Method Article

Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

DOI:

10.3791/57561

⸱

May 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center, USDA ARS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, describimos un protocolo para obtener datos de la secuencia del amplicón del suelo, rizosfera y raíz endosphere microbiomes. Esta información puede utilizarse para investigar la composición y diversidad de las comunidades microbianas asociadas de planta y es conveniente para el uso con una amplia gama de especies de plantas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La interacción íntima entre la planta huésped y microorganismos asociados es crucial en la determinación de aptitud de la planta y puede fomentar mejor tolerancia a estreses abióticos y enfermedades. Como el microbioma de la planta puede ser muy compleja y de bajo costo, alto rendimiento métodos tales como secuenciación basada en productos del gene del rRNA 16S se prefieren a menudo para caracterizar su composición microbiana y diversidad. Sin embargo, la selección de la metodología adecuada al llevar a cabo tales experimentos es fundamental para reducir los sesgos que se pueden hacer análisis y comparaciones entre las muestras y estudios difíciles. Este protocolo describe en detalle una metodología estandarizada para la colección y extracción de ADN de muestras de suelo, rizósfera y raíz. Además, destacar una tubería bien establecida 16S rRNA amplicon secuencia que permite la exploración de la composición de comunidades bacterianas en las muestras y puede ser fácilmente adaptados para otros genes marcadores. Este gasoducto ha sido validado para una gran variedad de especies de plantas, incluyendo sorgo, maíz, trigo, fresa y agave y puede ayudar a superar problemas asociados con la contaminación de los organelos de la planta.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microbiomes asociada a la planta consisten en dinámicas y complejas de las comunidades microbianas de bacterias, arqueas, virus, hongos y otros microorganismos eucariotas. Además de su función bien estudiado como causa de enfermedad de plantas, microbios asociados planta pueden influir también positivamente en sanidad vegetal por mejorar la tolerancia a estreses bióticos y abióticos, promover la disponibilidad de nutrientes y mejorar el crecimiento de las plantas a través de la producción de fitohormonas. Por esta razón, existe particular interés en la caracterización de los taxa que se asocian con la planta raíz endospheres, rhizospheres y el suelo circundante. Mientras que algunos microbios pueden ser cultivadas en aislamiento en laboratorio generado medios de comunicación, muchos no pueden, en parte porque puede depender de relaciones simbióticas con otros microorganismos, crecen muy lentamente, o requieren condiciones que no pueden repetirse en un entorno de laboratorio. Porque evita la necesidad de cultivo y es relativamente barato y de alto rendimiento, perfiles filogenéticos basados en la secuencia de muestras ambientales y asociado anfitrión microbianas ha convertido en un método preferido para el análisis de la comunidad microbiana composición.

La selección de tecnologías de secuenciación adecuada proporcionada por varios generación sequencing (NGS) plataformas1 depende de las necesidades del usuario, con factores importantes como: la cobertura deseada, longitud del amplicón, espera que la comunidad diversidad, así como tasa de error, lectura de longitud y el costo-por-run/megabase de secuenciación. Otra variable que debe considerarse en los experimentos de secuenciación basada en productos es lo que gene se amplificarán y qué iniciadores se utilizará. Al diseñar o elegir cebadores, los investigadores a menudo se ven obligados a hacer realizables de los amplicones resultante entre la universalidad de la amplificación y la resolución taxonómica. Por esta razón, este tipo de estudios eligió a menudo cartillas y marcadores dirigidos selectivamente a subconjuntos específicos de la microbioma. Evaluación de la composición de comunidades bacterianas comúnmente se logra ordenando uno o más de las regiones hipervariables de bacteriano 16S rRNA gene2,3. En este estudio, describimos un amplicon basado en protocolo de secuenciación desarrollado para una plataforma NGS esa región de bp V3-V4 de objetivos el 500 del gene del rRNA 16S bacteriano, que permite la amplificación amplia de taxones bacterianos mientras que también proporciona suficiente variabilidad para distinguir entre diferentes taxones. Además, este protocolo puede ser fácilmente adaptado para el uso con otros conjuntos de la cartilla, como los dirigidos al marcador ITS2 de hongos o la subunidad rRNA de 18S de los eucariotas.

