt4 +-que contiene el vector como la plantilla y las cartillas p9 y p10 en un volumen total de 50 μl (20 ng de plásmido clonado, 2 μl de 10 pmol cartilla mezcla, enzima U 2, 1 x buffer de reacción), utilizando las condiciones presentadas en el cuadro 6. Gel purifican obtenidos 506 bp 3' UTR fragmento (Figura 1E).

6. generación de la construcción de la transformación por fusión PCR (Figura 1E)

1. Preparar los 3 fragmentos (mutagenized rpt4 +, KAN y el 3' UTR) a 50 ng/μl.
2. Realizar fusión que polimerización en cadena de los tres fragmentos utilizando primers p11 y p12, tal como se describe en la tabla 7. (El protocolo de fusión PCR es una modificación del protocolo original²²). Purificar el producto PCR de 4.398-bp principales.
   1. Utilice rpt4 +: KAN:3'UTR fragmentos en una proporción de 1:3:1 para obtener resultados óptimos.
      Nota: La cantidad total de ADN inserto no debe exceder 500 ng. La cantidad recomendada de rpt4 +: KAN:3'UTR es de 50 ng de ng:50 de ng:150. La región mutagenized es aproximadamente 1,6 kb, por lo que el número mínimo de colonias de levaduras que se representan todas las combinaciones posibles de cada base se mutó a los otros tres es 1.600 x 3 = 4.800 colonias. Debido a una reacción de transformación produce típicamente 400-500 colonias, por lo menos 10 reacciones digno de fusión PCR construir es necesario. Esta necesidad puede satisfacerse simplemente aumentando la cantidad de reacción (es decir, el número de tubos PCR) por un factor de diez.

7. transformación de la levadura de fisión por electroporación (Figura 1F)

1. Inocular la levadura a 10 mL de medio sí saturación por incubar durante más de 16 h.
2. Diluir las células a una densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) de 0.2 en 200 mL de sí medio e incubar a 30 ° C con agitación durante 5-6 h, para OD₆₀₀ = 0.6 - 0.8.
3. Concentrar las células OD₆₀₀ = 30, dispensar a cuatro tubos cónicos de 50 mL y enfriar en hielo durante 10 minutos.
4. La cosecha de las células mediante la realización de centrifugación a 1.050 x g durante 3 min a 4 ° C. Coloque los tubos y cubetas de electro 10 en hielo. Realice los pasos 7.3-7.8 en hielo.
5. Deseche el sobrenadante y añadir 15 mL de sorbitol de 1,2 M. Agitar suavemente los tubos para resuspender las células.
6. Centrifugar las células a 1050 x g durante 3 min a 4 ° C.
7. Repita los pasos 7.4 y 7.5. Deseche el sobrenadante. Añadir 500 μl de sorbitol de 1.2 M a cada tubo, resuspender las células y recoger todas las células en un tubo cónico de 15 ml.
8. Añadir sorbitol M 1,2 a 2,4 mL (OD₆₀₀ = 10 por 0,2 mL). Mantenga el tubo en hielo.
9. Añadir 200 μL de células suspendidas de sorbitol (Asegúrese de que se suspenden completamente) a un tubo de EP que contiene la fusión PCR construir, mezclar bien y transferir la muestra a una cubeta de electro.
10. Electroporate las células con las siguientes opciones: hongos, ShS (2.00kV, 1 pulso).
11. Añadir 600 μl de 1,2 M sorbitol a cada cubeta de electro para un volumen total de 800 μl y luego las células en sí cuatro platos (200 μl/placa). Diez cubetas de electro dispensará a 40 sí las placas.
12. Incubar las placas a 30 ° C durante 24 h.
13. Realizar placas réplica a sí + G418 e Incube las placas a 30 ° C durante 3 días.

8. selección de mutantes desestabilizadoras de heterocromatina y comprobación de falsos positivos

