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Artículo de método

Integrar imágenes de citometría de flujo y transcriptómicos perfilado para evaluar trata de CD1d endocíticas alterada

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DOI:

10.3791/57528

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29 de octubre de 2018

 ,  , 
1Department of Environmental Health, University of Cincinnati College of Medicine

En este artículo

Resumen

Imágenes de citometría de flujo proporciona un enfoque ideal para detectar la alteración morfológica y funcional de las células a nivel individual y poblacional. Alteración función endocíticas para la presentación de antígeno lípido en las células dendríticas humanas expuestas al contaminante se demostró con un combinado transcriptómicos de perfiles de expresión génica y manifestación morfológica de la proteína trata.

Resumen

Análisis poblacionales de la alteración morfológica y funcional de proteínas endocíticas son difíciles debido a la demanda de captura de la imagen en un análisis estadístico y nivel de la imagen de unicelular a nivel poblacional. Para superar esta dificultad, utilizamos imágenes de citometría de flujo y transcriptómicos perfiles (RNA-seq) para determinar localización subcelular alterado del grupo de proteínas de 1d de diferenciación (CD1d) asociado con expresión génica endocíticas deteriorada en humanos las células dendríticas (DCs), que fueron expuestas a la común lipofílico aire agente contaminador benzo [a] pireno. La colocalización de CD1d y proteínas endocíticas marcador Lamp1 de miles de imágenes celular con citometría de flujo de imagen fue analizada usando IDEAS y ImageJ-Fiji programas. Numerosas imágenes de celulares con proteínas Co teñidas de CD1d y Lamp1 fueron visualizados después de bloquear el CD1d+Lamp1+ DCs con IDEAS. La colocalización CD1d y Lamp1 mejorada sobre BaP exposición quedó demostrada además con thresholded diagramas de dispersión, probado con coeficientes de Mander de intensidad Co localizada y trazado basado en el porcentaje de áreas Co localizadas con ImageJ-Fiji. Nuestros datos proporcionan un enfoque instrumental y bioinformáticas ventajoso para medir la colocalización de proteínas a nivel celular individual y poblacional, apoyar un resultado funcional deterioro de transcriptómicos alteración en humanos expuestos a contaminantes DCs.

Introducción

Presentación del antígeno implica típicamente la proteína intracelular trata de personas, que se ha investigado a menudo mediante caracterización morfológica y fenotípica mediante perfiles del antígeno que presenta las células1,2,3 . Para integrar las ventajas de la proyección de imagen y métodos phenotyping, describimos una plataforma de análisis imágenes a nivel de la población para demostrar una colocalización de proteínas alteradas en células dendríticas humanas (DCs) y unicelular. En la presentación del antígeno del peptide, complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase I moléculas un péptido corto (8-10 residuos) se unen en el retículo endoplásmico para activar convencional CD8 células+ T, mientras que las moléculas de MHC clase II unen un relativamente largo péptido (~ 20 residuos) en compartimentos endocíticos activar convencionales CD4+ T las células1,4. Por el contrario, lípidos específicos de células T son activadas por proteínas CD1 con antígenos de lípidos cargados principalmente en compartimentos endocíticos5,6. Presentación del antígeno lípido requiere el suministro de metabolitos de lípidos producidos en lípidos metabolismo7,8,9,10 y la carga de metabolitos de lípidos funcionales a las proteínas CD1 en compartimentos endocíticos5,6. En este contexto, varios factores celulares modulando la presentación del antígeno lipídico, especialmente en la exposición ambiental de contaminantes lipofílicos y trastornos del sistema inmune, son críticos para definir. En este estudio, se utilizan análisis transcriptómico, perfiles de imagen y análisis de imagen celular y poblacional de DCs derivados de monocitos humanos para determinar el tráfico de proteínas endocíticas que contribuyen a la presentación del antígeno lípido en la exposición de contaminantes. Ciertamente, esta plataforma combinada puede aplicarse al estudio de tráfico de proteínas subcelulares y colocalización en diferentes procesos biológicos.

