Integrar imágenes de citometría de flujo y transcriptómicos perfilado para evaluar trata de CD1d endocíticas alterada

Summary

Imágenes de citometría de flujo proporciona un enfoque ideal para detectar la alteración morfológica y funcional de las células a nivel individual y poblacional. Alteración función endocíticas para la presentación de antígeno lípido en las células dendríticas humanas expuestas al contaminante se demostró con un combinado transcriptómicos de perfiles de expresión génica y manifestación morfológica de la proteína trata.

Abstract

Análisis poblacionales de la alteración morfológica y funcional de proteínas endocíticas son difíciles debido a la demanda de captura de la imagen en un análisis estadístico y nivel de la imagen de unicelular a nivel poblacional. Para superar esta dificultad, utilizamos imágenes de citometría de flujo y transcriptómicos perfiles (RNA-seq) para determinar localización subcelular alterado del grupo de proteínas de 1d de diferenciación (CD1d) asociado con expresión génica endocíticas deteriorada en humanos las células dendríticas (DCs), que fueron expuestas a la común lipofílico aire agente contaminador benzo [a] pireno. La colocalización de CD1d y proteínas endocíticas marcador Lamp1 de miles de imágenes celular con citometría de flujo de imagen fue analizada usando IDEAS y ImageJ-Fiji programas. Numerosas imágenes de celulares con proteínas Co teñidas de CD1d y Lamp1 fueron visualizados después de bloquear el CD1d⁺Lamp1⁺ DCs con IDEAS. La colocalización CD1d y Lamp1 mejorada sobre BaP exposición quedó demostrada además con thresholded diagramas de dispersión, probado con coeficientes de Mander de intensidad Co localizada y trazado basado en el porcentaje de áreas Co localizadas con ImageJ-Fiji. Nuestros datos proporcionan un enfoque instrumental y bioinformáticas ventajoso para medir la colocalización de proteínas a nivel celular individual y poblacional, apoyar un resultado funcional deterioro de transcriptómicos alteración en humanos expuestos a contaminantes DCs.

Introduction

Presentación del antígeno implica típicamente la proteína intracelular trata de personas, que se ha investigado a menudo mediante caracterización morfológica y fenotípica mediante perfiles del antígeno que presenta las células^1,2,3 . Para integrar las ventajas de la proyección de imagen y métodos phenotyping, describimos una plataforma de análisis imágenes a nivel de la población para demostrar una colocalización de proteínas alteradas en células dendríticas humanas (DCs) y unicelular. En la presentación del antígeno del peptide, complejo principal de histocompatibilidad (MHC....

Protocol

Protocolos de humanos en este estudio fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Cincinnati y se realizaron todos los métodos de las normas y directrices pertinentes. Se obtuvieron muestras de sangre de donantes sanos desde el centro de sangre de centro en centro médico de la Universidad de Cincinnati.

1. transcriptómicos perfiles de expuestos a contaminantes derivados de monocitos humanos DCs

1. Extracción de RNA total de DCs BaP-expuesto
   1. Diferenciar DCs humanas mediante citocinas GM-CSF e IL-4 y expuestos DCs BaP durante 4 días¹³.
   2. Tipo DCs BaP expuestos me....

Results

Los contaminantes lipofílicos BaP alteran racimos gene endocíticas en humanos DCs. humanos derivados de monocitos DCs de cada donante (n = 3) fueron incubadas con BaP y ordenados para DCs convencionales, que además fueron utilizadas para extracción y transcriptómicos análisis del ARN como se describe . Sobre la normalización de la expresión génica, genes alterados entre los grupos BaP expuestos y no expuestos fueron agrupados según la correlación funcional de genes diferencialmente expres.......

Discussion

Funcional confirmación de un camino del gene alterado es un reto, debido a la expresión de genes ampliamente afectado con múltiples vías y la dificultad para integrar actividades celulares individuales y poblacionales. Empleamos imágenes flujo cytometry específicamente prueba CD1d trata de compartimentos endocíticos. Citometría de flujo de imágenes integra la medición poblacional de las células y la demostración individual de colocalización subcelular de proteínas múltiples. La microscopia confocal ha proporcionado previ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transcriptómica	Illumina	HiSeq 2500 v4	Sistema Illumina HiSeq
ImagingStream X	Millipore	100220	Citometría de flujo
de imágenes mirVana Kit de aislamiento de miRNA Thermo	Fisher		Extracción de ARN total
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent		control de calidad de ARN total
Veriti Termociclador rápido de 96 pocillos Thermo	PCR de Fisher		, reacción enzimática
NEBNext Módulo de aislamiento magnético de ARNm Poly(A)	Purificación de ARN PolyA	New England Biolab
Sistema automatizado SMARTer Apollo Purificación de	ARN PolyA	Takara
NEBNext Ultra Kit de preparación de bibliotecas para Illumina Preparación de	la biblioteca	New England Biolab
Perlas magnéticas Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter
2100 Bioanalyzer	Agilent		Library QC, análisis de distribución de tamaños
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent			Library QC, análisis de distribución
de tamaños Sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 5 (Thermo Fisher)	Cuantificación de la biblioteca	Thermo Fisher
NEBNext Library Quant Kit	England Biolab		Library
Generación	clústeres de la biblioteca	cBot Illumina
TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS	Illumina		Library cluster generation
HiSeq 1000	Illumina		Sequencing
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 ciclos)	Illumina	Sequencing Ficoritrina
	Legend	L161
PE-anti-ratón IgG2b	Bio Legend	51.1
Alexa Fluor 647 (AF647)	Bio Legend	CD107a(H4A3)