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Artículo de método

Medición de transporte de electrones membrana Trans-Plasma por C2C12 miotubos

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DOI:

10.3791/57565

⸱

4 de mayo de 2018

 ,  , 
1Department of Biology, Saint Louis University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El objetivo de este protocolo es espectrofotometría monitor plasma trans membrana transporte de electrones utilizando aceptadores del electrón extracelular y analizar las interacciones enzimáticas que pueden ocurrir con estos aceptadores del electrón extracelular.

Resumen

Transporte de electrones de la membrana trans-plasma (tPMET) desempeña un papel en la protección de las células del estrés reductor intracelular, así como protección contra el daño por oxidantes extracelulares. Este proceso de transporte de electrones de reductores intracelulares a extracelulares oxidantes no está bien definida. Aquí presentamos ensayos espectrofotométricos por C2C12 miotubos para monitorear tPMET utilizando los aceptadores del electrón extracelular: 1 sal de tetrazolio soluble en agua (WST-1) y 2, 6-dichlorophenolindophenol (DPIP o DCIP). A través de la reducción de estos aceptadores del electrón, que son capaces de controlar este proceso en un análisis en tiempo real. Con la adición de enzimas como la ascorbato oxidasa (AO) y superóxido dismutasa (SOD) para el análisis, podemos determinar que la porción de tPMET es debido a la producción de exportación o superóxido ascorbato, respectivamente. Mientras WST-1 fue demostrada para producir resultados estables con bajo fondo, DPIP pudo ser nuevamente oxidado después de la adición de la AO y césped, que se demostró con análisis espectrofotométrico. Este método demuestra un análisis espectrofotométrico en tiempo real, multi-bien, rápido con ventajas sobre otros métodos utilizados para controlar tPMET como ferricianuro (FeCN) y reducción c ferricytochrome.

Introducción

La capacidad de las membranas de plasma purificadas para reducir aceptadores del electrón ha llevado a la vista que la membrana plasmática tiene una capacidad inherente de redox de1. Visto previamente en hongos, plantas y animales, tPMET es un proceso común a múltiples organismos2,3,4,5. En concreto, este proceso ha sido demostrado en Saccharomyces cerevisiae, zanahoria células, eritrocitos, linfocitos, osteosarcoma, melanoma, macrófagos, músculo esquelético y neutrófilos2,3, 4 , 5 , 6 , 7. en un proceso que transporta electrones a través de la membrana de plasma para reducir oxidantes extracelulares, tPMET participa en muchas funciones celulares incluyendo: célula crecimiento5,8, de la viabilidad de la célula9, hierro metabolismo10,11,12,13y la protección de especies de oxígeno reactivo12,14,15de señalización de la célula. Debido a la implicación de tPMET en muchas funciones celulares, un desequilibrio de tPMET ha presumido para contribuir al desarrollo de algunas condiciones de salud graves, incluyendo cáncer16,17de las enfermedades cardiovasculares, metabólicos y síndrome18.

Hay varias formas para controlar a la transferencia de electrones a través de la membrana del plasma, pero es la técnica más ampliamente utilizada evaluar la reducción de los aceptores de electrones extracelular a través de análisis colorimétricos. Aceptadores del electrón extracelular comúnmente utilizados son las sales de tetrazolio, DPIP, FeCN y ferricytochrome c19,20. La sal de tetrazolio más comúnmente utilizado es una segunda generación sal conocida como WST-119. Este compuesto es más fácil de utilizar en el análisis colorimétricos en comparación a las sales de tetrazolio de primera generación debido a dos grupos sulfonato, que aumentan su solubilidad de agua21. WST-1, junto con el intermedio electrón aceptador 1-metoxi-phenazine methosulfate (mPMS), se reduce en eventos de transferencia de electrones solo dos. Esta reducción cambia la forma oxidada de color débil de WST-1 a un precipitado más intenso, amarillo20,22. WST-1 tiene un coeficiente de extinción molar alta de 37 x 103 M-1cm-1, conduce a un análisis alta sensibilidad21,22. DPIP también es utilizado como un aceptor de electrones extracelular para controlar tPMET. Se ha demostrado que puede reducirse extracellularly DPIP por tPMET sin la ayuda de aceptadores de electrones intermedios23,24. Debido a la ausencia de aceptadores del electrón intermedio, DPIP puede directamente electrones Pick-up de la membrana del plasma, a diferencia de WST-124. Similar a la DPIP, FeCN ha visto reducirse extracelularmente a ferrocianuro, tPMET sin la ayuda de aceptadores de electrones intermedios19,24. A diferencia de WST-1 y DPIP, FeCN tiene un coeficiente de extinción molar baja conduce a un menor análisis sensibilidad9. Otro aceptor de electrones extracelular utilizados para monitorear tPMET es ferricytochrome c. Similar a WST-1, ferricytochrome c reducción aumenta con el uso del aceptador del electrón intermedio, mPMS22. A diferencia de WST-1 sin embargo, el método c ferricytochrome es menos sensible debido a una alta formación y un coeficiente de extinción molar baja22.

