El objetivo de este protocolo es espectrofotometría monitor plasma trans membrana transporte de electrones utilizando aceptadores del electrón extracelular y analizar las interacciones enzimáticas que pueden ocurrir con estos aceptadores del electrón extracelular.
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Artículo de método
Medición de transporte de electrones membrana Trans-Plasma por C2C12 miotubos
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Transporte de electrones de la membrana trans-plasma (tPMET) desempeña un papel en la protección de las células del estrés reductor intracelular, así como protección contra el daño por oxidantes extracelulares. Este proceso de transporte de electrones de reductores intracelulares a extracelulares oxidantes no está bien definida. Aquí presentamos ensayos espectrofotométricos por C2C12 miotubos para monitorear tPMET utilizando los aceptadores del electrón extracelular: 1 sal de tetrazolio soluble en agua (WST-1) y 2, 6-dichlorophenolindophenol (DPIP o DCIP). A través de la reducción de estos aceptadores del electrón, que son capaces de controlar este proceso en un análisis en tiempo real. Con la adición de enzimas como la ascorbato oxidasa (AO) y superóxido dismutasa (SOD) para el análisis, podemos determinar que la porción de tPMET es debido a la producción de exportación o superóxido ascorbato, respectivamente. Mientras WST-1 fue demostrada para producir resultados estables con bajo fondo, DPIP pudo ser nuevamente oxidado después de la adición de la AO y césped, que se demostró con análisis espectrofotométrico. Este método demuestra un análisis espectrofotométrico en tiempo real, multi-bien, rápido con ventajas sobre otros métodos utilizados para controlar tPMET como ferricianuro (FeCN) y reducción c ferricytochrome.
Introducción
La capacidad de las membranas de plasma purificadas para reducir aceptadores del electrón ha llevado a la vista que la membrana plasmática tiene una capacidad inherente de redox de1. Visto previamente en hongos, plantas y animales, tPMET es un proceso común a múltiples organismos2,3,4,5. En concreto, este proceso ha sido demostrado en Saccharomyces cerevisiae, zanahoria células, eritrocitos, linfocitos, osteosarcoma, melanoma, macrófagos, músculo esquelético y neutrófilos2,<....
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Protocolo
Nota: Vea la figura 1 para una descripción esquemática de los pasos claves.
1. ensayo de reducción de WST-1
- Crecer y diferenciar las células adherentes C2C12 utilizando estándar de la célula cultura procedimientos7 en una placa de 96 pozos utilizando filas A-f.
- Utilizar un medio de diferenciación que consta de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 2% de suero de caballo, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina de 0,1 mg/mL. Incube las células a 37 ° C con 5% CO2.
- Al medirse la implicación de ascorbato en tPMET, suplemento de me....
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Resultados
Las estadísticas se realizaron con ANOVA con medidas repetidas utilizando el software estadístico de RStudio25. Tamaños de muestra se indican en las leyendas de la figura.
Para controlar tPMET, miotubos C2C12 se utilizaron junto con aceptadores del electrón extracelular, WST-1 y DPIP. AO se utilizó para determinar que porción del WST-1 y reducción de DPIP fue debido a la emanación de ascorbato y césped se.......
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Discusión
Hemos presentado dos métodos para utilizar aceptadores del electrón extracelular, WST-1 y DPIP, en ensayos espectrofotométricos para controlar tPMET en miotubos C2C12. Con el crecimiento de líneas celulares en los procedimientos de cultivo estándar y un lector espectrofotómetro de placas, es posible monitorizar tPMET con estos aceptadores del electrón en un análisis simple de la microplaca. WST-1 reducción es reproducible de pozo a pozo dentro de un ensayo, pero existe variabilidad día a día. El día a día coeficiente de .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino y Neej Patel por su soporte técnico. Este trabajo fue financiado por concesión de servicio de salud pública de Estados Unidos R15DK102122 del Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón (NIDDK) a Jonathan Fisher. El contenido del manuscrito es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la NIDDK o los institutos nacionales de salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Mioblastos C2C12 Colección de | Cultivos Tipo Americano | CRL-1772 | |
| Dulbecco's modificado de águila de glucosa media - baja | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex complejo de suero animal | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicilina-estreptomicina | Sigma | 516106 | |
| suero de caballo | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco | Sigma | D8537 | |
| tripsina-EDTA | Sigma | T4049 | |
| placas de cultivo de 15 cm | TPP | 93150 | |
| placas de cultivo de 96 pocillos | TPP | 92096 | |
| 2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio Sal sódica (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| metosulfato de fenazina | Sigma | P9625 | |
| Ácido L-ascórbico | Sigma | A5960 | |
| ascorbato oxidasa | Sigma | A0157 | |
| superóxido dismutasa | Sigma | S5395 | |
| 2,6-dicloroinndofenol sal sódica | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glucosa | Sigma | G7528 | |
| HEPES sal sódica | Sigma | H3784 | |
| cloruro sódico | Sigma | S7653 | |
| cloruro potásico | Fisher Scientific | BP366 | |
| sulfato de magnesio heptahidratado | Sigma | M5921 | |
| cloruro de calcio dihidratado | Sigma | C7902 | |
| fosfato de potasio | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I espectrofotómetro Biotek | Insturments | descontinuado | |
| Espectrofotómetro Spectronic Genesys 5 Thermo | Scientific 336001 | ||
| PureGrade Microplaca de 96 pocillos, F-bottom, transparente, sin tratar, no estéril | MidSci | 781602 cloruro | |
| de hierro (II) tetrahidratado | Sigma | 220299 | |
| sulfato de hierro (II) heptahidrato | Sigma | 215422 | |
| hipoxantina | Sigma | H9636 | |
| xantina oxidasa Sigma | X4500 | ||
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Instrumentos | descontinuados |
Referencias
- Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
- Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide ....
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Reimpresiones y permisos