Técnicamente, la localización subcelular de la proteína fue demostrada generalmente usando microscopia confocal y analizados estadísticamente en un número limitado de células detectado1,2,3,11. Por otra parte, citometría de flujo ha sido ampliamente aplicada a poblaciones de la célula de la puerta con señales Co teñidas de múltiples proteínas en un nivel celular12; sin embargo, esto carece de una visualización detallada de colocalización de proteínas subcelulares. Para lograr el análisis integrales y estadísticos de porcentaje colocalización de proteínas a nivel celular y población, incorporamos enfoques de perfiles y análisis para determinar las características de la colocalización de la proteína con biológicos la proyección de imagen relevancia. Específicamente, utilizamos proyección de imagen de citometría de flujo para detectar la colocalización de CD1d y proteína de la membrana lisosomal asociada 1 (Lamp1) proteínas en este estudio. Análisis cuantitativo de moléculas colocalized era previamente difícil de realizarse a escala poblacional. En este estudio, adaptó el programa ImageJ-Fiji examinar el porcentaje de colocalización de proteínas con un gran número de células Co nivel celular tanto poblacional como individual. En concreto, hemos medido áreas Co localizadas, intensidad y tamaño poblacional para apoyar la conclusión de que la proteína de CD1d en gran parte se mantuvo en compartimentos endocíticos finales de humanos DCs en la exposición a un contaminante lipofílico benzo [a] pireno (BaP)13 . Este combinado celular y población de análisis proporcionan resultados altamente reproducibles, integrales y estadísticamente significativos de CD1d-Lamp1 colocalización correspondiente a la presentación del antígeno lípido inhibido.

El transcriptoma de DCs humanos expuestos al BaP apoya firmemente la hipótesis de que lípidos endocíticas y CD1d endocíticas tráfico fueron deterioradas en exposición de BaP. Para probar esta hipótesis, aplicamos imagen flujo cytometry Profile a las imágenes de la población de DC que co fueron manchadas con múltiples proteínas incluyendo CD1d, marcadores endocíticos y DC. Por último, co células se analizaron estadísticamente para demostrar el porcentaje de intensidad y zonas de CD1d y Lamp1 colocalización.

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Protocolo

Protocolos de humanos en este estudio fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Cincinnati y se realizaron todos los métodos de las normas y directrices pertinentes. Se obtuvieron muestras de sangre de donantes sanos desde el centro de sangre de centro en centro médico de la Universidad de Cincinnati.

1. transcriptómicos perfiles de expuestos a contaminantes derivados de monocitos humanos DCs