Aquí presentamos un método para el análisis en tiempo real de tPMET a través de análisis espectrofotométricos. El método utilizado los aceptadores del electrón extracelular WST-1 y DPIP, pues ambos tienen un coeficiente de extinción molar alta mientras que siendo menos costosa en comparación con los otros comúnmente utilizados aceptadores del electrón extracelular como c ferricytochrome. Utilizamos phenazine methosulfate (PMS) en lugar de multiprocesamiento tienen una composición química similar y PMS es mucho menos costoso. mPMS es fotoquímicamente estable que es una característica importante de un kit comercial que necesita una larga vida útil. Sin embargo, hacemos PMS fresca para cada ensayo, por lo que la estabilidad no debe ser un problema. También presentamos un método para evaluar posibles interacciones enzimáticas (ver figura 1) entre el aceptador del electrón extracelulares y enzimas que pueden ser utilizadas para caracterizar el proceso de tPMET. En concreto, las enzimas AO y el césped puede ser utilizado determinan la parte de tPMET es debido al transporte de ascorbato o liberación de superóxido extracelular, dos métodos comunes para los electrones que se transportará a través de la membrana plasmática.

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Protocolo

Nota: Vea la figura 1 para una descripción esquemática de los pasos claves.

1. ensayo de reducción de WST-1

  1. Crecer y diferenciar las células adherentes C2C12 utilizando estándar de la célula cultura procedimientos7 en una placa de 96 pozos utilizando filas A-f.
    1. Utilizar un medio de diferenciación que consta de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 2% de suero de caballo, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina de 0,1 mg/mL. Incube las células a 37 ° C con 5% CO2.
    2. Al medirse la implicación de ascorbato en tPMET, suplemento de medios de diferenciación con el ácido ascórbico de 100 μm. Permitir que las células al incubar en medio de la diferenciación para ~ 24-48 h.
  2. Preparar soluciones WST-1 y PMS.
    1. Para hacer un stock de 10 mM de WST-1, disolver 0,033 g de WST-1 (peso fórmula (PF): 651.34 g/mol) en 5 mL de fosfato tampón salino (PBS). Almacenar a 4 ° C.
    2. Para hacer un stock de 5 mM del PMS, disolver 0,0023 g de PMS (FW: 306.34 g/mol) en 1,5 mL de desionizada H2O (diH2O). Almacenar a-20 ° C y proteger de la luz.
  3. Añadir 0,0108 g de glucosa, para una concentración final de 5 mM a 11,4 mL de PBS o HEPES tamponada con solución salina (HBS; sal de sodio HEPES 20 mM, 140 mM NaCl, KCl, 2, 5 mM de MgSO4, de 5 mM 1 mM CaCl2). Añadir 480 μl de 10 mM WST-1 para una concentración final de 400 μm y 48 μl de 5 mM PMS para una concentración final de 20 μm.
  4. Al medirse la implicación de ascorbato en tPMET, divida la solución en dos alícuotas de 6 mL. A una alícuota, añadir 6 μl de diH2O y a la otra alícuota agregar 6 μl de 2 kU/mL AO para una concentración final de 2 U/mL.
  5. Al medirse la implicación de superóxido en tPMET, divida la solución en dos alícuotas de 6 mL. A una alícuota, agregar 55 μl de 0,1 M KPO4 tampón y a la otra alícuota agregar 55 μl de 6.5 kU/mL de sodio a una concentración final de 60 U/mL.
  6. Lavar las células con PBS. Aspire el medio y agregar 150 μL PBS. Luego aspirar el PBS.
