Polysome perfilado en Leishmania, las células humanas y testículo de ratón

Zemfira N. Karamysheva; Elena B. Tikhonova; Petar N. Grozdanov; James C. Huffman; Kristen R. Baca; Alexander Karamyshev; R. Brian Denison; Clinton C. MacDonald; Kai Zhang; Andrey L. Karamyshev

doi:10.3791/57600

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Artículo de método

Polysome perfilado en Leishmania, las células humanas y testículo de ratón

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DOI:

10.3791/57600

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8 de abril de 2018

Zemfira N. Karamysheva² , Elena B. Tikhonova¹ , Petar N. Grozdanov¹ , James C. Huffman²^,³ , Kristen R. Baca¹^,³ , Alexander Karamyshev¹ , R. Brian Denison¹ , Clinton C. MacDonald¹ , Kai Zhang² , Andrey L. Karamyshev¹

¹Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center, ²Department of Biological Sciences, Texas Tech University, ³CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research), Texas Tech University

En este artículo

Resumen

El objetivo general de la técnica de generación de perfiles polysome es análisis de actividad traslacional de mRNAs individuales o transcriptoma mRNAs durante la síntesis de proteínas. El método es importante para los estudios de regulación de la síntesis de proteínas, activación de la traducción y represión en salud y múltiples enfermedades humanas.

Resumen

Expresión de la proteína adecuada en el momento adecuado y en las cantidades adecuadas es la base de la función normal de la célula y la supervivencia en un entorno rápidamente cambiante. Durante mucho tiempo, los estudios de expresión génica fueron dominados por la investigación a nivel transcripcional. Sin embargo, los niveles de estado estacionario de mRNAs no se correlacionan bien con la producción de proteínas, y la traducción de los mRNAs varía grandemente dependiendo de las condiciones. En algunos organismos, como el parásito Leishmania, la expresión de proteínas está regulada principalmente a nivel traslacional. Estudios recientes demostraron que dysregulation de traducción de proteínas se asocia con cáncer, metabólico, neurodegenerativas y otras enfermedades humanas. Polysome perfilado es un poderoso método para estudiar la regulación de la traducción de proteínas. Permite medir el estado traslacional de mRNAs individuales o estudiar traducción en una escala genoma-ancha. La base de esta técnica es la separación de polisomas, ribosomas, sus subunidades y mRNAs gratis durante la centrifugación de un citoplásmico lisado a través de un gradiente de sacarosa. Aquí, presentamos un universal polysome perfiles protocolo utilizado en tres modelos diferentes - parásito Leishmania major, células humanas cultivadas y tejidos animales. Las células de Leishmania crecen libremente en suspensión y células humanas cultivadas crecen en monocapa adherente, mientras que el testículo del ratón representa una muestra de tejido animal. Así, la técnica se adapta a todas estas fuentes. El protocolo para el análisis de fracciones polysomal incluye la detección de los niveles de mRNA por RT-qPCR, proteínas por Western blot y análisis de ARN ribosómico mediante electroforesis. El método puede ampliarse aún más por la examinación de mRNAs de asociación con el ribosoma a nivel de transcriptoma por RNA-seq profunda y análisis de proteínas ribosoma asociados por espectroscopía de masas de las fracciones. El método se puede ajustar fácilmente a otros modelos biológicos.

Introducción

Regulación de la expresión génica en las células es controlada por mecanismos transcripcionales y postranscripcional y postraduccionales. Avances en la secuenciación del RNA profunda permiten el estudio de los niveles de mRNA de estado estacionario en una escala genoma-ancha en un nivel sin precedentes. Sin embargo, hallazgos recientes revelaron que nivel de mRNA de estado estacionario no se correlaciona siempre con proteína producción¹^,². El destino de una transcripción individual es muy complejo y depende de muchos factores como estímulos internos/externos, estrés, etcetera. Regulación de la expresi....