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Artículo de método

Polysome perfilado en Leishmania, las células humanas y testículo de ratón

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DOI:

10.3791/57600

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8 de abril de 2018

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1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Department of Biological Sciences, Texas Tech University, 3CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research), Texas Tech University

En este artículo

Resumen

El objetivo general de la técnica de generación de perfiles polysome es análisis de actividad traslacional de mRNAs individuales o transcriptoma mRNAs durante la síntesis de proteínas. El método es importante para los estudios de regulación de la síntesis de proteínas, activación de la traducción y represión en salud y múltiples enfermedades humanas.

Resumen

Expresión de la proteína adecuada en el momento adecuado y en las cantidades adecuadas es la base de la función normal de la célula y la supervivencia en un entorno rápidamente cambiante. Durante mucho tiempo, los estudios de expresión génica fueron dominados por la investigación a nivel transcripcional. Sin embargo, los niveles de estado estacionario de mRNAs no se correlacionan bien con la producción de proteínas, y la traducción de los mRNAs varía grandemente dependiendo de las condiciones. En algunos organismos, como el parásito Leishmania, la expresión de proteínas está regulada principalmente a nivel traslacional. Estudios recientes demostraron que dysregulation de traducción de proteínas se asocia con cáncer, metabólico, neurodegenerativas y otras enfermedades humanas. Polysome perfilado es un poderoso método para estudiar la regulación de la traducción de proteínas. Permite medir el estado traslacional de mRNAs individuales o estudiar traducción en una escala genoma-ancha. La base de esta técnica es la separación de polisomas, ribosomas, sus subunidades y mRNAs gratis durante la centrifugación de un citoplásmico lisado a través de un gradiente de sacarosa. Aquí, presentamos un universal polysome perfiles protocolo utilizado en tres modelos diferentes - parásito Leishmania major, células humanas cultivadas y tejidos animales. Las células de Leishmania crecen libremente en suspensión y células humanas cultivadas crecen en monocapa adherente, mientras que el testículo del ratón representa una muestra de tejido animal. Así, la técnica se adapta a todas estas fuentes. El protocolo para el análisis de fracciones polysomal incluye la detección de los niveles de mRNA por RT-qPCR, proteínas por Western blot y análisis de ARN ribosómico mediante electroforesis. El método puede ampliarse aún más por la examinación de mRNAs de asociación con el ribosoma a nivel de transcriptoma por RNA-seq profunda y análisis de proteínas ribosoma asociados por espectroscopía de masas de las fracciones. El método se puede ajustar fácilmente a otros modelos biológicos.

Introducción

Regulación de la expresión génica en las células es controlada por mecanismos transcripcionales y postranscripcional y postraduccionales. Avances en la secuenciación del RNA profunda permiten el estudio de los niveles de mRNA de estado estacionario en una escala genoma-ancha en un nivel sin precedentes. Sin embargo, hallazgos recientes revelaron que nivel de mRNA de estado estacionario no se correlaciona siempre con proteína producción1,2. El destino de una transcripción individual es muy complejo y depende de muchos factores como estímulos internos/externos, estrés, etcetera. Regulación de la expresión génica durante la síntesis de proteína proporciona otra capa de control de expresión necesaria para una respuesta rápida en condiciones cambiantes. Polysome (o "polyribosome") de perfiles, la separación y visualización de la traducción activa de ribosomas, es un poderoso método para estudiar la regulación de la síntesis de proteínas. Aunque sus primeras aplicaciones experimentales aparecieron en la década de 19603, polysome perfilado es actualmente una de las técnicas más importantes en la proteína traducción estudios4. MRNAs individuales puede ser traducida en más de un ribosoma a la formación de un polysome. Las transcripciones pueden ser estancadas en los ribosomas con cicloheximida5 y mRNAs que contienen diferentes cantidades de polisomas pueden ser separados en el proceso de fraccionamiento polysome por ultracentrifugación gradiente de sacarosa6,7 , 8 , 9. Análisis de ARN de fracciones polysomal entonces permite la medición de cambios en los Estados traslacionales de mRNAs individuales a escala de todo el genoma y en diferentes condiciones fisiológicas4,7, 10. el método se ha utilizado también para revelar el papel de la 5' UTR y 3' UTR secuencias en el control del ARNm traducción11, examinar el papel de miRNAs en represión traduccional12, descubrir defectos en biogénesis del ribosome13 y entender el papel de las proteínas del ribosoma asociados con enfermedades humanas14,15. Durante la última década, ha surgido un creciente papel para la regulación de la expresión génica durante la traducción que ilustra su importancia en enfermedades humanas. Las pruebas de control traduccional en cáncer, metabólico y enfermedades neurodegenerativas son abrumador15,16,17,18. Por ejemplo, dysregulation de eIF4E-dependiente control traduccional contribuye al autismo relacionadas con déficits15 y FMRP participa en estancamiento de los ribosomas en mRNAs vinculados al autismo14. Así, polysomal de perfiles es una herramienta muy importante para el estudio de defectos en la regulación traduccional en múltiples enfermedades humanas.

