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Delgada película compuesto silicio elastómeros para aplicaciones de piel y cultivo celular: fabricación y caracterización

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DOI:

10.3791/57573

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3 de julio de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1INM - Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Materials Science and Engineering, Saarland University, 3University of Applied Sciences Kaiserslautern

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo para el proceso de fabricación de estructuras de compuestos poliméricos de película delgada que poseen diferentes jóvenes moduli o espesores. Las películas se fabrican para estudios del cultivo celular avanzada o como adhesivos de la piel.

Resumen

En este protocolo, se presentan métodos para fabricar películas compuesto elastómero delgada para aplicaciones de cultura avanzada de la célula y para el desarrollo de adhesivos de la piel. Dos-(dimethyl siloxanes) poli diferentes PDMS y pegamento de piel suave (SSA), se han utilizado para en investigación de profundidad de efectos biológicos y características adhesivas. Los folios consisten en una capa de respaldo flexible y una capa superior. Ambas capas son fabricados por la técnica de aplicación de la lámina de doctor. En la presente investigación, se ha investigado el comportamiento adhesivo de los folios como una función del espesor de capa o de una variación del módulo de Young de la capa superior. Módulo de Young de PDMS ha cambiado mediante la variación de la base a la proporción de mezcla del crosslinker. Además, el espesor de las películas de la SSA ha sido variado de aprox. 16 μm a aprox. 320 μm. barrido microscopía electrónica (MEB) y microscopía óptica se han utilizado para mediciones de espesor. Las propiedades adhesivas de láminas de elastómero dependen fuertemente del espesor de la película, módulo de Young de los polímeros y las características de superficie. Por lo tanto, se ha investigado la adherencia normal de estas películas sobre sustratos de vidrio que superficies lisas y rugosas. Pull-off el estrés y el trabajo de separación dependen de la proporción de mezcla de elastómeros de silicón.

Además, el espesor del adhesivo suave piel colocado sobre una capa de apoyo de apoyo ha sido variado con el fin de producir parches para aplicaciones de piel. Citotoxicidad, proliferación y adhesión celular de elución de L929 fibroblastos murinos en películas PDMS (proporción 10:1) y SSA (proporción 50: 50 de la mezcla) se han realizado. Han demostrado, por primera vez, la comparación de lado a lado de películas delgadas de compuestos fabricados de ambos polímeros y presentar la investigación de sus propiedades biológicas y adhesivo.

Introducción

En este protocolo, se presentan métodos detallados para la fabricación de películas delgadas elastómero. El doctor ampliamente disponibles hoja técnica se ha utilizado para la producción de películas delgadas de compuestos. La técnica de fabricación se ha realizado en hojas de polyethylenterephtalate (PET), permitiendo la posterior producción de estas películas en gran escala. El énfasis de este protocolo es la evaluación de reproducibilidad, precisión de la fabricación de las diferentes capas de los folios y la determinación de las propiedades biológicas y adhesión del parche compuesto final. El poly-(dimethylsiloxane) de elastómero de silicona (PDMS) se utiliza ampliamente en tecnología biomédica, incluyendo la producción de adhesivos de la piel, aplicaciones de microfluídica e investigación adicional campos1,2,3 ,4. Recientemente, otra subclase de PDMS, llamados adhesivos de piel suave (SSA) han sido introducidas, en particular para la suave piel de la vinculación y la vinculación.

SSA de silicona son elastómeros de vinilo funcionalizado, difieren de los polímeros análogos por la ausencia de sílice5de refuerzo. Similar a otros PDMS, SSA módulo de Young se puede adaptar en una amplia gama de modulación concentración vinculante o curado tiempo6,7,8. Este cambio en el módulo de Young de los elastómeros de silicona afecta significativamente las propiedades adhesivas del material y también tiene profundas consecuencias en las células procariotas y eucariotas cultivadas en la superficie9,10 , 11. en el nivel biológico celular, demuestra, que las células eucariotas responden en el nivel de la transducción de señal a una modulación de la elasticidad de la matriz o el espesor de la superficie9,10,12 ,13,14. Por lo tanto, existe un amplio interés en aplicaciones de cultivo celular de polímeros con propiedades mecánicas ajustables. Lo importante es la intrínseca baja energía superficial de los elastómeros de silicona no proporciona las condiciones óptimas para el cultivo celular de las células eucariotas. Tratamiento plasma de oxígeno es una técnica ampliamente utilizada para aumentar el PDMS baja energía superficial temporalmente, conduce a una mejora de su fuerza pull-off, disminución de adsorción superficial de las moléculas, mientras que paralelamente promover la fijación, difusión y proliferación de las células eucariotas15,16,17,18.

Además de las propiedades de los materiales, la topografía de la superficie afecta significativamente la adhesión celular y la interacción adhesiva entre dos materiales19,20,21,22. Rugosidad de la superficie tiene varios efectos en la formación de contacto entre dos superficies: reducción de la superficie de contacto, alta almacena energía elástica que rodea asperezas así como influencia en la propagación de la grieta puede alterar la fuerza adhesiva23, 24. Adhesión de películas a la piel humana es un campo emergente de la aplicación, por ejemplo, apósitos, fijación de los electrodos de ECG u otros dispositivos electrónicos portátiles25,26,27, 28. Para medir el rendimiento adhesivo de auto-adhesivos en relación con la topografía de la superficie, substratos de vidrio con diferentes grados de rugosidad pueden utilizarse en mediciones de adherencia normal8,21. Aquí, dos substratos de vidrio han sido seleccionados para la investigación de las propiedades adhesivas de las películas de polímero. Se caracterizaron las películas primeras, compuestas con una capa de forro de PDMS en una proporción de 10 a 1 peso partes cubiertas por PDMS con diferente proporción de mezcla. En un segundo paso una capa adhesiva de SSA fue preparada con cantidades de peso igual de ambos componentes y con diferentes espesores de película en la parte superior una soporte película PDMS.

Protocolo

PRECAUCIÓN: Consulte todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) antes de su uso. Algunos de los productos químicos utilizados en el presente Protocolo son irritantes, agudo tóxicos o cancerígenos. Utilice todas las prácticas de seguridad al manejar estos productos químicos. Esto incluye el uso de la ingeniería (gabinete de química) y personal equipo de protección (gafas, guantes, bata, pantalón largo y zapatos cerrados). Porciones de los siguientes procedimientos involucran el cultivo de una línea de células animales. Por lo tanto, por favor siga las normas de bioseguridad específicas. Residuos químicos y biológicos deben eliminarse según las normas nacionales e institucionales específicas y recomendaciones.