Mientras que otros enfoques tales como metagenómica de escopeta, metatranscriptomics y secuenciación unicelular, ofrecen otras ventajas incluyendo genomas microbianos resueltos y medición más directa de la función de la comunidad, estas técnicas son generalmente más caro y cálculo intensivo de los perfiles filogenéticos describen aquí4. Además, realizar escopeta metagenómica y metatranscriptomics en muestras de raíz produce un gran porcentaje de lecturas que el genoma de la planta huésped, y métodos para superar esta limitación todavía están siendo desarrollados5,6.

Como con cualquier plataforma experimental, basada en productos de perfiles pueden introducir a una serie de sesgos potenciales que deben considerarse en el análisis de datos y diseño experimental. Estos incluyen los métodos de recogida de muestras ADN extracción, selección de iniciadores PCR, y cómo se realiza la preparación de la biblioteca. Diferentes métodos pueden afectar significativamente la cantidad de datos utilizables generados y también pueden obstaculizar los esfuerzos para comparar resultados entre estudios. Por ejemplo, el método de eliminación de bacterias de rizósfera7 y el uso de técnicas de extracción diferentes o elección de ADN de8,de kits de extracción9 han demostrado a un impacto significativo en análisis posteriores, que conduce a conclusiones diferentes sobre cuáles microbios están presentes y su abundancia relativa. Desde perfiles basados en los productos pueden ser modificado para requisitos particulares, puede ser difícil hacer comparaciones entre los estudios. El proyecto del microbioma de tierra ha sugerido que los investigadores estudiando sistemas complejos como el microbioma asociado de planta beneficiaría el desarrollo de protocolos estándares como un medio de reducir al mínimo la variabilidad causada por la aplicación de diferentes métodos entre los estudios10,11. Aquí, discutimos muchos de los temas mencionados y ofrecen sugerencias sobre las mejores prácticas de donde proceda.

El protocolo muestra el proceso de recoger muestras de suelo, rizósfera y raíz de Sorghum bicolor y extracción del ADN mediante un ADN bien establecida aislamiento kit11. Además, nuestro protocolo incluye un flujo de trabajo de la secuencia detallada de productos, utilizando una plataforma NGS comúnmente utilizada, para determinar la estructura de las comunidades bacterianas12,13,14. Este protocolo ha sido validada para el uso en una amplia gama de anfitriones de la planta en un reciente estudio publicado de las raíces, rizosfera y asociados-suelos de 18 especies de monocotiledóneas, incluyendo sorgo bicolor, Zea mays y Triticum aestivum15. Este método también ha sido validado para su uso con otros genes marcadores, como lo demuestra su exitosa aplicación al estudio de los hongos ITS2 gen marcador en estudios de agave microbioma16,17 y microbioma fresa 18.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. recolección y separación de la raíz Endosphere, rizosfera y las muestras de suelo