Análisis de la proteína de las fracciones polysomal bajo diferentes condiciones fisiológicas analiza la función de los factores asociados a los ribosomas durante la traducción. La técnica de generación de perfiles polysome se ha utilizado en muchas especies incluyendo levaduras, células de mamíferos, plantas y protozoos10,19,20,21. Parásitos protozoos como Trypanosoma y Leishmania presentan limitado control transcripcional de la expresión génica. Sus genomas se organizan en grupos de gen policistrónico que carecen de transcripción regulada por el promotor22. En cambio, expresión génica desarrollo predominante está controlada a nivel de la proteína traducción y estabilidad del mRNA en tripanosomatídeos especies23,24. Por lo tanto, la comprensión de control traduccional en la ausencia de regulación transcripcional es particularmente importante para estos organismos. Perfiles de polysomal es una poderosa herramienta para estudiar la regulación postranscripcional de la expresión génica en Leishmania25,26,27,28.

Los recientes avances en la detección de niveles de los mRNAs por real tiempo cuantitativo PCR (RT-qPCR) y transcriptoma completo de secuenciación de próxima generación, así como tecnologías de proteómica, trae ventajas de perfiles polysomal a un nuevo nivel y resolución. El uso de estos métodos puede ampliarse aún más por el análisis de fracciones individuales de polysomal por la secuencia de RNA profunda combinada con análisis proteómico para supervisar el estado traslacional de las células en una escala genoma-ancha. Esto permite la identificación de nuevos actores moleculares regular traducción bajo diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. Aquí, presentamos un universal polysome perfiles de protocolo que se utiliza en tres modelos diferentes: el parásito Leishmania major, células humanas cultivadas y tejidos animales. Presentamos consejos sobre la preparación de lisados de células de diferentes organismos, optimización de condiciones de gradiente, de inhibidores de la Rnasa y aplicación de RT-qPCR, Western blot y electroforesis de RNA para analizar fracciones polysome en este estudio.

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Protocolo

Todos los tratamientos de animales y manejo de los tejidos obtenidos en el estudio fueron realizados según protocolos de actuación aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en la Texas Tech University Health Science Center, según los institutos nacionales de Pautas de bienestar animal salud, número de protocolo 96005. Por favor, sacrificar animales vertebrados y preparar los tejidos según las directrices del Comité de uso y cuidado de Animal institucional. Si carece de dicho Comité, por favor consulte las pautas de bienestar animal de institutos nacionales de salud. Adultos (> 60 días de edad) fueron utilizados ratones C57BL/6. Todos los animales y los tejidos fueron obtenidos según protocolos aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en la Texas Tech University Health Sciences Center según las pautas de bienestar animal de institutos nacionales de salud. Eutanasia, un solo ratón fue colocado en un compartimiento pequeño, y el aire fue desplazado poco a poco con cerca de 30% dióxido de carbono para anestesiar y minimizar el sufrimiento del animal. Tras el cese de la respiración, utilizamos la dislocación cervical para confirmar la muerte del animal antes de la cosecha de los tejidos.

PRECAUCIÓN: Todo el trabajo con células humanas cultivadas y vivo Leishmania se realizó en gabinete en BSL-2 laboratorio certificado de bioseguridad.