1. elaboración de estructuras compuestas de silicio elastómeros de película delgada

  1. Preparación de polímeros
    1. Para preparar 1,1 g de PDMS en la proporción 10:1, mezcla de 1,0 g del compuesto con 0,1 g de compuesto B.
    2. Mezcla y degase prepolímeros en un mezclador de velocidad a 2350 rpm bajo vacío durante 3 minutos.
    3. Cambiar las relaciones de masa entre el compuesto A y B compuesto a 45:1 y 70:1. Preparación similar al método descrito en 1.1.2.
    4. Preparar 1 g de adhesivo piel suave (SSA) en una proporción de 50: 50. Por lo tanto mezclar 0,5 g del compuesto A y 0,5 g de compuesto B como se describe en 1.1.2.
  2. Preparación de-(vinyl alcohol) polivinílico (PVA) recubierto de lámina de PET
    1. Preparar una solución PVA de 18% (p/p) en agua mediante la adición de PVA a agua desionizada y mezclar toda la noche con un agitador magnético. Almacenar esta solución a 4 ° C.
    2. Preparación de películas delgadas exhibiendo un espesor efectivo de 15 μm con la máquina de aplicación doctor blade, usando 100 μm boquete de la hoja y una velocidad de aproximadamente 2.0 mm/s.
    3. Colocar las películas en un horno a 95 ° C durante 15 minutos.
  3. Preparación de la capa de apoyo de PDMS 10:1 proporción por técnica de la lámina de doctor
    1. Use una máquina de aplicación de hoja de médico controlado automáticamente para la preparación de películas delgadas.
    2. Limpiar la lámina de PET con 100% de isopropanol y coloque sobre la superficie de la zona de aplicación de la hoja de médico.
    3. Coloque la cuchilla en la parte superior la hoja y ajustar el espesor con el micro tornillos de posicionamiento. Para la fabricación de las capas húmedas, aplicar espesores de 60 μm, 100 μm, 200 μm y 500 μm.
    4. Llene el polímero de 10:1 de PDMS preparado en el paso 1.1 en el embalse de la lámina de doctor con una jeringa de uso único. Iniciar el movimiento de la hoja con una velocidad de aproximadamente 2.0 mm/s.
    5. Retirar la película del animal doméstico con la capa aplicada de 10:1 de la máquina y colóquela en el horno durante 1 hora a 95 ° C, situado en una sala de exhibición humedad entre 40% y 65%.
    6. Limpie la cuchilla con isopropanol y papel toallas.
    7. Repita este procedimiento para todos los gruesos necesarios.
  4. Preparación de la capa superior de PDMS en diferentes relaciones de mezcla por técnica de la lámina de doctor
    1. Eliminar rayas finas de los lados de la longitud de la película subyacente con un bisturí o cuchilla para permitir la colocación y desplazamiento de la cuchilla sobre la lámina de PET.
    2. Siga los pasos del protocolo 1.3.3 a 1.3.6. Espesor húmedo aplicado para la película es 160 μm.
    3. Repita este procedimiento para la producción de dos películas independientes con otra proporción de los componentes PDMS (45:1 y 70:1). Almacenar las películas a temperatura ambiente (aprox. 22 ° C y una humedad entre el 40 y el 65%) en cajas Petri cuadrada para evitar contaminación y polvo.
  5. Preparación de películas delgadas de compuestos exhibiendo diferentes espesores de la capa de 50: 50 de la SSA
    1. Preparar películas PDMS 10:1 como una capa de forro, tal como se describe antes en el paso 1.3.
    2. Siga los pasos del protocolo 1.4.1 y 1.4.2 para producir estas películas. Uso de SSA en la proporción de mezcla de 50: 50 y fabricación de una película con un espesor húmedo de 40 μm.
    3. Repita el procedimiento para los gruesos de la mojada adicionales: 120 μm, 300 μm, 500 μm.

2. mediciones de adherencia normal utilizando sustratos con diferente rugosidad

  1. Preparación y caracterización de sustratos de vidrio con rugosidad superficial de diferentes
    1. Use un cilindro de vidrio con 2 mm de diámetro como un 'substrato suave'.
    2. Para fabricar una pieza el impuesto 'sustrato ásperas' con un cortador de vidrio con la dimensión de unos 4 x 4 mm de un portaobjetos de vidrio esmerilado. Utilice una almohadilla de la mano de abrasivos de diamante para obtener un área circular de unos 3 mm de diámetro.
    3. Coloque el cristal en un cono de aluminio con pegamento Ultravioleta e iluminar en la cámara de iluminación UV durante 3 minutos.
    4. Determinar el radio de la superficie del sustrato con un microscopio óptico. Calcular el área según la fórmula A = πr2.
    5. Determinar la rugosidad parámetro Ra y Rz (según: DIN EN ISO 4287, ASME B46.1) con un Perfilómetro de aguja.
    6. Colocar el sustrato en el escenario de la muestra del Perfilómetro y llevar la punta (diamante, estándar: 2 μm/60 °) en contacto con la muestra.
    7. Registrar el perfil de rugosidad con una velocidad de 0.3 mm/s y una longitud de 1 mm.
    8. Para analizar la topografía de la superficie, medir un área de exactamente 1 mm2 con un Perfilómetro de aguja, operada por el software asociado.
      Nota: El Perfilómetro es operado por una computadora externa. El titular es cambiado de puesto por 0,001 mm en la dirección y después de un desplazamiento de 1 mm se alcanza en x dirección. Las grabaciones. RS3 archivo se importa en Surfcom mapa experto en Software para crear imágenes en 3D.
  2. Medición de adherencia normal de películas delgadas fabricada de PDMS o SSA
    1. Utilice una cuchilla para cortar las películas en el papel de la PET en trozos pequeños con un área de aproximadamente 4,0 cm2 y lugar ellos en un vaso con pegamento UV. Iluminar con UV luz durante 3 minutos.
    2. Montaje de la muestra polimérica en el portamuestras.
    3. Limpie el sustrato superficial suavemente con etanol y secado con nitrógeno.
    4. Coloque el sustrato de vidrio, montado en el cono de aluminio, a la celda de carga.
    5. Utilice la tabla inclinable (goniómetro) para alinear las superficies precisamente ajustando el ángulo de inclinación del substrato a la película polimérica. Para ello, traer el sustrato manualmente en contacto con la película. Cambiar el ángulo de inclinación hasta que se obtiene una alineación totalmente paralela de ambas superficies entre sí, visualizada por las imágenes de las cámaras.
      Nota: La celda de carga se conecta a la Mesa inclinable. Un prisma de cristal se encuentra por debajo de la muestra como se muestra en la figura 4, permitiendo la visualización de la zona de contacto con dos cámaras y la alineación del sustrato en la película de polímero.
    6. Mover el sustrato a la superficie de la película polimérica hasta una tensión de carga de 13 ± 5 kPa es alcanzado (figura 4).
    7. Inicie el paquete de software programado personalizado escrito en LabView para controlar que los parámetros de medición tales como mantener velocidad tiempo y enfoque/retracción. La espera tiempo tmantenga es 1 segundo, el enfoque y la velocidad de separación es de 30 μm/s y 10 μm/s respectivamente.
    8. Realizar mediciones de adherencia en tres muestras fabricadas independientes y en seis lugares diferentes en cada superficie de la película.
  3. Análisis de datos y cálculo de los principales factores mecánicos: pull-off el estrés y el trabajo de separación.
    1. Calcular la tensión figure-protocol-1 dividiendo las grabaciones de la fuerza por el área de sustrato AS.
      figure-protocol-2
    2. Determinar la tensión de pull-off, que se describe como el valor máximo de la tensión normal.
      figure-protocol-3
    3. Obtener la Δs de desplazamiento por la substracción de la posición de inicio de la resistencia a la tracción régimens0 de muestra posición sfinal donde la vinculación se ha completado. Definir el inicio del régimen de resistencia a la tracción como s0 = 0.
      figure-protocol-4
    4. Corregir los valores medidos de la posición de la muestra por el cumplimiento del sistema de C según la siguiente ecuación:
      figure-protocol-5
    5. Integración de la curva de tensión-desplazamiento entre s0 y sfinal para calcular el trabajo de separación.
      figure-protocol-6
  4. Cálculo de factores mecánicos claves utilizando el software de computación matemática origen.
    1. Importar el archivo de .dat grabado de una medida de adherencia individual en una tabla de origen. Los parámetros que se registran son tiempo, muestra la posición y fuerza. Introducir estos parámetros en las columnas A (tiempo), B (posición de la muestra) y C (fuerza).
    2. Para determinar el valor en blanco, un promedio de cerca de 20 valores de medición de la fuerza antes de entrar en contacto con la película de polímero. Estedesplazamiento del valor medio F el nombre y pegarlo en la columna D.
    3. Calcular el fondo corregido de la fuerza F * según la siguiente ecuación
      figure-protocol-7
      y esta ecuación, como se muestra a continuación, en la columna E.
      figure-protocol-8
    4. Definir el inicio del régimen de resistencia cero desplazamiento, es decir, s0 = 0. Por lo tanto, determinar s0 y restar de la dislocación en la columna B y guardarlo en columna F:
      figure-protocol-9
    5. Además, corregir la posición de la muestra por la conformidad de la máquina. Esta corrección se realiza en la columna G. Insertar la siguiente ecuación en columna G
      figure-protocol-10
    6. Calcular la tensión en la columna siguiente H. Por lo tanto, se divide la fuerza por el área del sustrato. Inserte la siguiente ecuación
      figure-protocol-11
      donde A es el área superficial de los sustratos de vidrio en mm2 (determinada en el punto 2.1).
    7. Calcular el trabajo de la separación de los valores de tensión y desplazamiento. Por lo tanto, trazar el desplazamiento a lo largo del eje x y la tensión a lo largo del eje y. Integran este gráfico de s0 sfinal donde la sfinal se define como el desplazamiento en el que la tensión extensible regresa a cero, es decir, el completo desprendimiento tuvo lugar. Para integrar el gráfico, seleccione la función de integrar. Agregar los valores calculados en las columnas I y J.