  1. Antes de entrar en el campo, agua ultrapura de autoclave (menos de 90 mL de agua por muestra) para esterilizar. Preparar el tampón de extracción epiphyte (por lo menos 25 mL por muestra) agregando 6,75 g de KH2PO4, 8,75 g de K2HPO4y 1 mL de Tritón X-100, a 1 L de agua estéril. Esterilizar el buffer con un filtro de vacío de tamaño de poro de 0,2 μm.
    1. Para pasos de 1.2 a 1.5, limpia guantes esterilizados con etanol en todo y cambiar los guantes entre cada muestra para evitar la contaminación. Esterilizar todo el equipo con etanol al 70% y limpie todo el equipo entre muestras. Antes de toma de muestras, determinar la profundidad de muestreo óptimo para su experimento y consistente con todas las colecciones de suelo y raíz.
  2. Para recolectar muestras de suelo a granel, utilice un colector de base de suelo esterilizado de etanol para obtener suelo libre de raíces de la planta por la recogida de un núcleo de aproximadamente de 23 a 30 cm de la base de la planta.
  3. Transferir el suelo a una bolsa de plástico, homogeneizar el suelo agitando suave y transferir una alícuota de la muestra de suelo (aproximadamente 600 mg) para llenar un tubo de 2 mL. Inmediatamente Coloque el tubo de 2 mL en hielo seco o flash congele el tubo en el líquido N2 hasta que esté listo para proceder con la extracción de ADN (paso 2).
    1. En algunos entornos, el suelo circundante puede contener material vegetal. En este caso, utilizar un tamiz de 2 mm esterilizado para separar los restos vegetales del suelo antes de colocar en la bolsa de plástico.
  4. Para recolectar las raíces y rizosfera, utilice una pala esterilizada de etanol para desenterrar la planta, cuidando de obtener tanto la raíz como sea posible. Profundidad depende de la planta. Mientras que pequeñas plantas como el trigo pueden ser quitadas por varios centímetros de excavación, plantas más grandes como el sorgo pueden requerir 30 cm o más. Suavemente sacuda el exceso de suciedad de las raíces hasta que hay aproximadamente 2 mm de suelo adheridas a la superficie de la raíz.
    Nota: tenga cuidado cuando se trabaja con plantas pequeñas, con raíces frágiles, o en suelos de contenido seco, alta-arcilla. Idealmente, sólo debería haber una capa delgada de suelo que queda en las raíces después de la sacudida. Si se mantienen grandes agregados de suelo, puede utilizarse un mazo de goma para desalojar la tierra golpeando suavemente la base del rodaje. Si la cantidad de suelo que queda después de este proceso excede o cae por debajo de 2 mm, el espesor aproximado debe señalarse.
  5. Para plantas grandes, uso estériles tijeras o Cizallas para cortar una subdivisión representativa de las raíces y colocar un mínimo de 500 mg de tejido de raíz en un frasco cónico de 50 mL. Para las hierbas más pequeñas, coloque todo el sistema de raíz en el frasco. Agregar suficiente buffer de remoción de epífitas para cubrir las raíces, luego coloque inmediatamente la muestra en hielo seco o flash congelar la muestra en líquido N2.
    Nota: tenga cuidado de no para sobrellenar el frasco cónico de 50 mL, como hará lavado de paso difícil. Debe haber suficiente espacio que el búfer de epífitas es capaz de fluir a la parte inferior, rodean las raíces en todo el frasco y la tapa. Debido a que algunas hierbas tienen más biomasa de la raíz que caben en un frasco cónico de 50 mL, una subdivisión de las raíces se debe recoger. Sin embargo, debe señalarse que corte las raíces podría conducir a bacterias endophytic ser lavadas fuera en la fracción de la rizosfera, rompiendo así las raíces debe reducirse al mínimo. Si las muestras no son procesadas inmediatamente después de regresar al laboratorio, puede conservarse a-80 ° C.
  6. Para separar la rizosfera de las raíces, descongelar la muestra de raíz en el hielo, luego someter a ultrasonidos las muestras de raíz a 4 ° C por 10 min con pulsos de 160 W por 30 s, separadas por 30 s. transferencia las raíces en una fría (4 ° C), limpiar 50 tubo mL utilizando pinzas estériles. No deseche el tubo original con buffer y suelo, que es la fracción de la rizosfera (figura 1).
  7. Centrifugar el tubo con tampón y rizosfera para flash 10 min a 4 ° C, 4.000 x g. decantar el sobrenadante, congelar el tubo que contiene la fracción de la rizosfera en líquido N2y almacenar la fracción de la rizosfera a-80 ° C hasta que esté listo para proceder con el ADN extracción (paso 2).
  8. Para lavar las raíces, añadir aproximadamente 20 mL de agua estéril fría (4 ° C) a la fracción de raíz. Lavar la raíz agitando vigorosamente (a mano o batidora, para 15-30 s) y luego drenar el agua.
  9. Repita este paso por lo menos dos veces, hasta que no suelo permanece en la superficie de la raíz. Si la extracción de ADN (paso 2) no se realiza inmediatamente, envuelva las raíces en papel de aluminio estéril, flash congelar las raíces en líquido N2y tienda las muestras a-80 ° C hasta listo para proceder con la extracción de ADN.

2. extracción de ADN

Nota: A lo largo de los pasos 2 y 3, guantes limpios, esterilizados con etanol deben llevarse en todo momento y todo el trabajo debe realizarse sobre una superficie esterilizada con etanol.