1. preparación de lisados citoplásmicos de Leishmania principales , las células humanas cultivadas y tejidos de ratón

Nota: Hay varias diferencias en los preparativos del lisado de los diferentes materiales. Otras medidas, incluyendo la preparación de gradiente de sacarosa y fraccionamiento polysomal son idénticos y no dependen de la fuente de la muestra.

  1. Preparación de lisado citoplásmico comandante de Leishmania
    1. Inocular de Leishmania major (FV1 cepa) las células en 30 mL de 1 x M199 media29 que contiene la mezcla 10% de suero bovino Fetal (FBS) y penicilina/estreptomicina (100 unidades y 100 μg/mL respectivamente)a densidad de 1 x 105 células/mL .
      Nota: Se realizarán todos los pasos que involucran células comandante de Leishmania en un gabinete de bioseguridad.
    2. Colocar las células en la incubadora y cultivarlas a 27 ° C hasta la fase logarítmica (mediados de registro corresponde a 5 x 106 células/mL). Toma generalmente cerca de dos días para crecer.
    3. Añadir cicloheximida al cultivo de Leishmania major a una concentración final de 100 μg/mL para arrestar a los ribosomas en mRNAs traducido. Vuelva a colocar las células en la incubadora durante 10 minutos a 27 ° C.
    4. Después de completa el tratamiento de cicloheximida, transferir las células a un tubo cónico de 50 mL y spin en 1.800 x g y 4 ° C durante 8 min descartar sobrenadante.
    5. Lavar las células con 30 mL de solución salina amortiguada de fosfatos de Dulbecco (DPBS). Centrífuga a 1.800 x g y 4 ° C durante 8 minutos.
    6. Deseche el sobrenadante. Resuspender las células en 1 mL de DPBS.
    7. Tomar una alícuota de células y mezclar con una solución de formaldehído de 3.5%.
    8. Contar celdas por hemocitómetro y determinar su concentración. Transferir el número de células en el tubo de microcentrífuga. Lisado de 0.5x108-2 x 108 células/mL es suficiente para la carga de gradiente de un sacarosa.
    9. Girar las células a 1.800 x g y 4 ° C durante 8 minutos descarte el sobrenadante.
    10. Resuspender el precipitado de células en hielo en 1 mL de tampón de lisis que contienen inhibidores de la proteasa e inhibidor de Rnasa (20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1% NP-40, 1 x inhibidor de la proteasa cóctel (EDTA-libre), inhibidor de Rnasa de 200 unidades/mL).
    11. Pasar el lisado a través de una aguja de calibre 23 tres veces. El lisado debería ser transparente después de paso a través de la aguja.
    12. Centrífuga a 11.200 x g y 4 ° C por 10 minutos aclarar lisado. Transfiera las aclarado lisado a un nuevo tubo y mantenerlo en hielo hasta ultracentrifugación gradiente de sacarosa.
    13. Recoge 400-500 μL del lisado como entrada (para analizar más adelante), congelar inmediatamente en nitrógeno líquido para análisis de la futura proteína o añadir Reactivo de purificación de RNA antes de congelar para análisis de ARN.
  2. Preparación lisado citoplásmica de las células humanas cultivadas del HeLa
    1. Las células HeLa y semilla en 20 mL de medio DMEM que contiene la mezcla 10% de FBS y penicilina/estreptomicina (100 unidades y 100 μg/mL respectivamente) con célula cuenta 2 x 105 células/mL en una placa de 15 cm.
    2. Crecen las células HeLa a 37 ° C, 5% CO2 para la transfección de DNA de plásmido 20-24 h. realizar según los protocolos del fabricante.