1. Para cada placa sí + G418, realizar chapado en réplica a sí-Ade (bajo Ade) y placas PMG-Ade (No Ade). Incubar las placas de réplica durante 1-2 días a 30 ° C, hasta que algunas de las colonias en las placas Ade sí muestran una coloración roja (figura 1).
2. Comparar placas sí-Ade y PMG-Ade y seleccionar las células que muestran color rosa o blanco en la placa sí-Ade y también crecen en la placa de PMG-Ade. No seleccione colonias sin crecimiento en PMG-Ade, ya que son falsos positivos (por ejemplo, lo que refleja que el cassette de KAN se ha integrado en un sitio de destino no en otros lugares en el genoma).
3. Recoger aproximadamente 1 x 10⁵ células de cada colonia e incuban en 10 μl de solución SPZ que contiene 2,5 mg/mL zymolyase 100 T a 37 ° C durante al menos 30 min uso 1 μl de esta solución como la plantilla inicial para Colonia PCR (figura 1 H).
   1. Hacer los SPZ (50 mL) mezclando 30 mL de sorbitol de 2 M, 4,05 mL de 1 M de Na₂HPO₄, 0,95 mL NaH₂PO₄ y 15 mL de agua destilada (pH final, 7.5). Muestras (5 mL) pueden ser complementadas con zymolyase y almacenar en alícuotas de 500 μl a-20 ° C hasta su uso.
4. Realizar la electroforesis en gel (gel de agarosa al 1.2%, 180V, 20 min) para visualizar los resultados de + la Colonia PCR. Seleccione las reacciones que exhiben bandas PCR del tamaño adecuado y digestión 5 μl de cada producto de la reacción con XhoI (4 U enzima, tampón de digestión x 1, baño de agua de 37 ° C, 1 h) para descartar falsos positivos (figura 1 H).
5. Realizar la electroforesis en gel para visualizar los resúmenes XhoI (gel de agarosa 1.2%, 180 V, 20 min). Marque las colonias cuyos productos PCR se cortan por XhoIy parche a las placas sí + G418 (figura 1I).
6. Aislar gDNA de las células de la levadura de fisión y realizar la secuencia de los productos PCR²³. Comparar la secuencia obtenida con la secuencia wild type para identificar mutaciones (figura 1I).
7. Directamente volver a introducir la mutación a las células de tipo salvaje transformándolos con fusión construcciones amplificadas por PCR de las células mutantes²³. Utilice manchado para confirmar el fenotipo de las células mutantes recién hechas (Figura 1J).
   1. Fusión transformación construcción puede ser fácilmente amplificada por PCR con iniciadores p1 y p10 usando la DNA genomic de mutantes como la plantilla en un volumen total de 50 μl (~ 1 μg ADN, enzima de U 20, 1 x buffer de reacción) y la aplicación de los ciclos de reacción se describe en tabla 2 . Transformación de la construcción se puede hacer siguiendo los pasos 7.1-7.13.

Los mutantes Rpt4 adquiridos siguiendo los procedimientos descritos en la figura 1 se pueden analizar mediante la evaluación de los colores de las colonias. Los colores de las colonias se han manchado en las placas correspondientes en la disminución de número de células en la figura 2. El reportero ade6 + insertado en la región de heterocromatina es silenciado en el tipo salvaje y colonias rojo muestra en la placa sí-Ade. Una vez que la heterocromatina está desestabilizada y el reportero ade6 + se expresa, colonias blancas pueden observarse en la placa sí Ade como mutante de clr4Δ . El blindado Rpt4 mutantes son como se muestra. rpt4-1 mutante muestra la más severa desestabilización de heterocromatina.

Figura 1 : Representación esquemática del protocolo. (A) representación esquemática de los productos PCR obtenidos por la primera ronda de PCR, que se realiza con las cartillas 1 y 2. (B) basado en la restricción de clonación del fragmento rpt4 + . (C) mutagénesis sitio-dirigida del vector clonado se utiliza para introducir una mutación silenciosa que agrega un sitio de restricción XhoI . (D) mutagénesis al azar del rpt4 + región de codificación se realiza mediante PCR propensa a errores. (E) mutado rpt4 + fragmento, el fragmento de KAN y el fragmento 3' UTR se unen por fusión polimerización en cadena para generar una cinta preparada para transformación. (F) células de la levadura de fisión se transforman con la fusión construcción PCR, que sustituye a la secuencia endógena rpt4 + por recombinación homóloga. (G) colonias seleccionadas de KAN son réplica plateada a sí-Ade (bajo Ade) y placas PMG-Ade (No Ade), y se seleccionan las colonias positivas. (H) PCR y posterior restricción XhoI del producto PCR se utilizan para evitar falsos positivos. (I) se identifica la mutación que causa el fenotipo por parches de las colonias, propagación de las células, extracción de DNA genómico (gDNA) y la secuencia de la porción pertinente de rpt4 +. (J) las mutaciones causativas se confirman (y se descartan los falsos positivos) introduciendo directamente la mutación a las células de tipo salvaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Mutantes de la represión de la heterocromatina de Rpt4. Diagrama esquemático de la periodista de otr1::ade6 + (superior). 5-fold diluciones seriadas de seleccionar blindado Rpt4 mutantes fueron avistadas sobre las placas indicadas en orden creciente de nivel de desestabilización de la heterocromatina (abajo). Esta figura fue modificada de un artículo de 'el proteasoma 19S está directamente implicado en la regulación de la heterocromatina en levadura de la fisión ' por Seo et al., 201724. La figura recortada no se puede encontrar en el artículo original. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Componentes de YES y placas PMG

Tabla 2. Recomendado programa PCR para la mutagénesis sitio-dirigida

Tabla 3. Recomendado programa PCR para error-prone PCR

Tabla 4. Recomienda el programa PCR para obtener el fragmento de KAN

Tabla 5. Cambios necesarios cuando el terminador de ADH se utiliza en lugar del terminator endógena

Tabla 6. Recomienda el programa PCR para obtener el fragmento 3' UTR

Tabla 7. Recomendado programa PCR para la fusión PCR

Tabla S1: Cepa utilizada en este estudio

Cuadro S2: Lista de los primers utilizados en este estudio

Los autores no tienen nada que revelar.