  1. Extraer el ADN de las muestras de suelo y rizósfera.
    1. Uso una espátula estéril para transferir rápidamente 250 mg del suelo y la rizosfera de los pasos 1.3 y 1.7 en los tubos de recogida proporciona en un kit de aislamiento de ADN comercial diseñado para la extracción del suelo, luego proceder con el aislamiento de ADN utilizando el proveedor de kit Protocolo.
    2. Después de liberador de la DNA en el tampón de elución proporcionada por el kit de aislamiento de DNA, guardar el ADN a-20 ° C hasta que esté listo para proceder con el paso 3.
  2. Extraer el ADN de las muestras de raíz.
    1. Enfriar un mortero esterilizado y Maja usando líquido N2. Mida 600 a 700 mg de raíz tejido y coloque el tejido en el mortero. Cuidadosamente, agregue suficiente líquido N2 para cubrir las raíces.
    2. Moler las raíces en trozos pequeños. Continuar con el proceso de agregar líquido N2 y pulido (por lo menos dos veces, ser coherente entre las muestras), hasta que las raíces son un polvo fino. Asegúrese de que el tejido de la raíz no descongelar durante este paso.
      PRECAUCIÓN: Use equipo de protección personal (bata, gafas protectoras y Guantes criogénicos) cuando trabajan con líquido N2.
      Nota: Para una extracción de ADN de baja calidad, puede ser beneficioso moler raíces exceso en polvo y guardar el polvo a-80 ° C.
    3. Rápidamente, antes de la raíz en polvo comienza a descongelar, utilizar una espátula estéril para transferir el polvo de la raíz en tubos de 1,5 mL previamente pesado en el hielo. Registrar el peso del tubo y el polvo. Por lo general, se transfiere 300-400 mg de polvo.
    4. Uso una espátula estéril para transferir rápidamente 150 mg de polvo de la raíz para el tubo de la colección en un kit de aislamiento de ADN comercial diseñado para la extracción del suelo, luego proceder con el aislamiento de la DNA usando el protocolo del proveedor de kit.
      Nota: Para algunas muestras de raíz, puede haber una alta concentración de materia orgánica remanente en el pellet de ADN, lo que impide la amplificación de la DNA durante PCR, especialmente cuando un protocolo de extracción de ADN diferente (por ej., extracción CTAB) se utiliza. Si es necesario, limpie el ADN siguiendo las instrucciones proporcionadas en el kit de limpieza ambiental de ADN.
  3. Medir la concentración de todas las muestras de ADN con un fluorómetro de sobremesa de alta sensibilidad.
    1. Añadir 1-20 μl de cada muestra de ADN eluída en tubos en el kit de ensayo de alta sensibilidad de dsDNA. Añadir solución de trabajo de Fluorímetro (tinte: tampón de 1: 200) hasta 200 μl.
    2. Preparar dos tubos adicionales con 10 μl de ADN estándar 1 (0 ng/μl de ADN) o 10 μl de estándar 2 (100 ng/μL) y añadir 190 μl de solución de trabajo de Fluorímetro a cada estándar.
    3. Medir la concentración de cada muestra y los estándares. Si no se realiza automáticamente, calcular la concentración de ADN de la salida de la absorbancia de una regresión lineal de los dos estándares.