  1. Extracción de RNA total de DCs BaP-expuesto
    1. Diferenciar DCs humanas mediante citocinas GM-CSF e IL-4 y expuestos DCs BaP durante 4 días13.
    2. Tipo DCs BaP expuestos mediante citometría de flujo basado en los marcadores superficiales expresados (linaje–HLA-DR+), la mayoría de los cuales consiste en DCs convencionales (CD11c+CD1c+)13. Por lo general, ordenar 10.000 DCs en medio de cultivo con 10% FBS, Centrifugue DCs a 600 x g y 4 ° C durante 6 minutos y retire inmediatamente el sobrenadante por aspiración utilizando una pipeta de 1 mL.
    3. Una vez retirado el sobrenadante por aspiración, lyse el precipitado de células mediante la adición de 0,4 mL de tampón de lisis/atascamiento del kit de aislamiento de RNA para el almacenaje de-80 ° C antes de la extracción de RNA.
    4. Utilice el kit de aislamiento de RNA con el protocolo de extracción de RNA total para extraer el RNA total14. Medir la integridad del RNA usando un equipo Bioanalyzer15.
  2. Análisis transcriptómico de DCs ordenadas (figura 1A)
    1. Preparar la biblioteca usando un kit de preparación de la biblioteca de RNA RNA-seq. En Resumen, fragmento del RNA aislado de poly-A (~ 200 bp), retroceso transcribir los fragmentos a la 1 º hebra de cDNA y seguir por la segunda síntesis de cDNA de filamento con dUTP.
    2. Ligar el cDNA de doble cadena al adaptador con una estructura de lazo del vástago después de la purificación de grano, reparación final y dA seguimiento. Suprimir los residuos de uracilo en el filamento 2 del cDNA y el adaptador de bucle con enzima de usuario (Uracil-específicas supresión reactivo) para mantener la especificidad de la cadena y abrir el bucle adaptador para PCR.
      1. Realizar 13 ciclos de PCR usando las cartillas universales y específicas de índice para enriquecer la biblioteca indexada. Limpieza de la biblioteca y ejecuta en un chip de equipo Bioanalyzer ADN de alta sensibilidad para comprobar la calidad de biblioteca y distribución del tamaño.
    3. Utilice un kit de cuantificación de la biblioteca y un sistema PCR en tiempo real combinado con información de tamaño de la biblioteca para calcular concentración de biblioteca a través de un método de la curva estándar.
    4. Proporcional piscina bibliotecas compatibles individualmente indexadas y ajustar la concentración total final a 15 pM. Realizar la generación del cluster de biblioteca y la biblioteca en un entorno de lectura solo 1 x 50 bp para generar 25 millones lecturas por muestra la secuencia.
  3. Secuencia
    1. Carga la secuenciación e indexación reactivos a los estantes el reactivo SBS y PE, respectivamente. Colocar los reactivos en un baño de agua grado laboratorio para 1 h hasta que el hielo se haya derretido y los reactivos en cada tubo de botella se mezclan correctamente.
    2. Preparar la mezcla ICB añadiendo la enzima descongelada de tinte y -20 ° C a la botella y mezclar. Preparar una solución de NaOH según las instrucciones de la secuencia. Coloque todos los reactivos a 4 º C hasta que esté listo para usar.
    3. Durante 1 h en espera, energía en el secuenciador. Espere para que DONOTEJECT y conectar el ordenador a una unidad de red.
    4. Ejecute el software de control del secuenciador.
    5. Preparar 2 L de solución de lavado de mantenimiento que contiene 0,5% de Tween 20 y 0.03% ProClin 300 grado laboratorio en agua.
    6. En el estante el reactivo SBS, añadir ~ 100 mL de solución de lavado mantenimiento a cada una de las 8 botellas, embudo de tapones a las botellas. En el estante el reactivo PE, añadir ~ 12 mL de solución de lavado mantenimiento a cada uno de los diez tubos cónicos de 15 mL y desechar los tapones.
    7. Racks de carga los dos con la solución llenaron de botellas y tubos para el secuenciador.
    8. En el software de control del secuenciador, elija la lavado de mantenimiento; Siga las instrucciones en pantalla para limpiar el sistema secuenciador del líquido hasta que se complete el proceso.
    9. Iniciar un nuevo funcionamiento en la pestaña de "Secuencia" del software; directa de los datos de salida a una unidad de red. Seleccione parámetros para leer solo 1 x 50 bp con bibliotecas de índice único multiplexado.
    10. Opcionalmente, inicie sesión en el centro de la secuencia de BaseSpace para que el estado de la secuencia puede controlarse remotamente a través de un ordenador o teléfono inteligente.
    11. Subir una hoja de muestra para demultiplexar y proporcionar información de reactivo según el requisito de software.
    12. Carga de reactivos SBS y del PE para el secuenciador. Cebe el sistema con una celda de flujo utilizado (~ 15 min).
    13. Una vez completada la generación del cluster (~4.5 h), sacar la celda de flujo, rocíe ligeramente la celda de flujo con agua y limpie lo seque con papel de lente. Ligeramente rocíe la celda de flujo con etanol al 95% y limpíelo seco. Cotejar con una luz para asegurarse de que la superficie esté limpia sin restos o residuos de sal.
    14. Después de que el primer paso es completa, la célula de flujo agrupado de carga y comenzar la secuenciación. Automáticamente se iniciará el software visor de análisis de secuencia.
    15. Monitorear la calidad de datos de secuenciación mediante SAV incluyendo densidad de cluster, Lee filtro, cluster pase filtro %, % ≥Q30, % de fase/profase de legado, indexación, control de calidad, etc. que esto ayuda a entender la calidad de los datos y solucionar problemas.
    16. Cambiar la Junta de la célula de flujo y realizar un lavado de mantenimiento después de completa la secuencia. El secuenciador está listo para la siguiente ejecución.
  4. Análisis Bioinformático
    1. Realizar bioinformática RNA-seq datos análisis13.

2. vía análisis de los perfiles transcriptómicos (figura 1B)

  1. Utilizar bordeadora Bioconductor para comparar cuentas de intensidad de expresión gen resultante entre DCs BaP expuestos y no expuestos de tres donantes. Luego, identificar genes diferencialmente expresados entre DCs BaP expuestos y no expuestos, basados en el cambio de doble absoluta (> 2 pliegues) y el descubrimiento de falsos valores (FDR) - ajustado p- la tarifa (< 0.05).
  2. Para predecir los grupos funcionales de diferencialmente expresados genes, utilice el paquete de software ToppCluster para buscar los genes alterados contra varias bases de datos incluyendo KEGG y REACTOME y generar datos de clustering. ToppCluster utiliza la prueba hipergeométrica para obtener enriquecimiento funcional mediante el gen lista enriquecimiento análisis16.
  3. Entrada adicional de los resultados de estos grupos de función a Cytoscape17,18 versión 3.3.0, una plataforma de software de código abierto ampliamente utilizado para la visualización de redes complejas. Así, los genes implicados en diferentes grupos o vías, incluyendo clusters endocíticas y metabolismo de los lípidos, se muestran en una red con anotación de color del doblez medio cambio de gene expresión (figura 1B)13.

