Artículo de método

Polysome perfilado en Leishmania, las células humanas y testículo de ratón

DOI:

10.3791/57600

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8 de abril de 2018

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1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Department of Biological Sciences, Texas Tech University, 3CISER (Center for the Integration of STEM Education & Research), Texas Tech University

En este artículo

Resumen

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El objetivo general de la técnica de generación de perfiles polysome es análisis de actividad traslacional de mRNAs individuales o transcriptoma mRNAs durante la síntesis de proteínas. El método es importante para los estudios de regulación de la síntesis de proteínas, activación de la traducción y represión en salud y múltiples enfermedades humanas.

Resumen

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Expresión de la proteína adecuada en el momento adecuado y en las cantidades adecuadas es la base de la función normal de la célula y la supervivencia en un entorno rápidamente cambiante. Durante mucho tiempo, los estudios de expresión génica fueron dominados por la investigación a nivel transcripcional. Sin embargo, los niveles de estado estacionario de mRNAs no se correlacionan bien con la producción de proteínas, y la traducción de los mRNAs varía grandemente dependiendo de las condiciones. En algunos organismos, como el parásito Leishmania, la expresión de proteínas está regulada principalmente a nivel traslacional. Estudios recientes demostraron que dysregulation de traducción de proteínas se asocia con cáncer, metabólico, neurodegenerativas y otras enfermedades humanas. Polysome perfilado es un poderoso método para estudiar la regulación de la traducción de proteínas. Permite medir el estado traslacional de mRNAs individuales o estudiar traducción en una escala genoma-ancha. La base de esta técnica es la separación de polisomas, ribosomas, sus subunidades y mRNAs gratis durante la centrifugación de un citoplásmico lisado a través de un gradiente de sacarosa. Aquí, presentamos un universal polysome perfiles protocolo utilizado en tres modelos diferentes - parásito Leishmania major, células humanas cultivadas y tejidos animales. Las células de Leishmania crecen libremente en suspensión y células humanas cultivadas crecen en monocapa adherente, mientras que el testículo del ratón representa una muestra de tejido animal. Así, la técnica se adapta a todas estas fuentes. El protocolo para el análisis de fracciones polysomal incluye la detección de los niveles de mRNA por RT-qPCR, proteínas por Western blot y análisis de ARN ribosómico mediante electroforesis. El método puede ampliarse aún más por la examinación de mRNAs de asociación con el ribosoma a nivel de transcriptoma por RNA-seq profunda y análisis de proteínas ribosoma asociados por espectroscopía de masas de las fracciones. El método se puede ajustar fácilmente a otros modelos biológicos.

Introducción

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Regulación de la expresión génica en las células es controlada por mecanismos transcripcionales y postranscripcional y postraduccionales. Avances en la secuenciación del RNA profunda permiten el estudio de los niveles de mRNA de estado estacionario en una escala genoma-ancha en un nivel sin precedentes. Sin embargo, hallazgos recientes revelaron que nivel de mRNA de estado estacionario no se correlaciona siempre con proteína producción1,2. El destino de una transcripción individual es muy complejo y depende de muchos factores como estímulos internos/externos, estrés, etcetera. Regulación de la expresi....

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Protocolo

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Todos los tratamientos de animales y manejo de los tejidos obtenidos en el estudio fueron realizados según protocolos de actuación aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en la Texas Tech University Health Science Center, según los institutos nacionales de Pautas de bienestar animal salud, número de protocolo 96005. Por favor, sacrificar animales vertebrados y preparar los tejidos según las directrices del Comité de uso y cuidado de Animal institucional. Si carece de dicho Comité, por favor consulte las pautas de bienestar animal de institutos nacionales de salud. Adultos (> 60 días de edad) fueron utilizados ratones C57BL/6. Todos los animale....

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Resultados

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En este estudio, describimos la aplicación de la técnica de generación de perfiles polysomal en tres fuentes diferentes: parásito Leishmania major, células humanas cultivadas y testículo de ratón. Las células de Leishmania crecen libremente en el medio líquido en suspensión células humanas cultivadas crecen en monocapa adherente en las placas y el testículo de ratón representa una muestra de tejido. El método se puede ajustar fácilmente a otros tipos de células cultivada.......