    3. Se propagan las células durante 24 h después de transfección a 37 ° C, 5% CO2.
    4. Añadir cicloheximida cultiva células HeLa a la concentración final de 100 μg/mL a arrestar a los ribosomas en mRNAs traducido e incubar las células durante 10 min a 37 ° C, 5% CO2. Aspire el medio. Lavan las células dos veces con DPBS frío en hielo.
    5. Añadir 500 μL de tampón de lisis (20 mM HEPES-KOH pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM TDT, 0,5% NP-40, 1 x inhibidor de la proteasa cóctel (EDTA-libre), 200 unidades/mL de heparina de Rnasa inhibidor o 1 mg/mL) a la placa y raspe las células en hielo.
    6. Transferencia de las células sometidas a lisis para el tubo de microcentrífuga. Ajustar la concentración de NP-40 para 0,5% y MgCl2 a 5 mM según el aumento del volumen de la muestra.
    7. Pasar el lisado a través de una aguja de calibre 23 3 - 6 veces.
    8. La vuelta a 11.200 x g y 4 ° C durante 8 minutos aclarar lisado. Después de la centrifugación, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Use un espectrofotómetro para evaluar la eficiencia de la lisis de la célula y para determinar la cantidad de muestra para el cargamento en el gradiente. Añadir 10 μL de muestra a 0,5 mL de 0.1% sodio dodecil sulfato (SDS). En blanco contra 0,1% SDS. Medir la absorbancia a 260 nm. Valor de la absorbancia esperada es alrededor de 15-20 unidades/mL.
    9. Diluir todas las muestras con tampón de lisis en el mismo valor de la absorbancia antes de centrifugación gradiente de sacarosa. Mantener las muestras en hielo hasta centrifugación gradiente de sacarosa.
  3. Preparación de lisado citoplásmico del testículo de ratón
    1. Diseccionar el testículo de ratón. Hacer una pequeña incisión en la túnica albugínea y recoger los túbulos seminíferos de los testículos y transferirlos en un tubo cónico de 15 mL que contiene 5 mL de DPBS complementado con fluoruro de phenylmethylsulfonyl de 0,1 mM (PMSF).
    2. Mezcle vigorosamente el tejido por inversión varias veces. Permitir que el tejido para instalarse en la gravedad de la unidad en hielo durante 5 minutos.
    3. Retire y deseche el nublado tampón que contiene células conectivas y fragmentos de tejido. Repita el procedimiento 2-3 veces más. La pelotilla blanca restante se enriquece de los túbulos seminíferos y células de germen.
    4. Transfiera el sedimento de túbulos seminíferos a un tubo de microcentrífuga de 2 mL y centrifugado a 500 x g durante 1 minuto descarte el sobrenadante.
    5. Añadir 500 μl de tampón de lisis (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM TDT, 0,5% NP-40, 1 x inhibidor de la proteasa cóctel (EDTA-libre), heparina 1 mg/mL o 200 unidades/mL de inhibidor de la Rnasa) a los túbulos. Utilice una pipeta para triturate el tejido.
    6. Transferir la suspensión a una pequeña (0.5-1.0 mL) homogeneizadores Dounce. Alteran el tejido con siete a ocho golpes de la mano del mortero de vidrio.
    7. Transferir el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    8. Centrifugar la muestra a 12.000 x g y 4 ° C durante 8 min a claro el lisado. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y de tienda en hielo hasta la carga en el gradiente de sacarosa.
    9. Recoger 50 μL del lisado como muestra de entrada, congelar inmediatamente a-80 ° C para el análisis de la futura proteína; o añadir Reactivo de purificación de RNA antes de congelar para análisis de ARN.