3. proyección de imagen de citometría de flujo de CD1d y colocalización Lamp1

  1. Anticuerpo etiquetado de DCs BaP-expuesto
    1. Exponer 0.5 x 106 DCs humanos 5,94 mM BaP durante 4 días a 37 ° C en 2 mL de completa Dulbecco medio modificado Eagle. La cosecha DCs por centrifugación a 400 x g durante 10 min bloque DCs diferenciadas por incubar las células con bloqueador de suero humano y anticuerpos anti-humanos Fc durante 10 min en hielo, incluyendo anticuerpos CD16, CD32 y CD64 humanos.
    2. Incubar violeta brillante 421-anti-CD1c (L161), ficoeritrina/Cianina tinte 7 (PE/Cy7) - anti - HLA-DR y PE/Cy5-anti-CD11c con DCs por 20 min en hielo. La tabla 1 muestra esta lista de anticuerpos.
    3. Fijar DCs con paraformaldehído al 4% en PBS y permeabilizar con tampón de lavado de permeabilización. Realizar la tinción intracelular con una mezcla de PE con la etiqueta purificada humana CD1d (51.1) y Alexa Fluor 647-labeled anti-Lamp1 (CD107a) (H4A3).
  2. Medida de la citometría de flujo (figura 2) la proyección de imagen
    1. Analizar las muestras teñidas utilizando un citómetro de flujo de imágenes en la base de cytometry del flujo del Hospital infantil de Cincinnati con un objetivo de X 40 a 300 píxeles para una celda con alrededor de 10 mm de diámetro. Tamaño de un píxel es aproximadamente de 0,5 mm por 0.5mm del objeto.
    2. Adquirir 10.000 imágenes celulares de una manera imparcial según las instrucciones del fabricante.

4. proyección de imagen de análisis de imágenes de citometría de flujo

  1. Análisis de colocalización utilizando el software de IDEAS (figura 2)
    1. Realizar la compensación con teñido solo versus muestras no manchado por ajuste de la intensidad de fluorescencia de las muestras no manchado por debajo del umbral, incluyendo manchado no expuestos al BaP DCs con autofluorescencia BaP, como datos de citometría de flujo rutinario Análisis.
    2. Puerta de tinción de células para obtener los conjuntos de HLA-DR-+CD11c+CD1d+Lamp1+ las células (figura 2A) y mostrar imágenes celulares en los subconjuntos cerrados (figura 2B).
    3. Guardar celular imágenes en png formato basado en dos criterios de inclusión técnica, la presencia visual de señales Co manchas fuertes y localización subcelular de las proteínas de CD1d y Lamp1, para el análisis de colocalización con ImageJ-Fiji (figura 2B).
  2. Utilice el software ImageJ-Fiji para realizar análisis de colocalización (figura 3).
    1. Prepare los archivos de imagen de entrada por la fusión de las 100 imágenes de celulares guardados para DCs humanos no expuestos y expuestos al BaP, respectivamente (Figura 3A).
    2. Analizar CD1d (rojo) y Lamp1 colocalización (verde) utilizando un diagrama de dispersión.
      1. Ejecute el programa ImageJ-Fiji. Abra el archivo .png con 100 imágenes de la célula ( Figura 4Ayfigura 3B ): "archivo | Abrir".
      2. Dividir la imagen con los canales rojos y verdes combinados en dos imágenes con un rojo o un canal verde: "imagen | Color | Dividir canales".
      3. Dibujar un diagrama de dispersión usando los comandos "analizar | Colocalization | Umbral de colocalización". Guardar el diagrama de dispersión con la tecla "ImprPant" .
    3. Calcular coeficientes de colocalización de Mander para cada imagen de celular solo (n = 100) (Figura 4B)
      1. Seleccionar una imagen de célula en el archivo de imagen con canales de split con el "Oval" herramienta de selección.
      2. Utilice los comandos "analizar | Colocalization | Umbral de colocalización". Seleccione el "Canal 1" en el cuadro de diálogo de la región de interés (ROI). Mantener todas las opciones de cálculo incluyendo "Mander utilizando umbrales" para cada imagen de la célula.
      3. Repetir este cálculo para todas las imágenes de 100 células.
      4. Guardar y abrir los resultados utilizando una hoja de cálculo.
      5. Parcela el promedio y error estándar para los "Coeficientes de Mander thresholded" (n = 100, 0 significa no colocalización y 1 colocalization perfecto). Utilizar la prueba t de Student para calcular el valor de p para la comparación entre grupos BaP expuestos y no expuestos (Figura 4B).
    4. Calcular el porcentaje de intensidad de pixel thresholded Co localizado entre CD1d y Lamp1 para varias imágenes de la célula (n = 100) (figura 4).
      1. Utilice el mismo protocolo de análisis en 4.2.3 y además seleccionar la opción resultado del "% de intensidad por encima del umbral colocalized".
      2. Realizar este análisis junto con coeficientes de colocalización de Mander.
      3. Parcela del mismo modo el promedio y error estándar para la intensidad % colocalized entre CD1d y Lamp1. Utilizar la prueba t de Student para calcular el valor de p para la comparación entre grupos BaP expuestos y no expuestos (figura 4).