3. Caracterización de las películas por análisis de microscopía electrónica (MEB) y microscopía óptica

  1. Microscopía óptica
    1. Con una cuchilla de afeitar cortada la película polimérica pequeña (aprox. 0,25 cm2) y colocar al borde de un portaobjetos de vidrio. El portaobjetos de cristal verticalmente orientado bajo un microscopio vertical y mida el espesor de la sección transversal de la película.
      Nota: Utilice un objetivo de 20 X (NA = 0.45, resolución teórica en 800 nm de 1.1 μm) para medir valores de espesor de película de aproximadamente ≤ 20 μm. Para una película de grosor en el rango de 20 μm a 50 μm utilice un objetivo de X 10 (NA = 0.30, resolución teórica en 800 nm de 1.6 μm) y para una película de espesor ≥ 50 μm utilice un objetivo de X 5 (NA = 0.15, resolución teórica en 800 nm de 3.3 μm).
  2. Investigación de SEM
    1. Cortar la lámina de PET y coloque una muestra de aproximadamente 2 cm2 en un portaobjetos de vidrio y Coloque verticalmente el mecanismo de sujeción dentro del muestra titular ≤ 2 mm por debajo de la superficie superior del soporte.
    2. Seleccione un voltaje de aceleración de 10 kV, el detector de electrones retrodispersados (BSD) y bajo condiciones de vacío (60 Pa).
    3. Ajustar el enfoque, el aumento, el brillo y el contraste de las imágenes.
    4. Elegir un tiempo de adquisición de imagen de 28 s con una resolución de 1024 x 2048 píxeles.
    5. Retire el soporte de la muestra de la SEM.