3. productos biblioteca preparación y presentación

  1. Crear materiales para la reacción de amplificación.
    1. Descongelar las muestras de ADN a 4 º C y mantenerse en hielo en el paso 3. Aleatorizar el orden de las muestras de ADN para minimizar el sesgo debido a la ubicación de la placa PCR (tabla 2).
    2. En una placa PCR de 96 pocillos, Diluya el ADN de cada muestra de agua molecular grado a 5 ng/μL en un volumen total de 20 μl. agregar 20 μl de agua de grado molecular a los pozos de cuatro esquinas como controles negativos para la amplificación (espacios en blanco) (tabla 2).
    3. Organizar los cebadores con código de barras (10 μm) en tubos PCR tira o en una placa de 96 pocillos que se puede añadir con una pipeta multicanal (figura 2).
    4. Preparar suficiente mezcla maestra de PCR para amplificar cada muestra de ADN por triplicado. Preparar 1,5 μl de BSA (20 mg/mL), 37.5 μl de prefabricadas 2 x master mix (compuesto de buffer PCR, dNTPs, MgCl2y Taq ADN polimerasa), 0.57 μl de cloroplasto PNA (100 μm), 0.57 μl de ANP mitocondrial (100 μm) y 25.86 μl de agua de grado molecular.
    5. Vierta la mezcla principal en un estéril 25 mL del reservorio de la pipeta multicanal y distribuir 66 μl de la master mix a cada pocillo de una placa PCR de 96 pocillos nueva utilizando una pipeta multicanal.
      Nota: Al calcular los volúmenes de reactivo para la mezcla principal, asegúrese de incluir también los pocillos del blanco 4 por placa.
    6. Usando una pipeta multicanal, añadir 6 μl de 5 ng/μl de ADN (de la placa normalizada de ADN) a la placa de mezcla principal. Luego añadir a la placa principal 1,5 μl del primer avance de 10 μm que cada columna tiene un diferente código de barras hacia delante y 1,5 μl de 10 μm inversa primer tal que cada fila tiene un código de barras diferentes inversa (figura 2).
      Nota: Antes de la adición de iniciadores, las placas al azar y mezcla principal podrían utilizarse para amplificar los genes de hongos ITS o ITS2 si se agregaron diferentes cartillas. Si este es el caso, puede utilizarse un diseño similar de la cartilla.
    7. Giro de la placa brevemente a 3.000 x g. Utilice una pipeta de varios canales para mezclar suavemente, luego se dividen en tres placas con 25 μl de mezcla de reacción.
      Nota: Aunque no son estrictamente necesarios tres repeticiones, disminuye el impacto de la variabilidad técnica.
  2. Amplificar el ADN en cada placa utilizando un termociclador a las siguientes condiciones: 180 s a 98 ° C, 30 ciclos de: 98 ° C por 45 s (desnaturalización), 78 ° C durante 10 s (PNA recocido), 55 ° C durante 60 s (primer recocido) y 72 ° C durante 90 s (extensión) , entonces 600 s a 72 ° C seguido de un 4 ° C mantener paso. Después de la amplificación, la piscina las tres placas replicadas en una sola placa de 96 pocillos.
  3. Cuantificar el ADN utilizando los reactivos de alta sensibilidad Fluorímetro en un lector de placa de 96 pocillos.
    1. Añadir 2 μl de cada producto PCR a una microplaca de 96 pozos, junto con 98 μl de solución de trabajo de Fluorímetro (tinte: tampón de 1: 200). Incluyen 4 pozos como estándares: 5 μl de ADN estándar 1 (0 ng/μl de ADN), 1 μl de estándar 2 (10 ng/μL), 2 μl de estándar 2 (20 ng/μL) y 5 μl de estándar de 2 (50 ng/μL). A continuación Agregar solución de trabajo de Fluorímetro para un volumen final de 100 μl.
      Nota: Cada muestra puede medirse con un fluorómetro de sobremesa como se describe en el paso 2.3, si no hay un lector de placas.
    2. Calcular la concentración de ADN de la salida de la absorbancia de una regresión lineal de los cuatro estándares.
    3. Para el código de barras con éxito amplificado productos (aquellos que tienen una concentración mayor de 15 ng/μL), piscina 100 ng de cada muestra en un tubo de 1,5 mL sola (tabla 2).
    4. Calcular el volumen promedio de muestras de agregado a la piscina mediante la función =AVERAGE() en un programa de hoja de cálculo. Añadir el volumen de los productos PCR "en blanco" a las muestras agrupadas.
      Nota: Puesto que los productos PCR "en blanco" tienen sus propias combinaciones de código de barras único, puede secuenciados para verificar cualquier contaminante de laboratorio.
  4. Medir la concentración del producto combinado con un fluorómetro de sobremesa como se describe en el paso 2.3 y tomar 600 ng de ADN y diluir en agua grado molecular a un volumen final de 100 μL en un tubo de 1,5 mL. Almacenar el producto combinado restantes a-20 ° C.