2. ultracentrifugación y preparación de gradiente de sacarosa

  1. Preparar dos sacarosa gradiente soluciones (20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 100 mM KCl, 10 mM de MgCl2, 1 mM TDT, 1 inhibidor de proteasa x cóctel), que contienen sacarosa al 10% o 50% de sacarosa. (Tris-HCl, pH 7.4, puede utilizarse en lugar de HEPES). Agregar 200 unidades/mL heparina inhibidor o 1 mg/mL Rnasa según el diseño experimental. Coloque un tubo de ultracentrífuga para rotor SW 41 en el bloque de marcador y dibujar la línea en el nivel superior del bloque. Transferir el tubo a un bastidor estable.
  2. Tomar una jeringa de 10 mL con el dispositivo y conectado y llene la jeringa con solución de sacarosa al 10% (preparado como el anterior). Suelte lentamente lo en la parte inferior del tubo de ultracentrífuga hasta llegar a la marca en el tubo.
  3. Llene otra jeringa con solución de sacarosa al 50% y con cuidado Inserte su dispositivo y a través de la capa de sacarosa del 10% en la parte inferior del tubo. Suelte lentamente la solución de sacarosa a partir de la parte inferior hasta llegar a la marca en el tubo. Sellar el tubo con la tapa provista.
  4. Para preparar el gradiente de sacarosa, gire el gradiente maker ON. Nivel de la placa con el encima de o abajo botones y presiona DONE. Nivelación es importante para la linealidad de la pendiente.
  5. Después de nivelar la placa de prensa GRAD para abrir el menú degradado. Ir a la lista en el menú degradado y seleccione el rotor SW 41 Ti. Decídase por el gradiente de sacarosa deseado de la lista del menú utilizando los botones arriba y abajo . Prensa uso.
  6. Coloque el soporte del tubo de gradiente en la placa del fabricante de la gradiente. Transferir el tubo en el soporte. Hasta 6 gradientes se pueden preparar al mismo tiempo. Pulse Ejecutar. La gradiente eléctrica gira los tubos a la velocidad programada y los ángulos formando un degradado lineal. Se tarda sólo unos minutos para preparar el gradiente.
  7. Cuando haya completado el proceso, coloque los tubos en una parrilla. Sacar los tapones. Retire el mismo volumen que el volumen de muestra de la parte superior de los tubos de la ultracentrífuga.
  8. Cuidadosamente la carga 400-500 μL lisado contiene 15-20260 unidades de polisomas en la parte superior. Colocar los tubos en los cubos de rotor y equilibrarlos.
  9. Centrífuga a 260.000 x g y 4 ° C por 2 h con rotor SW 41.

3. polysome fraccionamiento y recogida de muestras

Nota: Mientras que preparaciones lisadas tienen algunas diferencias dependiendo de la fuente, gradiente preparación polysome fraccionamiento los protocolos y son las mismas para todos los tipos de lisados.

  1. Después de la terminación de la ultracentrifugación, coloque los cubos de rotor con los tubos en hielo. Girar a colector de fracciones y gradiente fraccionador ON. Haga clic en explorar en el menú del fraccionador. Poner un estante con 24 tubos en el colector de fracciones.
  2. Llenar un recipiente de enjuague en el fraccionador con agua desionizada. Pulsar la tecla de enjuague durante 10 s para enjuagar la bomba en fraccionador. Fíjele un adaptador de enjuague con la jeringa llenada de agua a los pistones para la calibración.
  3. Abra el software del fraccionador en el equipo. Prensa de calibrar. Utilizar la configuración por defecto y pulse OK. Esté listo para inyectar el agua de la jeringa.
  4. Pulse OK para hacer la calibración. Iniciar inmediatamente la inyección de agua para los próximos 5 s. Durante este tiempo, el agua fluirá a través de la célula de flujo UV detector y el instrumento se calibra. El signo Cero calibración completada aparecerá. El instrumento está listo para el fraccionamiento.
  5. Quite el adaptador de enjuague con la jeringa. Coloque una punta al pistón el fraccionador.
  6. Abrir el aire válvula y presione aire llave de cobre amarillo para 10 s para tubería seca y celda de flujo. Cierre la válvula de aire.
  7. Suavemente Retire el tubo de gradiente de la cubeta de rotor y coloque en el canal. Aplicar la tapa del soporte del tubo a la parte superior del tubo y cuidadosamente mueva el tubo en el soporte de tubo y bloquearlo en posición.
  8. Coloque el soporte bajo el pistón el fraccionador. A menudo, se observan bandas polysomal por el ojo. Introducir los valores deseados para los números de fracción y volumen (24 fracciones a 500 μL/fracción son generalmente suficientes). Nombre del archivo correctamente. Pulse OKy, a continuación, Ir a gráfico de botón. En la siguiente ventana, pulse Iniciar escaneo. Configuración aparecerá, pulse OK. El colector se moverá de la cuneta a la primera fracción y el pistón se mueve en el tubo. Cuando el pistón alcanza la parte superior del gradiente se reducirá a la velocidad seleccionada y se recogerán las fracciones. Cuando haya completado, el pistón se desplaza el tubo de gradiente.
  9. Abrir el aire válvula y presione aire llave de cobre amarillo en el fraccionador para recuperar la última fracción.
  10. Pasar los tubos de la parrilla en hielo.
  11. Añadir 2 volúmenes de reactivo de purificación de RNA para cada fracción y flash congelación en nitrógeno líquido hasta la purificación del ARN. Alternativamente, si la proteína tiene que analizarse, Añadir ácido tricloroacético a la concentración final de 10% a concentrarse para Western Blot (ver sección 8).