4. biológico investigación

  1. Células de cultura de elución de L929 rutina celular
    1. Usar la línea celular de fibroblastos murinos elución de L929 para investigación. Cultura de las células en medio basal de Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, suplementado con suero bovino fetal 10% y penicilina y estreptomicina a 37 ° C, 5% CO2 en T75 frascos de cultivo de células. Paso de las células en una confluencia de aproximadamente 70 a 80%.
    2. Para celular pases, quitarlo del medio por la aspiración y lavado con calcio y magnesio libres de tampón fosfato (DPBS- / -) por 30 s con un gabinete de flujo laminar. Luego incubar las células con 2 mL de Accutase, una solución de enzimas proteolíticas y colagenolíticas actividad hasta 5 min a 37 ° C, 5% CO2.
    3. Verificar la separación de las células de la superficie de frasco de cultivo celular con un microscopio de contraste de fase.
    4. Añada 8 mL de suero que contiene medio en el matraz y la transferencia de la suspensión de células a un tubo de ensayo de 15 mL.
    5. Tomar un 10 μl de muestra de la suspensión de células y mezclar con 10 μl de azul tripán.
    6. Determinar el número de celular con una cámara de Neubauer y calcular el número total de células.
      PRECAUCIÓN: Azul de tripano es tóxico, por lo tanto consultar la MSDS, siguiendo los procedimientos obligatorios descritos en la MSDS, se requiere uso de protección personal apropiado y la manejo debajo de un gabinete de química. Recoger basura para deposición de residuos química.
      Nota: Las células positivas de Azul Trypan se colorean azules, indicando que las membranas celulares no intacta.
    7. Para el siguiente paso, 5 x 105 células en cultivo en un nuevo estériles celular matraz de cultivo con 10 mL de medio de nuevo. Para las condiciones experimentales, cultura 3 x 105 células en las placas bien 6 y 6 x 104 células en cada pocillo de la placa bien 24, que contiene muestras poliméricas (paso 4.2 del Protocolo).
  2. Elaboración de folios para los experimentos de cultivo celular.
    1. Piezas únicas de impuestos especiales de las películas de las dimensiones deseadas fabricadas en paso del protocolo 1.4 y 1.5 de la capa de apoyo de PET con un bisturí y un lugar con una pinza sobre la superficie del cubreobjetos vidrio exhibe un diámetro de 12 mm. Coloque las muestras en los pozos de 2 4 placa del bien.
    2. Para la determinación de la citotoxicidad y recuento celular, no retire las películas de la lámina de PET. Corte de áreas circulares de aproximadamente 9,4 cm2, cuidadosamente en los únicos pocillos de una placa bien 6, de las películas produjo en 1.4 y 1.5 y colocarlos en los pocillos de una placa de cultivo celular.
    3. Sumergir las muestras de polímero desionizada H2O ≥ 30 minutos.
      Nota: Las muestras poliméricas se pueden esterilizar en autoclave. Por lo tanto, retirar todas las muestras de polímero que contiene los platos de cultivo celular y colóquelas dentro de un caja de Petri de vidrio. La esterilización se realiza en un autoclave a 2.05 bar por 20 min a una temperatura de 121 ° C.
  3. Tratamiento de plasma de polímeros
    1. Ponga las películas que se unen en PET papel redonda de vidrio cubreobjetos (fabricados en 4.2.1) dentro de la cámara de reacción del dispositivo de plasma.
    2. Cierre la tapa y evacuar hasta que se alcanza una presión de 1.6 x 10-2 mbar.
    3. Realizar tratamiento del plasma durante 3 minutos.
    4. Ventilar la cámara de reacción y coloque las muestras en 24 bien o 6 platos bien para otras investigaciones de la cultura de célula.
    5. Utilizar una muestra para determinación de ángulo de contacto del agua con un goniómetro. Por lo tanto, mueva la jeringa cerca de la superficie polimérica, utilizando el paquete de software y coloque una gota de 3 μl de agua sobre la superficie. Calcular el ángulo de contacto de agua estática con el software de goniómetro.
  4. Microscopia y tinción
    1. Preparar las células como se describe en el paso 4.1.7 y cultura para el 3 d a 37 ° C y 5% CO2.
    2. Capturar imágenes de contraste de fase de células cultivadas durante tres días en aguas cristalinas- y plasma tratado películas poco antes de la fijación.
    3. Preparación de PBS suplementado con 0.2% Tritón X-100. Lentamente pipetee 200 μL de la solución madre en 100 mL de PBS (PBS-T).
    4. Preparar una solución al 4% / PBS paraformaldehido (PFA/PBS-T).
      PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxico, por lo tanto consultar la MSDS, siguiendo los procedimientos obligatorios descritos en la MSDS y se requiere uso de protección personal apropiado y la manejo debajo de un gabinete de química.
    5. Preparar una solución de PBS-BSA/T 5%.
    6. Quitarlo del medio por la aspiración bajo el flujo de lámina gabinete. Añadir PBS en los pocillos para eliminar residuos de medio.
    7. Transferir la placa a un gabinete de química y reemplazar PBS con 400 μL de la solución PFA/PBS durante 25 minutos a temperatura ambiente.
    8. Retirar la solución PFA/PBS de los pozos individuales, cuidadosamente lavar con PBS cuatro veces. Espere 3 minutos entre cada paso de lavado y recoger las soluciones para eliminación de residuos químico. Utilizar la placa directamente o guardar a 4 ° C.
    9. Añadir 5% albúmina de suero bovino (BSA) / PBS-T a los pocillos e incubar 60 min a temperatura ambiente para bloquear sitios de Unión inespecíficos.
    10. Aspirar la solución y reemplazarla con un phalloidin conjugado con Alexa-488 (dilución 1: 160) / solución de PBS-T complementado con 0,2% Tritón X-100.
      PRECAUCIÓN: Phalloidin-488 es tóxico, por lo tanto consultar la MSDS, siguiendo los procedimientos obligatorios descritos en la MSDS y se requiere uso de protección personal apropiado y la manejo debajo de un gabinete de química.
    11. Cubra la placa con papel de aluminio e incubar durante 3 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
    12. Aspirar la solución y lavar tres veces con PBS. Esperar 3 minutos entre cada paso de lavado. Recoger las soluciones para eliminación de residuos químico.
    13. Preparar una solución de 1 μl de colorante Hoechst 33342 (stock solución 1 mg/mL). Para una dilución de 1: 1000 μl de pipeta 1 de Hoechst tinte 3334 a 1 mL de PBS-T y mezclar bien. Añadir 300 μL de la solución 33342 Hoechst tinte a los pocillos e incubar 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
      PRECAUCIÓN: Colorante Hoechst 33342 es un reactivo intercalante de ADN y por lo tanto potencialmente mutagénicos, por lo tanto consulta el MSDS, siguiendo los procedimientos obligatorios descritos en la MSDS y uso de protección personal adecuada y manejo bajo un gabinete de química se requiere.
    14. Aspirar la solución y lavar las muestras cuatro veces con PBS. Esperar 3 minutos entre cada paso de lavado. Recoger la solución para la eliminación de residuos químico.
    15. Para empotrar, con cuidado quitar las películas de la superficie de cultivo y los coloca en un portaobjeto de microscopio. Añadir 20-40 μl de medio incrustación soluble del agua a la película y coloque un cubreobjetos circular vidrio nuevo en la parte superior ejerciendo una leve presión.
    16. Realizar la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia. Filtros necesarios para la iluminación: Alexa 488 tiene un máximo de excitación en el 496 nm y el máximo de emisión se produce en 519 nm. Por lo tanto, el color de emisión es verde. Hoechst 33342 de tinte trihydrochlorid trihidrato complejado con el ADN tiene una excitación emisión complejo ADN máximo a 355 nm y el máximo ocurre a 465 nm.
  5. Determinación de la citotoxicidad y la determinación del número de células
    1. Realizar el experimento con células cultivadas en las células preparadas en el paso 4.1.7 y platos bien preparados en el paso 4.3 6. Las células de cultivo durante 3 días a 37 ° C y 5% CO2. Para el control positivo, utilizamos las células que crecieron en un cultivo celular tratan superficie del poliestireno, no que películas poliméricas. Para la determinación de fondo (condición negativa), obtener medio de un pozo sin células.
      Nota: Medio puede tomarse también de las células que contienen bien cultivadas en la superficie del poliestireno celular cultura tratada.
    2. Según el número de tubos de 15 mL de la etiqueta de las muestras experimentales.
    3. Agregar 40 μl de una solución de PBS que contiene 0,9% Tritón X-100 para el control positivo y mezcla vigorosamente con una punta de 1000 μl. Espere unos 3 minutos aproximadamente.
    4. Sin la eliminación de las células a la superficie, aspirar el medio de todas las muestras, incluyendo muestras preparadas en 4.5.3 y transferencia al medio a los tubos de 15 mL. Añadir 3 mL de DPBS- / - a los pozos individuales y almacenar las planchas bajo el gabinete para la determinación del número celular como se describe en 4.5.9 de flujo laminar.
    5. Centrifugue a 200 x g durante 3 minutos y retirar 1 mL del sobrenadante para la determinación de la actividad LDH. Almacenar los tubos de 15 mL que contiene las células y queda medio bajo el gabinete de flujo laminar.
    6. Para el ensayo se utilizan un negro placas de 96 pozos con fondo plano. Añadir 50 μl de reactivo de CytoTox uno a 50 μl de muestra mediano y mezcla bien durante 30 s.
    7. Cubra la placa con papel aluminio y almacenar durante 10 min a TA.
    8. Añadir 25 μl de la solución de parada a cada pocillo y registrar la intensidad de fluorescencia con un lector de fluorescencia. Agitar la placa por 10 s y detectar la señal de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 520 nm y una longitud de onda de emisión de 560 nm. Evitar las burbujas de aire.
    9. Para la determinación de la aspirada de número de celular la DPBS- / - de los pozos de la placa de cultivo de protocolo paso 4.5.4 y agregar las soluciones en los tubos de reacción de 15 mL que contiene los sobrenadantes en número de paso protocolo 4.5.5.
    10. Centrifugar el tubo de reacción de 15 mL a 200 x g durante 3 min y aspirar el sobrenadante. Añadir 0,5 mL de tripsina/EDTA e incubar 10 min a 37 ° C.
    11. Añadir 2 mL de tripsina/EDTA en los pocillos de la placa e incubar durante unos 10 minutos a 37 ° C para separar las células de las películas poliméricas.
    12. La suspensión celular se transfiere al tubo de reacción de 15 mL de paso numero 4.6.10. Además, lave las placas vigorosamente con suero que contiene el medio.
    13. Centrifugar las muestras a 200 x g durante 3 minutos, aspirar el sobrenadante y añadir suero conteniendo medio al tubo.
    14. Determinar el número de celular y como se describe en los pasos 4.1.5 y 4.1.6.

