Aquí, describimos un protocolo para un microdissection de la captura del laser reproducible (LCM) para aislar la red trabecular (TM) para posteriores análisis de ARN. La capacidad de analizar los cambios en la expresión génica en el TM ayudarán en la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de enfermedades oculares relacionadas con la TM.
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Artículo de método
Microdissection de la captura del laser de la malla Trabecular muy pura de ojos de ratón para análisis de expresión génica
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Resumen
Resumen
Microdissection de la captura del laser (LCM) ha permitido el análisis de expresión génica de las células y enriquecido las poblaciones de la célula en secciones del tejido. LCM es una gran herramienta para el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes de la diferenciación celular y el desarrollo y progresión de varias enfermedades, incluyendo el glaucoma. El glaucoma, que comprende una familia de neuropatías ópticas progresivas, es la causa más común de ceguera irreversible en todo el mundo. Cambios estructurales y daños en la malla trabecular (TM) pueden resultar en aumento presión intraocular (PIO), que es un factor de riesgo para desarrollar glaucoma. Sin embargo, los mecanismos moleculares precisos involucrados son todavía poco conocidos. La capacidad para realizar análisis de expresión génica será crucial en la obtención de más conocimientos sobre la función de estas células y su papel en la regulación del desarrollo IOP y glaucoma. Para lograr esto, un método reproducible para aislar altamente enriquecido TM de secciones congeladas de ojos de ratón y un método para el análisis de la expresión del gen aguas abajo, tales como RT-qPCR y RNA-Seq es necesario. El método descrito en el presente documento es desarrollado para aislar TM muy puro de ojos de ratón para posterior PCR digital y análisis de microarrays. Además, esta técnica puede adaptarse fácilmente para el aislamiento de las células oculares muy enriquecidas y compartimentos celulares que han sido difíciles de aislar de ojos de ratón. La combinación de análisis LCM y el ARN puede contribuir a una comprensión más completa de los eventos celulares subyacentes glaucoma.
Introducción
El glaucoma es un grupo de enfermedades caracterizado por neuropatía óptica y retinopatía que en última instancia conduce a la ceguera irreversible1,2. Se estima que para 2020 más 70 millones de personas en todo el mundo estarán viviendo con algún tipo de enfermedad3,4,5,6,7. Glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA), el tipo más frecuente de glaucoma, se caracteriza por una disminución en la salida de humor acuoso (AH) conduce a aumento de la pres....
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Protocolo
Toda metodología de este estudio en el NIEHS Animal estudio propuesta IIDL 05-46 aprobó el nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS) Animal cuidado y uso de Comité (ACUC).
1. colección de tejido óptima para Microdisección láser
- Obtener 2 a 3 meses ratones, C57BL/6 macho o hembra. Eutanasia con CO2 para un mínimo de 1 minuto o hasta que la respiración ha cesado. Quitar el animal de la jaula y asegurar la muerte por dislocación cervical, decapitación o toracotomía.
- Antes de la disección, sean todas las herramientas de disección limpia y esterilizada.
Nota: Para la eliminación de los ojos curva....
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Resultados
LCM recogió RNA de la TM y del cuerpo ciliar de 4 ratones diferentes fue aislado para poder analizar la expresión génica y comparar la expresión con en todo ojo, esclerótica, iris, retina, córnea y lentes aisladas de tres ratones separados. TM expresando genes MYOC48 ACTA249 analizaron y en todos los tejidos recogidos para confirmar que las muestras aisladas de TM eran de hecho altamente enriquecidas en TM. Debido a la extr.......
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Discusión
El TM desempeña un papel vital en mantener activamente IOP homeostático y su disfunción es ampliamente aceptado como el principal factor causal para hipertensos glaucoma1,2,19. Un número de polimorfismos de nucleótido único en genes varios identificados por análisis GWAS se han relacionado con riesgo de glaucoma aumento y aumento de la resistencia al centro de la salida AH en el TM; sin embargo, los mecanismos moleculares precis.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Imprimaciones ACTA2 ddPCR (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2946-90004 | |
| Agilent RNA 6000 Pico kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 Sistema de PCR Digital de Gotas | BioRad | ||
| Pincel pequeño | |||
| Portaobjetos de microscopio de vidrio cargado | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Acetato violeta Sigma | Aldrich | C5042 | |
| Tijeras curvas | |||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | VEX |
| Criostato Leica CM1850 Unidad | Leica | ||
| Millex-GS | EMD Millipore | SLGS033SB | 0.22 y micro; m |
| MMI CellCut Modelo de corte UV | Máquinas moleculares & Industrias | Instrumento LCM | |
| MMI CellTools Software | Máquinas Moleculares & Industrias | 50202 | software LCM |
| para microdisección de captura láser | ASEE ST-LMD-M-500 Tubo de | tapa de aislamiento / Fabricado por Microdissect GmBH en Alemania y distribuido por Productos ASEE Tubo | |
| muestra para microdisección de captura láser (alternativa) | Máquinas moleculares & Industrias | ||
| modificadas Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, sin RNasa | Productos ASEE | FS-LMD-M-M-50r | Membrana de tereftalato de polietileno (PET)/Fabricada por Microdissect GmBH en Alemania y distribuida por Productos ASEE |
| Portaobjetos Memebrane, Máquinas Moleculares Libres de ARNasa (Alternativas) | & Industrias | 50102 | |
| Rapid Fix | Thermo scientific | 6764212 | H& Tinción E |
| Tampón RLT | Qiagen | 79216 | Bufffer de lisis utilizado para muestras de LCM |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | |
| Protect RNA Inhibidor de ARNasa | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Kit de aislamiento de ARN |
| SMART-Seq v4 Kit de ARN de entrada ultra baja | Takara Clontech | 634888 | kit de ARN a ADNc de baja entrada para muestras LCM |
| SuperMix (no dUTP) | BioRad | 1863023 | mezcla maestra de PCR digital |
| Tissue-Tek Cryomold (25 mm x 20 mm x5 mm) | Sakura | 4557 | |
| Compuesto Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker Reticulante UV | Stratagene | 400075 | |
| Xileno | Macron | 8668 |
Referencias
- Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
- Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
- Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D.
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Reimpresiones y permisos