    Nota: El ensayo se realiza con las células plateadas, adjuntadas. Así, hay no hay centrifugación o el uso de la tripsina en el proceso de lavado.
  7. Añada 100 μl de solución de WST-1 (-) SOD o (-) AO a las columnas 1-6 y agregar 100 μl de solución de WST-1 (+) de sodio o (+) AO para columnas 7-12 en la placa de 96 pocillos. Utilizar filas G y H como controles de fondo (es decir, para monitorear el cambio en la absorbancia del reactivo solamente en pozos sin células).
  8. Los valores de absorbancia con el espectrofotómetro cada 10 min durante 1 h a 438 nm.
  9. Después de la lectura, los medios de comunicación de aspirar y lavar cada pozo con 150 μL de PBS. Luego aspirar el PBS.
  10. Calcular el cambio en la absorbancia de cada pocillo restando la absorbancia inicial para un pozo de la absorbencia en cualquier momento para bien. Corregir este cambio para el cambio en la absorbencia (si cualquier) observado en los pozos de fondo (es decir, pozos con solución de ensayo pero sin células).
  11. Para el análisis, normalizar los datos de absorbancia para el control de medición de 60 minutos o lavar los pocillos con PBS o HBS y luego realizar un análisis de proteína bicinchoninic ácido (BCA).
  12. Añadir albúmina de suero bovino (BSA) estándar de 2 mg/mL (rango de 0.5-2 μL para la curva estándar, dependiendo del grado de confluencia de las células) en los pocillos vacíos (filas G y H), luego añadir el reactivo BCA en todos los pocillos.
  13. Cuantificar los datos mediante nmol de WST-1 reducción por μg de proteína. Utilizar 37 mM-1 cm-1 22 como el coeficiente de extinción para WST-1 reducida en 438 nm.

2. ensayo de reducción de DPIP

  1. Crecer y diferenciar células adherentes C2C12 con el mismo procedimiento que el paso 1.1.
  2. Preparar solución DPIP stock 10 mM como sigue. Disolver 0,029 g de DPIP (FW: 290.08 g/mol) en 10 mL de diH2O. confirmar la concentración de DPIP midiendo absorbancia a 600 nm con un espectrofotómetro. Utilizar 1 mM-1 cm-1 23 como el coeficiente de extinción para la DPIP reducida a 600 nm. Almacenar a 4 ° C.
  3. Añadir a 11,880 mL de PBS para una concentración final de 5 mM 0,0108 g de glucosa. Añadir 120 μl de 10 mM DPIP para una concentración final de 100 μm.
  4. Al medirse la implicación de ascorbato en tPMET, divida la solución en dos alícuotas de 6 mL. A una alícuota, añadir 6 μl de diH2O y a la otra alícuota agregar 6 μl de 2 kU/mL AO para una concentración final de 2 U/mL.
  5. Al medirse la implicación de superóxido en tPMET, divida la solución en dos alícuotas de 6 mL. A una alícuota, agregar 55 μl de 0,1 M KPO4 tampón y a la otra alícuota agregar 55 μl de 6.5 kU/mL de sodio a una concentración final de 60 U/mL.
  6. Los medios de comunicación de aspirar y lavar las células en 150 μL de PBS. Aspire el PBS y añadir 100 μl de solución de DPIP (-) SOD o (-) AO a las columnas 1-6 y agregar 100 μl de solución de DPIP (+) de sodio o (+) AO para columnas 7-12 en la placa de 96 pocillos. Utilizar filas G y H será como controles de fondo (es decir, para monitorear el cambio en la absorbancia del reactivo solamente en pozos sin células).
  7. Medir la absorbancia a 600 nm utilizando espectrofotómetro cada 10 minutos para 1 h. cuantificar el cambio en absorbancia con respecto al control en el minuto 60 similar a pasos 1.9-1.13.