Resultados

Los primeros experimentos, películas PDMS con constante cociente de 10:1 de mezcla y espesor variables fabricadas en láminas de PET (figura 1). Porque el espesor de la capa de apoyo puedan afectar significativamente a la rigidez y propiedades de las películas compuestas enteras, en los experimentos iniciales solo películas entre 13 ± 2 μm y 296 ± 13 eran de manejo fabrican (figura 1). Es bien conocido, que durante la contracción proceso curado de las películas de polímero se produce. Para las películas más delgadas, se observó una diferencia de 78% ± 3,1% entre las condiciones húmedas y curados. Para las películas más gruesas, contracción de 40,9% ± 2,6% ha sido detectado (figura 1).

Para las aplicaciones presentadas en este protocolo, películas necesitan ser eliminado manualmente de la lámina de PET. Reconocimos que especialmente delgadas películas son difíciles de manejar con pinzas y a menudo son destruidas durante este proceso. Por lo tanto, investigamos la influencia de un fino poly (alcohol del vinilo) de la capa como capa de apoyo. PVA posee una alta rigidez y puede eliminarse fácilmente debido a su solubilidad de agua en aplicaciones posteriores. La capa aplicada de PVA tiene un grosor de aprox. 17 μm y por lo tanto películas PDMS cubiertas encima de esta capa son ligeramente más delgado en comparación con películas sin la capa de PVA (datos no mostrados). Especialmente centrado en las propiedades de manejo, se concluye que sólo la película más delgada requiere una apoyo película PVA para el retiro de la hoja del animal doméstico.

Un espesor de película eficaz de unos 40 μm fue seleccionado para todos otros experimentos. Para la producción de folios, la proporción de mezcla de PDMS era varió de 10:1 para 45:1 y 70:1 y aplicada sobre la película previamente polimerizada de PDMS con la técnica de la lámina de doctor (figura 2A). Con la excepción de la relación 10:1, las diferentes películas podían distinguirse claramente por microscopía óptica con la precisión adecuada. Para el análisis microscópico las películas eran cortar con un bisturí y Unidas al borde de un portaobjetos de vidrio. Las proporciones de mezcla más alto de la capa superior aparecieron visualmente más brillantes en las imágenes microscópicas en comparación con la proporción 10:1 de la capa de apoyo (figura 2B). Además, microscopía electrónica de barrido se utilizó a la imagen de las muestras de un aumento de aproximadamente 860 X (figura 2). Una diferencia claramente observable en brillo entre las dos películas PDMS, fabricado en proporciones de mezcla mayores fue reconocida, en contraste con la proporción 10:1. El procedimiento de corte deja marcas visibles en las imágenes de SEM (figura 2B). Basado en estos resultados, el espesor total promedio de los folios era 112 μm ± 5.0 μm (Figura 2D).

En otros experimentos se han determinado las propiedades de adherencia de estas películas con fuerza normal medidas de adherencia utilizando dos sustratos de vidrio diferentes (figura 3). El 'substrato suave' posee una textura de la superficie con una rugosidad media aritmética Runa de 0,013 ± 0.0002 μm y un pico a Valle medio Rz de 0.12 μm ± 0.004 (Figura 3A). Substrato 2 (GS2, señalado como áspero) valores de rugosidad de 0,338 ± 0.021 (Ra) μm y 2.055 ± 0.017 (R,z) (figura 3B). Con la media obtenida en la superficie del sustrato 'Lisa' fue 3,2 mm2 mientras que para el substrato 'áspero' una superficie de 6,07 mm2 2.1.4 radio se ha calculado.

Con estos dos sustratos, se ha determinado el comportamiento adhesivo de las diferentes películas. Dos parámetros se eligen para describir las propiedades adhesivas de las películas: el pull-off tensión σmax y el trabajo de separación Wsep. Durante todo el proceso de vinculación y la vinculación de la posición de la muestra s y la fuerza normal F se registran. Los resultados están representados en una curva de tensión-desplazamiento (figura 4).

Para la correcta interpretación de los resultados experimentales, resulta de importancia para alinear con precisión el sustrato a la superficie de la película polimérica. También, la conformidad de la máquina del equipo de medida debe tener en cuenta para corregir el desplazamiento. Durante la medida de la fuerza aplicada actúa no solamente en la muestra, sino también en otras partes del dispositivo de prueba. Por lo tanto, cada uno de los dos sustratos se presiona contra un portaobjetos de vidrio con un esfuerzo de compresión de 13 ± 5 kPa. Para medir el cumplimiento, la curva de carga se toma en cuenta, es decir, la parte de la curva fuerza-desplazamiento donde las dos superficies entran en contacto hasta la posición de la muestra donde se alcanza la fuerza exacta de la precarga. La recíproca pendiente de la curva es igual a la conformidad de la máquina C. El valor calculado de C es 0,12 μm/mN.

En el primer experimento se analizaron películas con diferentes proporciones de mezcla de PDMS (figura 5). De los folios, el espesor y la proporción de mezcla de la capa de apoyo, fabricada de PDMS 10:1 se mantuvo constante. El espesor de la capa superior también se mantuvo constante con un valor de 65 μm. La mayor tensión pull-off de 109 ± 27,6 kPa se determinó con el sustrato de vidrio lisa en la película de 10:1 de PDMS (figura 5A). Un aumento de la proporción de mezcla se lleva a una disminución de la tensión de pull-off a 76,7 ± 17 kPa para proporción 45:1 y 41.4 ± 17 kPa para la relación 70:1. Con la tensión del sustrato un pull-off cristal áspero de 22 ± 2,2 kPa se determinó en la película de 10:1 de PDMS. En general, el trabajo de separación fue comparable entre ambos substratos de vidrio, por ejemplo., 1,4 ± 0,6 J/m2 en la película más delgada obtenida con el substrato suave y 1.84 ± 0,7 J/m2 en la película más delgada obtenida con el sustrato ásperas ( Figura 5B).

A continuación, la producción de películas delgadas para aplicaciones de piel y cultivo celular aplicaciones han sido exploradas (figura 6). SSA 50: 50 se ha utilizado para la producción de la capa superior de los folios. PDMS en una 1:10 cociente de mezcla de aprox. 40 μm de grosor se ha utilizado como una capa de forro. En contraste con los experimentos anteriores representados en la figura 5, se varió el espesor de la capa superior, mientras que la proporción de mezcla se mantuvo constante (figura 6A). SSA ha sido seleccionada debido a sus propiedades adhesivas en aplicaciones que implican adhesión a superficies con alta rugosidad de la superficie, especialmente la piel humana, con la recomendación de fabricantes del cociente de la mezcla 50: 505,8. Epidermis humana posee una alta rugosidad de la superficie. Región que una profundidad de rugosidad media (R,Z) entre 48 μm y 71 se ha reportado29dependiendo de la edad y anatómica. Adhesión segura y suave de la piel es importante, particularidad para la sensible piel de los recién nacidos o apenas regenerando la piel de los ancianos. Se aplicaron diferentes espesores húmedos que van de 40 μm, 120 μm, 300 μm y 500 μm (figura 6A). Función del espesor húmedo, el espesor total de los folios varía entre 51 μm y 344 (Figura 6B). Después de curado, el compuesto colocados en la parte posterior de la mano de los voluntarios (figura 6). Los espesores de diferentes películas muestran claramente las diferencias en sus propiedades de adaptación a la rugosidad de la piel (figura 6). Películas delgadas (50 μm y 100 μm espesor total) muestran una alta tasa de adaptación para las arrugas de la piel en comparación con las películas más gruesas (220 μm y espesor total 340 μm). Estos resultados indican que folios con una amplia gama de espesores pueden producir precisamente con la técnica de la lámina de doctor aplicada.