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Discusión

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Fraccionamiento polysome por gradiente de sacarosa combinada con ARN y análisis de la proteína de las fracciones es un método poderoso para analizar estado traslacional de mRNAs individuales o el conjunto translatome, así como roles de factores de la proteína de regulación traduccional maquinaria durante el normal estado fisiológico o enfermedad. Polysomal perfilado es una técnica especialmente adecuada para el estudio de regulación traduccional en organismos como trypanosomátidos incluyendo Leishmania donde con.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores agradecen Ching Lee ayuda con grabación de audio. La investigación fue apoyada por los fondos de puesta en marcha de la Texas Tech University Health Sciences Center y por el centro de excelencia de Neurociencia traslacional y terapéutica (CTNT) concede reposo PN 2017-05 AKHRJDHW a A.L.K.; en parte por subvenciones de NIH R01AI099380 K.Z. James C. Huffman y Kristen R. Baca eran eruditos CISER (centro para la integración de la madre educación e investigación) y fueron apoyados por el programa.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Instruments:
Gradient masterBiocomp Instruments Inc.108
Fraccionador de gradiente de pistónBiocomp Instruments Inc.152
Coleccionista de fraccionesGilson, Inc.FC203B
NanoDrop OneThermo ScientificNanoDrop One
NikonNikon ECLIPSETs2-FL/Ts2
2720 Termocicladoraplicado por Life Technologies4359659
incubadora de CO2Panasonic Healthcare Co.MCO-170A1CUV
HERATHERM Incubadora ThermoScientific51028063
Cabina de Seguridad Biológica, clase II, tipo A2NuAire Inc.NU-543-400
Congelador RevcoRevco TechnologiesULT1386-5-D35
Beckman L8-M UltracentifugeBeckman CoulterL8M-70
CentrífugaEppendorf5810R
Eppendorf5424
Rotor ultracentrífugo SW41Beckman Coulter331362
Rotor de cuchara giratoriaEppendorfA-4-62
Rotor de ángulo fijoEppendorfF-45-30-11
Máquina de PCR en tiempo real Quant Studio 12K Flex 285880228Applied Biosystems de Life Technologies4470661
TC20 Contador de células automatizadoBio-Rad145-0102
HemacitómetroHausser Scientific02-671-51B
fuerte 
software Triax Biocomp Instruments Inc.
Materiales:
Portaobjetos de conteo, doble cámara para contador de célulasBio-Rad145-0011
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLUSA Scientific1615-5500
Tubos de centrífuga polyclear de tapa abierta, (14 mm x 89 mm)Jeringa Seton Scientific7030
, 5 mLBD
Jeringa BD Calibre 3 mL23 Aguja de 1 pulgadaBD10020439
Nunclon Delta Placa de superficie, 14 cmThermo Scientific168381
Nunclon Delta Placa de superficie, 9 cmThermo Scientific172931
Nalgene unidad de filtro de flujo rápido de 90 mm, 500 mL, 0,2 aPESThermo Scientific569-0020
BioLite 75 cm3Thermo Scientific130193
Nunc Tubos de centrífuga cónicos de 50 mLThermo Scientific339653
Chemicals:
Trizol LSAmbion de Life Technologies10296028
HEPESFisher ScientificBP310-500
Trizma baseSigmaT1378-5KG
Dulbecco's Modified Eagle's Medium's Glucosa media-alta (DMEM)SigmaD6429-500ML
Suero fetal bovino (FBS)SigmaF0926-50ML
Penicilina-Estreptomicina (P/S)SigmaP0781-100ML
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco ( DPBS)SigmaD8537-500ML
Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2x6H2O)Acros OrganicsAC413415000
Cloruro de potasio (KCl)SigmaP9541-500G
Nonidet P 40 (NP-40)Fluka (Sigma-Aldrich)74385
Rnasina recombinante Inhibidor de la ribonucleasaPromegaN2511
Heparina sal de sodioSigmaH3993-1MU
cOmplete Mini inhibidores de la proteasa sin EDTARoche Diagnostics11836170001
GlycogenThermo ScientificR0551
WaterSigmaW4502-1L
CicloheximidaSigmaC7698-1G
CloroformoFisher Scientific194002
Dithiotreitol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Bromuro de etidioFisher ScientificBP-1302-10
Ácido etilendiaminotetraacético disódico deshidratado (EDTA)Fisher ScientificS316-212
OptimemLife Technologies22600050
Dihidrocloruro de puromicinaSigmaP8833-100MG
SacarosaFisher ScientificS5-3KG
Solución de tripsina-EDTASigmaT4049-100ML
Hgh Capacidad de ADNc Transcriptasa Inversa KitBiosystems aplicados por life technologies4368814
Power SYBR Green PCR Master MixBiosystems aplicados por life technologies4367659
HClFisher ScientificA144SI-212
IsopropanolFisher ScientificBP26324
Hidróxido de potasio (KOH)Sigma221473-500G
Anticuerpo anti-RPL11Abcamab79352
Anticuerpo de proteína ribosómica S6 (C-8)Santa Cruz Biotechnology Inc.sc-74459
1xM199SigmaM0393-10X1L
cloruro de litioSigmaL-9650
Dimetilsulfóxido (DMSO)Fisher ScientificD128-500
Tampón de carga de gel IIThermo ScientificAM8546G
UltraPure AgaroseThermo Scientific16500-100
Ácido tricloroacético (TCA)Fisher ScientificA322-100
SuperSignal West Pico PLUS sustrato quimioluminiscenteThermo Scientific34580
FormaldehídoFisher ScientificBP531-500
Dodecil Sulfato de sodio (SDS)SigmaL5750-1KG
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)SigmaP7626-5G
RNeasy Mini kitQiagen74104
Adenosina 5′-trifosfato sodio sódico hidrato (ATP)SigmaA1852-1VL
Citosina 5'-trifosfato sódico sódico hidrato (CTP)SigmaC1506-250MG
Uridina 5'-trifosfato sal trisódica hidratado (UTP)SigmaU6625-100MG
Guanosina 5'-trifosfato hidrato de sal sódica (GTP)SigmaG8877-250MG
SP6 ARN polimerasaNEBM0207S
pirofosfatasaSigmaI1643-500UN
EspermidinaSigmaS0266-1G
Microscopio invertido 309646

Referencias

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  1. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host.

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