  5. Lavar el ADN ng 600 alícuota siguiendo el proceso establecido de purificación PCR con granos de purificación paramagnética en un formato de 96 pocillos con unas pocas excepciones.
    1. Hacer un fresco 600 μl alícuota de etanol al 70%. Agite la botella de bolas magnéticas para resuspender los granos que se colocan en la parte inferior.
    2. Agregar 1 volumen x (100 μL) de solución de grano a la 600 alícuota ng de ADN. Mezclar bien mediante pipeteo 10 veces. Incubar por 5 min a temperatura ambiente.
    3. Coloque el tubo en el soporte magnético de 2 minutos (o hasta que la solución esté clara) para separar los granos de la solución. Mientras el tubo está en el soporte magnético, aspirar el sobrenadante con cuidado sin tocar las bolas magnéticas y descartar el sobrenadante.
      Nota: en este punto, los productos de productos están limitados a las bolas magnéticas. Cualquier granos que son perturbada o perdida durante la aspiración resultará en una pérdida de ADN.
    4. Dejar el tubo en el soporte magnético y añadir 300 μL de etanol al 70% al tubo; incubar a temperatura ambiente durante 30 s. aspirado el etanol y el descarte. Repita este proceso y etanol todos después del segundo lavado. Retire el tubo del soporte magnético y aire seco durante 5 minutos.
    5. Añadir 30 μl de agua molecular grado a los granos secos y mezclar mediante pipeteo 10 veces. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min vuelta el tubo al soporte magnético durante 1 minuto para separar los granos de la solución. Transferir el efluente a un tubo nuevo.
      Nota: Granos magnéticos no afectará las reacciones posteriores.
  6. Medir la concentración final de limpiar, ADN combinado con un fluorómetro de sobremesa como se describe en el paso 2.3. Diluir una alícuota de 10 nM en un volumen final de 30 μL, o a la concentración y volumen preferido por la facilidad de la secuencia.
  7. Utilizar los servicios de un establecimiento de secuencia a secuencia de la DNA en una plataforma NGS, 2 x 300 bp final emparejado la secuencia.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Realizar el protocolo recomendado debe resultar en un conjunto de datos de indexadas Lee extremo apareado que pueden ser emparejados a cada muestra y asignado a cualquier bacteriana unidades taxonómicas operativas (OTU) o variante de la secuencia exacta (ESV, también conocido como productos variante de la secuencia (ASV) y unidad taxonómica incompletos (sOTU)), dependiendo de posteriores análisis. Con el fin de obtener datos de la secuencia de alta calidad, se debe tener cuidado en cada p...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo muestra una tubería establecida para explorar endosphere raíz, rizosfera y composiciones de comunidad microbiana del suelo, del muestreo de campo para el procesamiento de las muestras y la secuenciación descendente. Microbiomes asociada a raíz de estudiar presenta desafíos únicos, debido en parte a las dificultades inherentes en el muestreo de suelo. Suelos altamente variable en términos de propiedades físicas y químicas, y diferentes condiciones de suelo pueden ser separadas por tan sólo unos milímetros d...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue financiado por el USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS es apoyado por el programa de becas de postgrado investigación de NSF.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10/20 y micro; L puntas de micropipeta filtradasUSA Scientific1120-3810Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL USAScientific1615-5510Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.
10 y micro; L pipeta multicanalEppendorf3122000027Se puede sustituir por equivalentes de otros proveedores.
10 y micro; L, 100 y micro; L, y 1000 µ L micropipetasEppendorf3120000909Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.
100 y micro; L pipeta multicanalEppendorf3122000043Se puede sustituir por equivalentes de otros proveedores.
1000 y micro; L puntas de micropipeta filtradasUSA Scientific1122-1830Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.
Tubos de microcentrífuga de 2 mL USAScientific1620-2700Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.
Tamiz de suelo de 2 mmProveedores forestales 60141009Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores.
