Aquí, describimos un protocolo para obtener datos de la secuencia del amplicón del suelo, rizosfera y raíz endosphere microbiomes. Esta información puede utilizarse para investigar la composición y diversidad de las comunidades microbianas asociadas de planta y es conveniente para el uso con una amplia gama de especies de plantas.
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Artículo de método
Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere
En este artículo
Resumen
Resumen
La interacción íntima entre la planta huésped y microorganismos asociados es crucial en la determinación de aptitud de la planta y puede fomentar mejor tolerancia a estreses abióticos y enfermedades. Como el microbioma de la planta puede ser muy compleja y de bajo costo, alto rendimiento métodos tales como secuenciación basada en productos del gene del rRNA 16S se prefieren a menudo para caracterizar su composición microbiana y diversidad. Sin embargo, la selección de la metodología adecuada al llevar a cabo tales experimentos es fundamental para reducir los sesgos que se pueden hacer análisis y comparaciones entre las muestras y estudios difíciles. Este protocolo describe en detalle una metodología estandarizada para la colección y extracción de ADN de muestras de suelo, rizósfera y raíz. Además, destacar una tubería bien establecida 16S rRNA amplicon secuencia que permite la exploración de la composición de comunidades bacterianas en las muestras y puede ser fácilmente adaptados para otros genes marcadores. Este gasoducto ha sido validado para una gran variedad de especies de plantas, incluyendo sorgo, maíz, trigo, fresa y agave y puede ayudar a superar problemas asociados con la contaminación de los organelos de la planta.
Introducción
Microbiomes asociada a la planta consisten en dinámicas y complejas de las comunidades microbianas de bacterias, arqueas, virus, hongos y otros microorganismos eucariotas. Además de su función bien estudiado como causa de enfermedad de plantas, microbios asociados planta pueden influir también positivamente en sanidad vegetal por mejorar la tolerancia a estreses bióticos y abióticos, promover la disponibilidad de nutrientes y mejorar el crecimiento de las plantas a través de la producción de fitohormonas. Por esta razón, existe particular interés en la caracterización de los taxa que se asocian con la planta raíz endospheres, rhizospheres y el suelo circundante. Mient....
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Protocolo
1. recolección y separación de la raíz Endosphere, rizosfera y las muestras de suelo
- Antes de entrar en el campo, agua ultrapura de autoclave (menos de 90 mL de agua por muestra) para esterilizar. Preparar el tampón de extracción epiphyte (por lo menos 25 mL por muestra) agregando 6,75 g de KH2PO4, 8,75 g de K2HPO4y 1 mL de Tritón X-100, a 1 L de agua estéril. Esterilizar el buffer con un filtro de vacío de tamaño de poro de 0,2 μm.
- Para pasos de 1.2 a 1.5, limpia guantes esterilizados con etanol en todo y cambiar los guantes entre cada muestra para evitar la contaminación. Esterilizar todo el equipo con et....
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Resultados
Realizar el protocolo recomendado debe resultar en un conjunto de datos de indexadas Lee extremo apareado que pueden ser emparejados a cada muestra y asignado a cualquier bacteriana unidades taxonómicas operativas (OTU) o variante de la secuencia exacta (ESV, también conocido como productos variante de la secuencia (ASV) y unidad taxonómica incompletos (sOTU)), dependiendo de posteriores análisis. Con el fin de obtener datos de la secuencia de alta calidad, se debe tener cuidado en cada p.......
