Identificación de variantes genéticas que contribuyen a enfermedades humanas complejas nos permite identificar nuevos mecanismos. Aquí, demostramos un enfoque genotyping multiplex para genes candidatos o análisis de la vía genética que maximiza la cobertura a bajo costo y es favorable a los estudios de cohorte.
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Artículo de método
Genes candidatos en estudios de cohorte clínica con genotipificación multiplexado y espectrometría de masas
En este artículo
Resumen
Resumen
Enfermedades complejas a menudo se basa en múltiples variantes genéticas comunes que contribuyen a la susceptibilidad de la enfermedad. Aquí, describimos un enfoque de polimorfismo (SNP) de un solo nucleótido etiqueta rentable usando un análisis de genotipificación multiplexados con espectrometría de masas, para investigar las asociaciones vía gene en cohortes clínicas. Investigamos el locus de candidato de alergia de alimentos Interleukin13 (IL13) como ejemplo. Este método maximiza eficientemente la cobertura mediante el aprovechamiento compartido de ligamiento (LD) dentro de una región. SNPs seleccionados de LD se diseñó en un ensayo de multiplexado, que permite hasta 40 diferentes SNP a analizar al mismo tiempo, impulsar la rentabilidad. Reacción en cadena de polimerasa (PCR) se utiliza para amplificar los loci de destino, seguidos por extensión de un solo nucleótido, y los amplicones se miden mediante láser asistida por matriz de desorción/ionización-tiempo de espectrometría de masas flight(MALDI-TOF). La salida se analiza con el genotipo llamada software, utilizando las definiciones de control de calidad estricto y cortes, y genotipos de alta probabilidad se determina y de salida para análisis de datos.
Introducción
En las enfermedades humanas complejas, variantes genéticas que contribuyen a la susceptibilidad de la enfermedad y cuantificar estas variantes puede ser útil para la patogenesia de la comprensión, identificar grupos de pacientes de alto riesgo y equipos de respuesta de tratamiento. De hecho, la promesa de la medicina de precisión depende utilizando información genómica para identificar subgrupos de pacientes1. Por desgracia, dentro del espacio de Biología de la enfermedad compleja, donde los fenotipos de la enfermedad se basa en la considerable heterogeneidad genética, baja penetrancia y expresividad variable, cohorte tamaño requisitos para enf....
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Protocolo
El material genético utilizado fue éticamente aprobado para uso en la oficina para niños HREC (humano investigación Comité de ética) (FCD/07/492), el Departamento de HREC de servicios humanos (10/07) y Hospital (RCH del Royal Children) HREC (27047).
1. diseñar el ensayo multiplexado
- Prepare una lista SNP para el diseño del ensayo.
- La región objetivo de entrada a la función de tagger de Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Utilice el LD (correlación, r2) entre SNPs que abarca la región objetivo para generar una lista de SNPs, que proporciona cobertura total de la región deseada con el m....
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Resultados
Con el protocolo descrito anteriormente, se genotipificaron etiqueta SNPs en el gen inmune Th2 IL13 en una cohorte de alergia de alimentos casos y controles9. Se aplicó análisis de regresión logística, ajustado por ascendencia y otras covariables potenciales probar si las variantes genéticas dentro de la región de interés aumentaron riesgo de alergia alimentaria. Tabla 10 9 demuestra que una variante rs1295686 se as.......
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Discusión
Aquí, demostramos que el método de multiplexado genotipado mediante espectrometría de masas. Se obtuvieron los resultados representativos mediante PCR con MALDI-TOF espectrometría de masa4 con química de ensayo enumerados en la Tabla de materiales13. Con esta plataforma, hemos generado un total de 11.295 genotipos en 1.255 personas para 9 SNPs dentro de 40 h en el laboratorio.
Nos ilustran la utilidad de la técnica en contestar h.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores no tienen ninguna agradecimientos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ADN genómico | - | - | 1 y mu; L a una concentración de 5-10 ng/μ L |
| Imprimaciones: amplificación y extensión directa e inversa | IDT-ver | manuscrito sección 1.2.1 sobre diseño de cebadores | |
| Agua desionizada | Por ejemplo, agua Milli-Q | - | desionizado con 18.2 MΩ. Resistividad cm |
| Kit de reactivos de genotipado. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | incluye todos los reactivos para reacciones en 2.2.1, 2.3.1 y 2.4.2, placas de PCR de chip y resina |
| (384 pocillos) | Abgene | #ABGAB-1384 | Para el sistema MassARRAY las placas de Abgene son compatibles |
| Micropipetas centrífugas | de uno y 8 canales | ||
| compatible con placas de 384 pocillos | |||
| Termociclador | compatible con programas de PCR como se detalla en 2.2.4, 2.3.2 y 2.4.3 | ||
| Placa de resina con hoyuelos | Agena Bioscience | 6 mg, rotador de placa de 384 pocillos | |
| Espectrómetro de masas MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (desorción/ionización láser asistida por matriz y tiempo de vuelo). | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Herramienta utilizada para diseñar los ensayos de genotipado multiplex | |
| Hot Start Taq | DNA polymerasa enzyme | ||
| Resina | Agena Biosciences | Se suministra con el |
Referencias
- Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
- Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction....
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Reimpresiones y permisos