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Resultados

Los contaminantes lipofílicos BaP alteran racimos gene endocíticas en humanos DCs. humanos derivados de monocitos DCs de cada donante (n = 3) fueron incubadas con BaP y ordenados para DCs convencionales, que además fueron utilizadas para extracción y transcriptómicos análisis del ARN como se describe . Sobre la normalización de la expresión génica, genes alterados entre los grupos BaP expuestos y no expuestos fueron agrupados según la correlación funcional de genes diferencialmente expres...

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Discusión

Funcional confirmación de un camino del gene alterado es un reto, debido a la expresión de genes ampliamente afectado con múltiples vías y la dificultad para integrar actividades celulares individuales y poblacionales. Empleamos imágenes flujo cytometry específicamente prueba CD1d trata de compartimentos endocíticos. Citometría de flujo de imágenes integra la medición poblacional de las células y la demostración individual de colocalización subcelular de proteínas múltiples. La microscopia confocal ha proporcionado previ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

Los autores agradecen a Roberto Giulitto (centro de sangre de centro) para las muestras de sangre humana y Lee Dr. Liang Niu para la normalización de la expresión génica. También agradecemos a Beca apoyo del nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (ES006096), centro ambiental genética (CEG) un proyecto piloto (S.H.), Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (AI115358) (S.H.), Universidad de Premio del Consejo de investigación de la Universidad de Cincinnati (S.H.) y Universidad de Cincinnati College de medicina mejora financiación básica (X. Z.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
TranscriptómicaIlluminaHiSeq 2500 v4Sistema Illumina HiSeq
ImagingStream XMillipore100220Citometría de flujo
de imágenes mirVana Kit de aislamiento de miRNA ThermoFisherExtracción de ARN total
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilentcontrol de calidad de ARN total
Veriti Termociclador rápido de 96 pocillos Thermo PCR de Fisher, reacción enzimática
NEBNext Módulo de aislamiento magnético de ARNm Poly(A) Purificación de ARN PolyANew England Biolab
Sistema automatizado SMARTer Apollo Purificación deARN PolyATakara
NEBNext Ultra Kit de preparación de bibliotecas para Illumina Preparación dela bibliotecaNew England Biolab
Perlas magnéticas Agencourt AMPure XPBeckman Coulter 
2100 BioanalyzerAgilentLibrary QC, análisis de distribución de tamaños
Agilent High Sensitivity DNA Kit AgilentLibrary QC, análisis de distribución
de tamaños Sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 5 (Thermo Fisher)Cuantificación de la bibliotecaThermo Fisher
NEBNext Library Quant KitEngland BiolabLibrary
Generaciónclústeres de la bibliotecacBot Illumina
TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HSIlluminaLibrary cluster generation
HiSeq 1000IlluminaSequencing
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 ciclos)IlluminaSequencing Ficoritrina
LegendL161
PE-anti-ratón IgG2bBio Legend51.1
Alexa Fluor 647 (AF647)Bio LegendCD107a(H4A3)
Análisis de de de de Purificación de ADN New de /Cianina 7 (PE/Cy7)Bio Legend L243 Ficoeritrina/Cianina 5 (PE/Cy5)Bio Legend 3.9 Violeta brillante 421 Bio

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