Se realizaron experimentos de adhesión con estos folios (figura 7). Dependiendo del grosor de la película superior de SSA, hemos observado una disminución de la tensión de pull-off con mayor espesor de la película. Se midió la fuerza pull-off más alta de 133 ± 36,6 kPa en el substrato suave (Figura 7A). El menor tirón de estrés de 18 kPa ± 4 se obtuvo con el sustrato ásperas en la película más gruesa. Es interesante una comparación entre ambos sustratos revela una diferencia de 2,7 veces en las películas más delgadas (Figura 7A). Con mayor espesor de la película, especialmente en las películas más gruesas diferencia notable no era observable (Figura 7A). Con el sustrato liso un trabajo de separación de 1.8 ± 0.8 J/m2 se detectó en la película, exhibiendo un espesor total de aproximadamente 100 μm, seguido por una disminución dependiente del espesor de película (220 μm espesor: 1,6 ± 0,6 J/m2 y 330 μm: 1,3 ± 0.4 J/m2 (Figura 7B)). El trabajo de separación con los substratos ásperos fue en general ligeramente inferior en comparación con el sustrato suave (100 μm de grosor: 1.63 ± 0.6 J/m2; 220 μm espesor: ± 0,6 1,1 J/m2 y 330 μm: 1,0 ± 0,2 J/m2 (figura 7B )).

Además, el mecanismo de desprendimiento se registró durante la medición (figura 7). Poca cavitación se observó en la película más delgada, mientras que el aspecto del dedo como grietas era observable en las películas más gruesas (figura 7).

Las mediciones se han realizado dentro de un mes después de la fabricación de las películas. Sin embargo, la estabilidad y preservación de las propiedades mecánicas de las películas elásticas pueden afectados por factores ambientales, como temperatura y humedad. Como se describe en el paso de protocolo 1.4.3, las películas se han almacenado a temperatura ambiente y una humedad de 40-65%. Para prevenir de la contaminación y el polvo, las películas se han almacenado en cajas Petri de plástico en la oscuridad. Para investigar la estabilidad a largo plazo, las medidas de adherencia y determinación de espesor de SSA se han realizado películas de 50: 50 aprox. cuatro meses después de la fabricación. Se ha detectado ninguna influencia importante en el espesor de la película, pull-off estrés y trabajo de separación después de almacenaje. Por ejemplo, pull-off tensión de folios de la SSA fabricado con un espesor húmedo de SSA de 120 μm y un espesor húmedo de 100 μm PDMS fue 46,6 ± 6 kPa y el trabajo de separación 1627 ± 592 mJ/m2 después de la fabricación. Aprox. cuatro meses después de la fabricación, se determinan una tensión pull-off de 48,8 ± 5.4 kPa y un trabajo de separación de 1666 ± 723 mJ/m2 . Además, poco después de fabricación, el espesor total de estas películas fue 103.3 ± 13.9 μm y después almacenamiento 98.1 ± 9.1 μm.

En otros experimentos de PDMS 10:1 y folios de SSA 50: 50 con un grosor total de aprox. 105 μm han sido utilizados como sustratos de cultivo (figura 8) de la célula. Folios, fabricados en el protocolo paso número 1 pueden ser fácilmente extraídos de la hoja del animal doméstico y cortados en formas geométricas y dimensiones requeridas. Además, al adherir las películas a un rígido superficial, por ejemplo cristal, múltiples películas con módulos de Young diferentes pueden colocarse al lado y podrían colocarse dentro de un único pozo de una placa de cultivo celular. Películas pueden fijarse a la superficie del poliestireno directamente sin un cubreobjetos adicional. Además, películas podrían ser adaptadas a diferentes superficies y estructura geométrica, como tubos o anillos, que permite más estudios no alcanzables con los materiales de cultivo celular convencional. En los experimentos realizados, representados en la figura 8 folios en papel de la PET se han colocado directamente en placas de cultivo de células o películas han sido extraídas de la hoja del animal doméstico y colocar el cubreobjetos de vidrio. Para las condiciones experimentales, algunos polímeros han sido tratados con plasma de aire para aumentar su energía libre superficial. En general, PDMS posee un ángulo de contacto del agua de aprox. 115° antes del tratamiento de plasma y se convierte en altamente hidrofílico (agua ángulo de contacto < 30°) tratamiento posterior8. Tratamiento de plasma hace que la superficie biocompatible y facilita la fijación de las células eucariotas. Dependiendo de la intensidad y duración del tratamiento se altera la superficie del polímero, mostrando un mayor grado de aspereza y también puede aparecer el crack. Inmediatamente después del tratamiento, se observa un proceso de recuperación hidrofóbica. Como se describe en paso protocolo 4.3.5 se utilizó un goniómetro para determinar los ángulos de contacto de agua estática. Por lo tanto, los polímeros que han sido colocados en ddH2O por 1 h después del tratamiento de plasma de aire fueron analizados posteriormente. Tratamiento de plasma reduce el ángulo de contacto de agua significativamente (PDMS prístina: 117.0 ± 2,2 °; Prístina de la SSA: 127.9 ± 5,6 °; Plasma PDMS: 18,0 ± 7,2 °; Plasma de SSA: 29.3 ± 11,5 °).

Para la muestra de incrustación de un medio de montaje acuoso medio se ha aplicado. Si en cualquier momento las muestras necesitan ser removidas una vez más, las muestras pueden colocarse en un agua con caja de Petri durante la noche. Finalmente, el cubreobjetos puede quitarse para análisis adicional.

Se ha determinado el comportamiento de apego y morfología de las células de la elución de L929 sembrado durante 3 días en PDMS y SSA 50: 50 folios por microscopía de contraste de fase y después de la tinción con fluorescencia conjugada phalloidin-488 y colorante Hoechst 33342 (figura 8). Adquisición de imágenes con microscopía de contraste de fase es muy recomendable, especialmente para los polímeros no tratados con plasma. Debido a la débil adherencia celular a estas superficies poliméricas celdas individuales o agregados son separados fácilmente, que complica la interpretación correcta de los métodos de análisis posterior.

Células sembradas en los polímeros vírgenes muestran pobre fijación y difusión de comportamiento (figura 8A1 y C1) mientras una monocapa confluente de celular se observó para las células cultivadas en superficies de plasma tratada (figura 8B1 y D1) . La formación de agregados celulares y desprendimiento de la superficie fue más pronunciada en las superficies prístinas. Visualización de los filamentos de actina después de fijación con paraformaldehído al 4% reveló algunas células migran a la periferia de los agregados celulares y emanación del lamellipodia salientes prístina PDMS y SSA 50: 50 folios (figura 8A2 y C2, flechas). No hay grandes diferencias cualitativas se pudieran observar al comparar ambos materiales poliméricos. Como nota al margen, parece que una menos cantidad de agregados celulares estaban presentes en 50: 50 de la SSA en comparación con PDMS. Además, los agregados a las superficies en 50: 50 SSA aparecieron que más aplanadas (figura 8 1). Como se esperaba, el tratamiento con plasma de aire mejorado accesorio celular y que se extiende en ambas superficies significativamente, llevando a la formación de protuberancias lamellipodia notable y una monocapa confluente (figura 8B2 y 2 de 8).