4. preparación de ARN sintético In Vitro para la normalización de los mRNAs niveles durante el análisis de datos de RT-qPCR

Nota: El mRNA de la OmpA de e. coli se utiliza en el presente Protocolo para la normalización. Otros ARN, que no tiene identidad extensa con los mRNAs del organismo estudiado (mamífero o Leishmania) puede ser utilizado.

  1. Preparar el fragmento de ADN de OmpA que contiene SP6 promotor secuencia por una reacción de polimerización en cadena estándar de un plásmido que contiene OmpA gen30.
  2. Preparar 100 μl de la mezcla: 80 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 16 mM MgCl2, espermidina, 10 mM DTT, ATP, CTP, de 3 mM de 3 mM 3 mM UTP, GTP de 3 mM de 2 mM, 0.5 inhibidor de Rnasa U/μL, 1 μg de ADN PCR OmpA 3 μL SP6 RNA polimerasa , 0.005 pyrophosphatase U/μL.
  3. Incubar a 40 ° C por 2 h.
  4. Purificar RNA mediante un kit de purificación de RNA.
  5. Medir la concentración de espectrofotómetro y examinar por electroforesis en gel de agarosa.

5. RNA aislamiento de fracciones degradado y preparación del cDNA

Nota: Proceder directamente con este protocolo para la purificación de RNA si un inhibidor de la Rnasa fue utilizado como un inhibidor de la ribonucleasa. Sin embargo, cuando se usa como un inhibidor de la ribonucleasa, heparina inhiben la transcriptasa inversa utilizada en la preparación de ADNc. Por lo tanto, se necesitará adicional purificación de ARN si la heparina se utilizó en el tampón de lisis y gradiente. Véase el capítulo 6 para preparar síntesis de cDNA RNA si se usó heparina.

  1. Descongelar las muestras que contiene RNA purificación reactivo, añadir 20 ng de ARN sintético como control interno para la normalización de los resultados de la RT-qPCR. Continuar con la preparación de RNA según protocolo del fabricante excepto una modificación. Añadir 1 μl de precipitación de isopropanol previo de RNA grado del glicógeno (20 μg). Disolver el pellet de RNA en 20-25 μl de agua libre de ARNasa.
    Nota: Glucógeno sirve como soporte y ayuda a evitar pérdidas y visualizar el pellet de RNA durante la purificación. OmpA mRNA se utiliza para más de normalización en las reacciones de RT-qPCR.
  2. Medir la concentración de RNA utilizando espectrofotómetro para asegurar una producción adecuada. Combinar volúmenes iguales de las fracciones de RNA que contiene 40S, 60S y monosomes como prepolysomes. Fracciones que contienen ribosomas de 2-4 combinan como polisomas luz y combinan fracciones con 5-8 ribosomas como polisomas pesados.
  3. Usar 5-10 μl de ARN de fracciones combinadas para preparar cDNAs usando un kit y siguiendo las recomendaciones del fabricante.
  4. Añadir 80 μl de agua libre de nucleasa a 20 μl de cDNA. Congelar las muestras de cDNA a-20 ° C.

6. RNA purificación de la contaminación de la heparina

Nota: Heparina inhibe el ácido nucleico procesamiento de enzimas como la transcriptasa inversa. Por lo tanto, utilizar este protocolo de purificación adicional cuando se utiliza heparina en el buffer de lisis o en el gradiente.

  1. Añadir LiCl a una concentración final de 1 M a las muestras de RNA purificadas.
  2. Mezclar las muestras e incubar en hielo durante 1 hora.
  3. Girar las muestras a 16.000 x g y 4 ° C por 15 minutos.
  4. Quite el sobrenadante tan completo como sea posible utilizando una pipeta.
  5. Deje secar al aire los pellets durante unos 5 minutos.
  6. Vuelva a suspender los pellets en el volumen inicial de agua libre de ARNasa.
  7. Realizar la medida espectrofotométrica a 260 nm para determinar la concentración del RNA. Generalmente, la pérdida de la muestra es mínima.