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Discusión
Este protocolo muestra una tubería establecida para explorar endosphere raíz, rizosfera y composiciones de comunidad microbiana del suelo, del muestreo de campo para el procesamiento de las muestras y la secuenciación descendente. Microbiomes asociada a raíz de estudiar presenta desafíos únicos, debido en parte a las dificultades inherentes en el muestreo de suelo. Suelos altamente variable en términos de propiedades físicas y químicas, y diferentes condiciones de suelo pueden ser separadas por tan sólo unos milímetros d.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS es apoyado por el programa de becas de postgrado investigación de NSF.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.1-10/20 y micro; L puntas de micropipeta filtradas | USA Scientific | 1120-3810 | Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores. |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL USA | Scientific | 1615-5510 | Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores. |
| 10 y micro; L pipeta multicanal | Eppendorf | 3122000027 | Se puede sustituir por equivalentes de otros proveedores. |
| 10 y micro; L, 100 y micro; L, y 1000 µ L micropipetas | Eppendorf | 3120000909 | Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores. |
| 100 y micro; L pipeta multicanal | Eppendorf | 3122000043 | Se puede sustituir por equivalentes de otros proveedores. |
| 1000 y micro; L puntas de micropipeta filtradas | USA Scientific | 1122-1830 | Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores. |
| Tubos de microcentrífuga de 2 mL USA | Scientific | 1620-2700 | Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores. |
| Tamiz de suelo de 2 mm | Proveedores forestales 60141009 | Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores. | |
| 200 y micro; L puntas de micropipeta filtradas | USA Scientific | 1120-8810 | Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores. |
| Depósitos de 25 ml | VWR International LLC | 89094-664 | Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores. |
| Viales cónicos de 50 mL Thermo | Fisher Scientific | 352098 | Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores. |
| Filtros de vacío de 500 mL (0,2 y micro; tamaño de poro m) | VWR International LLC | 156-4020 | |
| Microplacas de 96 pocillos | USA Scientific | 655900 | |
| Placas de PCR de 96 pocillos | BioRad | HSP9631 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Thermo Fisher Scientific | NC9933872 | Instrucciones de uso: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf |
| Papel de aluminio | Boardwalk | 7124 | Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores. |
| Báscula analítica con resolución de 0,001 g | Ohaus Pioneer | PA323 | Se puede sustituir por equivalente de otros proveedores. |
| Bioruptor Plus ultrasonido | Diagenode | B01020001 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) 20 mg/mL | Centrífuga New England Biolabs | B9000S | |
| Eppendorf | 5811000908 | Incluye adaptadores de cubo de placa de 50 ml y 96 pocillos | |
| Guantes criogénicos | Millipore Sigma | Z183490 | Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores. |
| Kit DNeasy PowerClean (opcional) | Qiagen Inc. | 12877-50 | Anteriormente MoBio |
| DNeasy PowerSoil kit | Qiagen Inc. | 12888-100 | Anteriormente MoBio |
| Hielo seco | Cualquier | ||
| DynaMag-2 | Thermo Fisher Scientific | 12321D | No sustituya |
| etanol | VWR International LLC | 89125-188 | Puede sustituirlo por un equivalente de otros proveedores. |
| Bolsas para congelador del tamaño de un galón | Ziploc | NA | Se pueden sustituir con equivalentes de otros proveedores. |
| Lector de microplacas Gemini EM | Molecular Devices | EM | Puede usar otro fluorómetro que lee placas de 96 pocillos desde la parte superior. |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Bata de laboratorio | Workrite | J1367 | Puede sustituirse por equivalentes de otros proveedores. |
| Líquido N2 | Cualquier | NA | puede sustituirse por equivalente de otros proveedores. |
| Líquido N2 dewar | Thermo Fisher Scientific | 4150-9000 | Puede sustituir con equivalente de otros proveedores. |
| Sistema de purificación de agua ultrapura Milli-Q | Millipore Sigma | SYNS0R0WW | |
| Minicentrífuga | Eppendorf | 5404000014 | |
| Agua de grado molecular | Thermo Fisher Scientific | 4387937 | Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores. |
| Morteros VWR International LLC | 89038-150 | Se pueden sustituir con equivalentes de otros proveedores. | |
| Guantes de nitrilo | Thermo Fisher Scientific | 19167032B | Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores. |
| Toallas de papel | VWR International LLC BWK6212 | pueden sustituirse por equivalentes de otros proveedores. | |
| Película de sellado de placa PCR | Thermo Fisher Scientific | NC9684493 | |
| tubos de tiras de PCR | USA Scientific | 1402-2700 | |
| Mortles | VWR International LLC | 89038-166 | Puede sustituir por equivalentes de otros proveedores. |
| Espátulas de plástico | LevGo, Inc. | 17211 | |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000014 | |
| PNAs - cloroplasto y PNA mitocondrial | Bio | NA | Asegúrese de verificar la secuencia bioinformáticamente |
| Gafas de protección | Millipore Sigma | Z759015 | Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores. |
| Qubit 3.0 Fluorímetro | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS kit de ensayo | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Mazo de goma (opcional) | Ace Hardware | 2258622 | Puede sustituir con equivalente de otros proveedores. |
| Tijeras o tijeras | VWR International LLC | 89259-936 | Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores. |
| Pala | Home Depot | 2597400 | Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores. |
| Colector de núcleos de suelo (diámetro pequeño: < 1 pulgada) | Ben Meadows | 221700 | Puede sustituir con equivalente de otros proveedores. |
| Botellas rociadoras Santa | Cruz Biotechnology | sc-395278 | Se pueden sustituir con equivalentes de otros proveedores. |
| Imprimaciones con código de barras desalinizadas estándar (10 y micro; M) (Tabla 1) | IDT | NA | 4 nmole Oligo de ADN ultramero con desalinización estándar. El adaptador NGS y el cebador de secuenciación (Tabla 1) están diseñados para su uso con Illumina MiSeq utilizando la química v3. |
| Termociclador | Thermo Fisher Scientific | E950040015 | Puede sustituir por equivalentes de otros proveedores. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores. |
| Pesaje de barcos | Spectrum Chemicals | B6001W | Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores. |
Referencias
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
- Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic cl....
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Reimpresiones y permisos