3. determinación de si los aceptadores del electrón reducida son sustratos para AO o TEPES

  1. Añadir a 5,436 mL de PBS o HBS, 240 μl de 10 mM WST-1 para una concentración final de 400 μm y 24 μl de 5 mM PMS para una concentración final de 20 μm.
    1. De DPIP, añadir 60 μL de 10 mM DPIP, para una concentración final de 100 μm, a 5,940 mL de PBS o HBS.
  2. Añada 100 μl de solución para cada bien en una placa de 96 pocillos de fondo plano en la ausencia de células y medir la absorbancia en un espectrofotómetro a 438 nm, para WST-1 y 600 nm, de DPIP.
  3. Añadir 1 μl de ascorbato 10 mM a la mitad de los pozos a una concentración final de 100 μM. Monitorear la absorbancia hasta que se estabilice.
  4. Estabilización, añadir 1 μl de 200 U/mL AO para una concentración final de 2 U/mL en cada pocillo o añadir 1 μl de césped de 6 kU/mL para una concentración final de 60 U/mL a cada uno bien y monitorear la absorbancia de 1 h.

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Resultados

Las estadísticas se realizaron con ANOVA con medidas repetidas utilizando el software estadístico de RStudio25. Tamaños de muestra se indican en las leyendas de la figura.

Para controlar tPMET, miotubos C2C12 se utilizaron junto con aceptadores del electrón extracelular, WST-1 y DPIP. AO se utilizó para determinar que porción del WST-1 y reducción de DPIP fue debido a la emanación de ascorbato y césped se...

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Discusión

Hemos presentado dos métodos para utilizar aceptadores del electrón extracelular, WST-1 y DPIP, en ensayos espectrofotométricos para controlar tPMET en miotubos C2C12. Con el crecimiento de líneas celulares en los procedimientos de cultivo estándar y un lector espectrofotómetro de placas, es posible monitorizar tPMET con estos aceptadores del electrón en un análisis simple de la microplaca. WST-1 reducción es reproducible de pozo a pozo dentro de un ensayo, pero existe variabilidad día a día. El día a día coeficiente de ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino y Neej Patel por su soporte técnico. Este trabajo fue financiado por concesión de servicio de salud pública de Estados Unidos R15DK102122 del Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón (NIDDK) a Jonathan Fisher. El contenido del manuscrito es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la NIDDK o los institutos nacionales de salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Mioblastos C2C12 Colección deCultivos Tipo Americano CRL-1772
Dulbecco's modificado de águila de glucosa media - bajaSigmaD6046
Fetal Plex complejo de suero animalGemini Bio-Products 100-602
penicilina-estreptomicinaSigma516106
suero de caballoGibco Technologies16050-130
Solución salina tamponada con fosfato de DulbeccoSigmaD8537
tripsina-EDTASigmaT4049
placas de cultivo de 15 cmTPP93150
placas de cultivo de 96 pocillosTPP92096
2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio Sal sódica (WST-1)Accela ChemBio  IncSY016315
metosulfato de fenazina SigmaP9625
Ácido L-ascórbicoSigmaA5960
ascorbato oxidasa SigmaA0157
superóxido dismutasa SigmaS5395
2,6-dicloroinndofenol sal sódica ICN Biomedicals215011825
D-(+)-glucosaSigmaG7528
HEPES sal sódicaSigmaH3784
cloruro sódicoSigmaS7653
cloruro potásicoFisher Scientific BP366
sulfato de magnesio heptahidratadoSigmaM5921
cloruro de calcio dihidratadoSigmaC7902
fosfato de potasioFisher Scientific BP363
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Powerwave X-I espectrofotómetro BiotekInsturmentsdescontinuado 
Espectrofotómetro Spectronic Genesys 5 ThermoScientific 336001
PureGrade Microplaca de 96 pocillos, F-bottom, transparente, sin tratar, no estérilMidSci781602 cloruro
de hierro (II) tetrahidratadoSigma220299
sulfato de hierro (II) heptahidratoSigma215422
hipoxantinaSigmaH9636
xantina oxidasa SigmaX4500
ExcelMicrosoft
R StudioRstudiohttps://www.rstudio.com/products/rstudio/
KC4Biotek Instrumentosdescontinuados 

Referencias

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