Liberación de LDH después de 3 días de cultivo se utilizó como indicador para determinar efectos citotóxicos (Figura 9A). En general, los niveles de LDH fueron comparables para las células cultivadas en ambos materiales poliméricos, con menos del 5% citotoxicidad (PDMS prístina: 2,8 ± 2,0%; 50: SSA de 50 vírgenes: 4,5 ± 3.6%; plasma tratado PDMS: 3,4 ± 1,5%; plasma tratado 50: 50 de la SSA: 3,4 ± 1.6%). Estos resultados son comparables a los datos presentados en nuestro estudio publicado previamente centrándose en la investigación de ambos elastómeros. 8 para validar aún más los resultados de la prueba de LDH, se realizó una prueba de exclusión azul de tripano. Además, se determinó la población de toda la célula para mostrar diferencias en la actividad de proliferación (figura 9B). En general menos del 5% se contaron las células positivas de azul de tripano (PDMS prístina: 2,4 ± 0.3%; 50: SSA de 50 vírgenes: 3,8 ± 2,5%; plasma tratado PDMS: 0,74 ± 1,3% plasma tratado SSA 50: 50: 0.95 ± 1.6%).

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Figura 1: preparación de películas PDMS en-(vinyl alcohol) polivinílico (PVA) recubierto de lámina de PET: El proceso para la fabricación de películas PDMS con espesor variable en una hoja de PET se aplicó para determinar la reproducibilidad y el rendimiento (A) de manejo. Los espesores de las películas PDMS se analizaron con microscopio óptico después de curar a 95 ° C (B). N = 3 independientemente fabricado películas fueron analizadas. De cada película, se eligieron tres lugares diferentes, corte y 3 posiciones en cada muestra se analizaron (k = 27). Barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: preparación de folios de PDMS preparado en diferentes proporciones de mezcla: Folios exponiendo diferentes proporciones de mezcla de la base (componente A) a (componente B) crosslinker de PDMS fueron fabricados por la técnica de la lámina de doctor. La capa superior que consta de PDMS en la proporción 10:1 (componente a: b), 45:1 y 70:1 aplicaron sobre una película de 10:1 de PDMS previamente curada (A). Después de curado posterior a 95 ° C espesor de las películas compuestas fue analizada por microscopía óptica (B) y microscopía electrónica (C). N = 3 experimentos independientes realizaron y analizados con microscopía óptica (D). Formar cada película independiente fabricado, se eligieron tres lugares diferentes, corte y 3 posiciones en cada muestras se analizaron (k = 27). Barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: determinación de la rugosidad de la superficie topográfica de los dos substratos utilizados para las mediciones de adherencia: Se caracterizaron dos substratos de vidrio que poseen diferente rugosidad. Tres análisis dimensional de la profilometric de la superficie fue realizada en el substrato 'liso' GS (A1) y el sustrato 'áspero' GR (B1). Correspondientes curvas de línea se representan en A2 y B2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: principio de las mediciones de adherencia normal: Una configuración de estructura de encargo fue utilizada para caracterizar las propiedades de adhesión de las muestras de polímero. La configuración de medición se muestra en (A) y detalles se muestran en (B). Para el análisis de la medida, el estrés se determinó de una curva de tiempo de estrés (C). Trabajo de separación fue determinada por una integración de la curva de tensión-desplazamiento entrefinal de s y s0 (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: determinación de las propiedades de adherencia de folios con diferentes proporciones de mezcla de PDMS: Se midieron los pull-off tensión (A) y el trabajo de separación (B) de las películas compuestas fabricadas de PDMS en la proporción 10:1 de mezcla, 45:1 y 70:1. Para el análisis, un 'suave' de cristal substrato (GS) exhibiendo una Ra = 0,013 μm y un substrato de cristal 'áspero' (GR) con Run = 0.338 μm fueron utilizados. N = 3 independientemente fabricado películas fueron analizadas. De cada película, se eligieron dos piezas y tres posiciones diferentes en cada muestra se analizaron (k = 18). Barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: preparación de folios de SSA con espesor variable: SSA 50: 50 fue aplicado encima de una película de 10:1 de PDMS previamente curada (A). Se aplicaron diferentes espesores húmedos de esta capa que van desde 40 hasta 500 μm y el espesor después de curar investigado con microscopía óptica (B). Accesorio de las películas a la espalda de voluntarios de mano muestra que las películas con un grosor total de unos 100 μm (película #2) conforman a la rugosidad de la piel (C). Espesor de las capas individuales y el espesor total de los folios se muestran en la Figura 6B. Para el análisis n = 3 muestras independientemente fabricadas se midieron con microscopía óptica. De cada película, se eligieron tres lugares diferentes, corte y 3 posiciones en cada muestra se analizaron (k = 27). Barras de error representan la desviación estándar. Barra de escala en C 6 representa aprox. 1 cm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: determinación de las propiedades de adherencia de folios del pegamento de la piel suave: Películas delgadas de compuestos de SSA como capa superior y PDMS 10:1 como capa de refuerzo fueron fabricadas. El espesor de la capa superior es variado entre 50 y 330 μm. Pull-off tensión (A) y se analizó el trabajo de separación (B) de las películas compuestas con dos substratos de vidrio diferentes (un sustrato de vidrio 'Lisa' (GS) exhibiendo una Run = 0,013 μm y un substrato de cristal 'áspero' (GR) con Run = 0.338 μm). Fotos de ejemplares de los mecanismos de separación se visualizan en C. Datos análisis n = 3 se analizaron independientemente fabricados experimentos. De cada película, se eligieron dos piezas y tres posiciones diferentes en cada muestra se analizaron (k = 18). Barras de error representan la desviación estándar. Barras de escala en C 7 representan 0,5 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: morfología celular de elución de L929 fibroblastos cultivados en películas delgadas: Elución de L929 fibroblastos murinos fueron cultivados durante 3 días en las películas delgadas de PDMS (A1, A2, B1, B2) o SSA (C1, C2, D1, D2). Para incrementar la hidrofilicidad de las superficies de tratamiento del plasma del aire fue realizada (B1, B2, D1, D2). Barras de escala en D1 y D2 representan 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9: determinación de la citotoxicidad y la proliferación celular: Para la determinación de efectos citotóxicos y la proliferación celular, las células de la elución de L929 fueron sembradas durante tres días en PDMS 10:1 y folios de 50: 50 de SSA. Liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) se determinó mediante un ensayo de actividad de la LDH y reveló menos del 5% (A) la citotoxicidad. Número total de la célula después del período de cultivo se evaluó después de manual de conteo de las células con una cámara de Neubauer (B). N = 3 realizaron de forma independiente los experimentos fueron analizados. Barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El diseño de estructuras de compuestos permite el simple ajuste de propiedades de los materiales, tales como módulo de Young o el espesor de las muestras. Módulo de Young de PDMS puede cambiar con eficacia en una amplia gama por alterar la relación de mezcla entre los dos componentes o la fabricación de mezclas utilizando un30,de elastómero de silicona diferentes31. Los métodos descritos no se limitan a los PDMS usada en la investigación actual, pero sobre todo el desempeño adhesivo depende en el tipo específico utilizado. Un paso crítico dentro de este protocolo es el proceso de fabricación de las películas compuestas (figura 1). Fue demostrado que el espesor de las películas afecta significativamente el comportamiento de la adherencia de las películas sobre diferentes sustratos, incluyendo la piel (figura 5 y figura 6). Además el espesor de la película, tiempo y temperatura durante el proceso de polimerización afecta a las propiedades de los materiales32. Por lo tanto, parámetros como el espesor de las capas poliméricas tienen que ser cuidadosamente adaptados y verificado.