7. RT-qPCR y análisis de datos de distribución de mRNA

  1. Combinar 10.2 μL de agua, 20 μL de SYBR Green, 4.8 μL de primers específicos gene (juego de 2,5 μM), 5 μL de cDNA, mezcla bien y cargar 10 μL por pocillo en triplicado en la placa de 384 pozos.
  2. Cubra la placa con la película adhesiva firmemente y centrifugar la placa a 1.800 x g durante 5 minutos.
  3. Utilizando un instrumento de PCR en tiempo real creado qPCR reacción bajo condiciones que se muestra en la tabla 1.
  4. El ciclo umbral (CT) valores y CT (ΔΔCT) método comparativo31 calculan el porcentaje (%) de distribución de mRNA en prepolysomes, la luz y polisomas pesados descrito32 con una modificación. Utilizar el RNA sintético (OmpA aquí) para la normalización de los datos en análisis de datos de RT-qPCR. El RNA sintético proporciona un control de normalización que permite calcular los niveles relativos de mRNAs y comparar en diferentes fracciones de un degradado.

8. Análisis de proteínas en las fracciones Polysomal por Western Blot

  1. De un stock de 100% (w/v), Añadir ácido tricloroacético (TCA) a las fracciones seleccionadas (500 μL) a una concentración final de 10%, mantener en hielo durante al menos 15 min, centrifugar en una microcentrífuga durante 5 minutos, descartar el sobrenadante, lavar dos veces con acetona helada y disolver en 25 μL de S DS-página carga tampón de electroforesis.
  2. La carga en el SDS-PAGE y realizar electroforesis estándar con la siguiente transferencia a la membrana PVDF. Proceder a Western Blot33.

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Resultados

En este estudio, describimos la aplicación de la técnica de generación de perfiles polysomal en tres fuentes diferentes: parásito Leishmania major, células humanas cultivadas y testículo de ratón. Las células de Leishmania crecen libremente en el medio líquido en suspensión células humanas cultivadas crecen en monocapa adherente en las placas y el testículo de ratón representa una muestra de tejido. El método se puede ajustar fácilmente a otros tipos de células cultivada...