200 y micro; L puntas de micropipeta filtradasUSA Scientific1120-8810Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.
Depósitos de 25 mlVWR International LLC89094-664Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.
Viales cónicos de 50 mL ThermoFisher Scientific352098Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.
Filtros de vacío de 500 mL (0,2 y micro; tamaño de poro m)VWR International LLC156-4020
Microplacas de 96 pocillosUSA Scientific655900
Placas de PCR de 96 pocillosBioRadHSP9631
Agencourt AMPure XP BeadsThermo Fisher ScientificNC9933872Instrucciones de uso:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
Papel de aluminioBoardwalk7124Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores.
Báscula analítica con resolución de 0,001 gOhaus PioneerPA323Se puede sustituir por equivalente de otros proveedores.
Bioruptor Plus ultrasonidoDiagenodeB01020001
Albúmina sérica bovina (BSA) 20 mg/mLCentrífuga New England BiolabsB9000S
Eppendorf5811000908Incluye adaptadores de cubo de placa de 50 ml y 96 pocillos
Guantes criogénicosMillipore SigmaZ183490Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores.
Kit DNeasy PowerClean (opcional)Qiagen Inc.12877-50Anteriormente MoBio
DNeasy PowerSoil kitQiagen Inc.12888-100Anteriormente MoBio
Hielo secoCualquier
DynaMag-2Thermo Fisher Scientific12321DNo sustituya
etanolVWR International LLC89125-188Puede sustituirlo por un equivalente de otros proveedores.
Bolsas para congelador del tamaño de un galónZiplocNASe pueden sustituir con equivalentes de otros proveedores.
Lector de microplacas Gemini EMMolecular DevicesEMPuede usar otro fluorómetro que lee placas de 96 pocillos desde la parte superior.
K2HPO4Sigma-AldrichP3786
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
Bata de laboratorioWorkriteJ1367Puede sustituirse por equivalentes de otros proveedores.
Líquido N2CualquierNApuede sustituirse por equivalente de otros proveedores.
Líquido N2 dewarThermo Fisher Scientific4150-9000Puede sustituir con equivalente de otros proveedores.
Sistema de purificación de agua ultrapura Milli-QMillipore SigmaSYNS0R0WW
MinicentrífugaEppendorf5404000014
Agua de grado molecularThermo Fisher Scientific4387937Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores.
Morteros VWR International LLC89038-150Se pueden sustituir con equivalentes de otros proveedores.
Guantes de nitriloThermo Fisher Scientific19167032BSe pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.
Toallas de papelVWR International LLC BWK6212pueden sustituirse por equivalentes de otros proveedores.
Película de sellado de placa PCRThermo Fisher ScientificNC9684493
tubos de tiras de PCRUSA Scientific1402-2700
MortlesVWR International LLC89038-166Puede sustituir por equivalentes de otros proveedores.
Espátulas de plásticoLevGo, Inc.17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific13000014
PNAs - cloroplasto y PNA mitocondrialBioNAAsegúrese de verificar la secuencia bioinformáticamente
Gafas de protecciónMillipore SigmaZ759015Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores.
Qubit 3.0 FluorímetroThermo Fisher ScientificQ33216
Qubit dsDNA HS kit de ensayoThermo Fisher ScientificQ32854
Mazo de goma (opcional)Ace Hardware2258622Puede sustituir con equivalente de otros proveedores.
Tijeras o tijerasVWR International LLC89259-936Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.
PalaHome Depot2597400Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores.
Colector de núcleos de suelo (diámetro pequeño: < 1 pulgada)Ben Meadows221700Puede sustituir con equivalente de otros proveedores.
Botellas rociadoras SantaCruz Biotechnologysc-395278Se pueden sustituir con equivalentes de otros proveedores.
Imprimaciones con código de barras desalinizadas estándar (10 y micro; M) (Tabla 1)IDTNA4 nmole Oligo de ADN ultramero con desalinización estándar. El adaptador NGS y el cebador de secuenciación (Tabla 1) están diseñados para su uso con Illumina MiSeq utilizando la química v3.
TermocicladorThermo Fisher ScientificE950040015Puede sustituir por equivalentes de otros proveedores.
Triton X-100Sigma-AldrichX100Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores.
Pesaje de barcosSpectrum ChemicalsB6001WPuede sustituir con equivalentes de otros proveedores.
imán NA el

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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