Análisis de las propiedades adhesivas de las películas delgadas se realizaron con medidas de adhesión fuerza normal con dos substratos de vidrio de diferente rugosidad hasta Ra = 0.338 μm (figura 3). En general, rugosidad afecta significativamente la adherencia de las superficies, especialmente de materiales elásticos33,34. La aspereza del vidrio puede ser variada fácilmente mediante pulido con papel de lija de tamaños diferentes asperezas, por lo tanto, lo que permite la fabricación de sustratos exhibiendo mayor rugosidad valores21. Además, otros materiales, por ejemplo resina epoxi se puede utilizar para la producción de sustratos15,35. Esto podría ser una estrategia importante modificación del protocolo presentado. Por ejemplo, si sustratos exhibiendo diferentes superficie libre energías son necesarias o específicas topografías son necesarias. Aquí, pull-off estrés y el trabajo de separación de las láminas delgadas fabricada de PDMS y SSA se analizaron con una configuración a la medida (dispositivo de medición macroscópica adherencia (MAD, figura 4)). 36 alineación óptica de sustrato y el penetrador es un paso crítico para el análisis de los resultados de medición. Por lo tanto, ajuste del ángulo de inclinación debe realizarse con el goniómetro, tan preciso como sea posible. Esto se logra con suficiente precisión introduciendo manualmente el sustrato en el contacto con la superficie de la película hasta que se logre un contacto horizontal.

En el protocolo actual, el tiempo de espera se mantuvo constante en un segundo (figura 5 y figura 7). Especialmente para la investigación del rendimiento adhesivo de una película elástica a una superficie sustrato ásperas, una extensión del tiempo de espera proporciona información adicional. Por ejemplo, un aumento en la tensión de pull-off con el aumento de tiempo de espera ha sido reportado8. Además de las mediciones realizadas en el actual protocolo, otros métodos, por ejemplo cáscara pruebas podrían realizar, lo que permite una investigación más exhaustiva de adherencia rendimiento37.

Las propiedades adhesivas de folios exhibiendo la película diferentes espesores del adhesivo suave piel se determinaron (figura 7). Nuestros resultados están en consonancia con datos publicados que indican que una disminución de plomo de espesor de película a un aumento de la tensión de pull-off como el confinamiento, es decir, la relación entre sustrato diámetro y película grueso, aumenta38,39 . Basado en estos resultados y los datos representados en la figura 7, se concluye que folios con un grosor total de unos 100 μm (espesor de la capa de la SSA de aprox. 60 μm aplicada a una película PDMS con un espesor de aprox. 40 μm) presentan adherencia favorable p propiedades en las superficies ásperas.

A continuación, folios vírgenes se han realizado experimentos relacionados con la caracterización biológica y plasma tratado folios (figura 8). Tratamiento del plasma de los elastómeros de silicona es una técnica frecuentemente aplicada, versátil para aumentar las propiedades hidrofílicas de las superficies y promover accesorio celular y celular separarse40,41. Siliconas son bien conocidas por su baja toxicidad y alta bioestabilidad pero pueden contener monómeros residuales o catalizadores que puedan influir en los procesos fisiológicos, también conduce a la citotoxicidad42,43. En la llevaron a cabo experimentos hemos observado menos de 5% de citotoxicidad mediante la liberación LDH como un indicador y un análisis de exclusión azul de tripano. En el protocolo presentado, toda la población celular, incluyendo agregados celulares individual de forma que la superficie ha sido analizada para el análisis de la proliferación (figura 9B). Una modificación del protocolo podría producir resultados más diferenciados. Para cada muestra, el sobrenadante que contiene agregados celulares separadas podría transfirió a un tubo de reacción separada y no se combina con las células enzimático extraídas de la superficie del polímero. Esto permite la exacta evaluación de las células a la superficie y finalmente revelar una determinación más detallada de la influencia de los polímeros en el proceso de adhesión celular. Además de los métodos de inmunocitoquímica presentados aquí, las células podrían cosecharse para investigación con métodos de immunoblot, lo que permite una detallada evaluación cuantitativa de la expresión de la proteína.

En Resumen, hemos establecido las condiciones de fabricación para la producción de películas delgadas de compuestos elastoméricas para aplicaciones en la investigación de la cultura avanzada de la célula. Además, estas películas delgadas poseen alta capacidad de adaptación a la piel la aspereza, permitiendo el sofisticado diseño de adhesivos de la piel.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Martin Danner es reconocido por su ayuda en la preparación de muestras y establecimiento de procedimientos de cultivo celular. Los autores quisieran agradecer Biesterfeld insta GmbH (Hamburgo, Alemania), especialmente de Robert Radsziwill para apoyo continuo y discusión. La investigación conduce a estos resultados ha recibido financiación del Consejo Europeo de investigación en convenio de subvención de ERC de séptimo programa marco (FP/2007-2013) de n. la Unión Europea 340929.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2-Propanol, 97%Stockmeier Chemie1000452610000Isopropanol
Abrasivo almohadilla de mano DiamnodBohleMO 5007522Grano: 220
AccutaseCapricornio CientíficoACC-1B
Albúmina Fraktion VRoth0163.2BSA
Alexa Fluor 488 FaloidinaThermoFischer ScientificA12379altamente tóxico
AquamountPolysciences18606-20medio de montaje soluble en agua
CytoTox-ONE Ensayo de integridad de membrana homogéneaPromegaG7890
DPBS, sin Ca2+, Mg2+ThermoFischer Scientific
Suero fetal bovino oroGE Health Care Life ScienceA15-151FBS
Goniómetro OCA35Dataphysicspara la determinación del ángulo de contacto estático con el agua
Hoechst Dye 33342Sigma-AldrichB1155-100MGbisBenzimide H 33342 triclorhidrato, altamente tóxico
Microscopio Axiovert 25ZeissMicroscopio utilizado para la documentación
Microscopio Eclipse LV100NDNikonMicroscopio utilizado para la determinación del espesor de la película
Paraformaldehído, solución acuosa 16%Microscopía electrónica Ciencias RT15710microscopía electrónica grado
de penicilina y solución de estreptomicinaSigma-AldrichP4333-100ML
Phenom XL Microscopio electrónico de barrido (SEM)Phenom
Poly-(alcohol vinílico) 4-88, MW 31000Sigma-Aldrich81381-1KGMowiol 4-88
Poli-dimetilsiloxanos, Sylgard 184Dow Corning(400)000108351397PDMS
RPMI 1640 medio basalThermoFischer Scientific21875034
adhesivo de piel blanda (SSA)Dow Corning(400)000108251792MG 7-9800 Adhesivo de piel blanda (SSA)
mezclador de velocidad DAC 600.2 VAC-PHauschild
lápiz óptico profilomterZeissModelo: SURFCOM 1500SD3
placas de fluorescenciaTecan
Triton X 100Calbiochem648466
solución de Trypan BlueSigma-AldrichT8154-100MLsolución de
tripsina/EDTAPAN-BiotechP10-0235000,05% de tripsina, 0,02% EDTA en PBS
Pegamento UVBohleBO MV76002viscosidad media
14190094 de cultivos celularesTecan Infinite M200 pro Lector de altamente tóxica

Referencias

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