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Discusión

Fraccionamiento polysome por gradiente de sacarosa combinada con ARN y análisis de la proteína de las fracciones es un método poderoso para analizar estado traslacional de mRNAs individuales o el conjunto translatome, así como roles de factores de la proteína de regulación traduccional maquinaria durante el normal estado fisiológico o enfermedad. Polysomal perfilado es una técnica especialmente adecuada para el estudio de regulación traduccional en organismos como trypanosomátidos incluyendo Leishmania donde con...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen Ching Lee ayuda con grabación de audio. La investigación fue apoyada por los fondos de puesta en marcha de la Texas Tech University Health Sciences Center y por el centro de excelencia de Neurociencia traslacional y terapéutica (CTNT) concede reposo PN 2017-05 AKHRJDHW a A.L.K.; en parte por subvenciones de NIH R01AI099380 K.Z. James C. Huffman y Kristen R. Baca eran eruditos CISER (centro para la integración de la madre educación e investigación) y fueron apoyados por el programa.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Instruments:
Gradient masterBiocomp Instruments Inc.108
Fraccionador de gradiente de pistónBiocomp Instruments Inc.152
Coleccionista de fraccionesGilson, Inc.FC203B
NanoDrop OneThermo ScientificNanoDrop One
NikonNikon ECLIPSETs2-FL/Ts2
2720 Termocicladoraplicado por Life Technologies4359659
incubadora de CO2Panasonic Healthcare Co.MCO-170A1CUV
HERATHERM Incubadora ThermoScientific51028063
Cabina de Seguridad Biológica, clase II, tipo A2NuAire Inc.NU-543-400
Congelador RevcoRevco TechnologiesULT1386-5-D35
Beckman L8-M UltracentifugeBeckman CoulterL8M-70
CentrífugaEppendorf5810R
Eppendorf5424
Rotor ultracentrífugo SW41Beckman Coulter331362
Rotor de cuchara giratoriaEppendorfA-4-62
Rotor de ángulo fijoEppendorfF-45-30-11
Máquina de PCR en tiempo real Quant Studio 12K Flex 285880228Applied Biosystems de Life Technologies4470661
TC20 Contador de células automatizadoBio-Rad145-0102
HemacitómetroHausser Scientific02-671-51B
fuerte 
software Triax Biocomp Instruments Inc.
Materiales:
Portaobjetos de conteo, doble cámara para contador de célulasBio-Rad145-0011
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLUSA Scientific1615-5500
Tubos de centrífuga polyclear de tapa abierta, (14 mm x 89 mm)Jeringa Seton Scientific7030
, 5 mLBD
Jeringa BD Calibre 3 mL23 Aguja de 1 pulgadaBD10020439
Nunclon Delta Placa de superficie, 14 cmThermo Scientific168381
Nunclon Delta Placa de superficie, 9 cmThermo Scientific172931
Nalgene unidad de filtro de flujo rápido de 90 mm, 500 mL, 0,2 aPESThermo Scientific569-0020
BioLite 75 cm3Thermo Scientific130193
Nunc Tubos de centrífuga cónicos de 50 mLThermo Scientific339653
Chemicals:
Trizol LSAmbion de Life Technologies10296028
HEPESFisher ScientificBP310-500
Trizma baseSigmaT1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium's Glucosa media-alta (DMEM)SigmaD6429-500ML
Suero fetal bovino (FBS)SigmaF0926-50ML
Penicilina-Estreptomicina (P/S)SigmaP0781-100ML
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco ( DPBS)SigmaD8537-500ML
Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2x6H2O)Acros OrganicsAC413415000
Cloruro de potasio (KCl)SigmaP9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40)Fluka (Sigma-Aldrich)74385
Rnasina recombinante Inhibidor de la ribonucleasaPromegaN2511
Heparina sal de sodioSigmaH3993-1MU
cOmplete Mini inhibidores de la proteasa sin EDTARoche Diagnostics11836170001
GlycogenThermo ScientificR0551
WaterSigmaW4502-1L
CicloheximidaSigmaC7698-1G
CloroformoFisher Scientific194002
Dithiotreitol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Bromuro de etidioFisher ScientificBP-1302-10
Ácido etilendiaminotetraacético disódico deshidratado (EDTA)Fisher ScientificS316-212
OptimemLife Technologies22600050
Dihidrocloruro de puromicinaSigmaP8833-100MG
SacarosaFisher ScientificS5-3KG
Solución de tripsina-EDTASigmaT4049-100ML
Hgh Capacidad de ADNc Transcriptasa Inversa KitBiosystems aplicados por life technologies4368814
Power SYBR Green PCR Master MixBiosystems aplicados por life technologies4367659
HClFisher ScientificA144SI-212
IsopropanolFisher ScientificBP26324
Hidróxido de potasio (KOH)Sigma221473-500G
Anticuerpo anti-RPL11Abcamab79352
Anticuerpo de proteína ribosómica S6 (C-8)Santa Cruz Biotechnology Inc.sc-74459
1xM199SigmaM0393-10X1L
cloruro de litioSigmaL-9650
Dimetilsulfóxido (DMSO)Fisher ScientificD128-500
Tampón de carga de gel IIThermo ScientificAM8546G
UltraPure AgaroseThermo Scientific16500-100
Ácido tricloroacético (TCA)Fisher ScientificA322-100
SuperSignal West Pico PLUS sustrato quimioluminiscenteThermo Scientific34580
FormaldehídoFisher ScientificBP531-500
Dodecil Sulfato de sodio (SDS)SigmaL5750-1KG
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)SigmaP7626-5G
RNeasy Mini kitQiagen74104
Adenosina 5′-trifosfato sodio sódico hidrato (ATP)SigmaA1852-1VL
Citosina 5'-trifosfato sódico sódico hidrato (CTP)SigmaC1506-250MG
Uridina 5'-trifosfato sal trisódica hidratado (UTP)SigmaU6625-100MG
Guanosina 5'-trifosfato hidrato de sal sódica (GTP)SigmaG8877-250MG
SP6 ARN polimerasaNEBM0207S
pirofosfatasaSigmaI1643-500UN
EspermidinaSigmaS0266-1G
Microscopio invertido 309646

Referencias

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