Artículo de método

Un modelo In Vitro para estudiar el efecto de la terapia fotodinámica mediada por el ácido aminolevulínico 5 de Biofilm de Staphylococcus aureus

7.2K vistas

⸱

DOI:

10.3791/57604

⸱

16 de abril de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye & ENT Hospital, Shanghai Key Clinical Disciplines of otorhinolaryngology, Fudan University, 2Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Department of Medical Microbiology and Parasitology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College of Fudan University, 3Department of Dermatology, Huashan Hospital, Fudan University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo para estudiar el efecto antimicrobiano de terapia fotodinámica mediada por el ácido de 5-aminolevulínico (ALA-PDT) en el biofilm de Staphylococcus aureus . Este protocolo puede utilizarse para desarrollar un modelo de vitro para estudiar el tratamiento de los biofilms bacterianos con TFD en el futuro.

Resumen

Staphylococcus aureus (S. aureus) es un patógeno humano común, que causa infecciones piógenas y sistémicas. S. aureus las infecciones son difíciles de erradicar no sólo debido a la aparición de cepas resistentes a los antibióticos pero también su capacidad de forma biofilms. Recientemente, la terapia fotodinámica (TFD) ha indicado como uno de los posibles tratamientos para el control de las infecciones de biofilm. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales para mejorar nuestro conocimiento de su efecto sobre biofilms bacterianos, así como los mecanismos subyacentes. Este manuscrito describe un modelo in vitro de la TFD con ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), un precursor de la actual fotosensibilizador, protoporfirina IX (PpIX). Brevemente, maduro S. aureus biopelículas fueron incubados con ALA y entonces expuestos a la luz. Posteriormente, el efecto antibacteriano de ALA-PDT en el biofilm de S. aureus fue cuantificado calculando las colonias formando unidades (UFC) y visualizado por tinción mediante láser confocal de barrido (CLSM) la microscopia fluorescente de viabilidad. Resultados representativos demostraron un fuerte efecto antibacteriano de ALA-PDT en biopelículas de S. aureus . Este protocolo es simple y puede utilizarse para desarrollar un modelo de vitro para estudiar el tratamiento de los biofilms de S. aureus con ALA-PDT. En el futuro, también podría hacer referencia en los estudios de PDT utilizando otros photosensitizers por diferentes cepas bacterianas con ajustes mínimos.

Introducción

S. aureus es un importante patógeno gram-positivo que coloniza la piel y mucosa de los ejércitos humanos. Su capacidad de forma biofilms se considera un aspecto importante de su patogenesia1. Biofilms bacterianos son una comunidad de bacterias embebidas en una matriz de producción propia, que se compone de sustancias poliméricas extracelulares, incluyendo polisacárido, ADN y proteínas. Esta matriz juega un papel importante en la persistencia de las infecciones bacterianas, que contribuyen a un alto grado de resistencia al sistema inmunológico humano y terapias antimicrobianas actuales2. Antibióticos siguen siendo el tratamiento principal para las infecciones de biofilm, aunque los efectos de los antibióticos en los biofilms son limitados. Previamente se ha demostrado que las células en los biofilms son 10 a 1.000 veces más resistentes a los antibióticos en comparación con sus contrapartes planctónicas3. Así, se necesitan estrategias alternativas para vencer este problema.

PDT, un tratamiento alternativo para las infecciones bacterianas, utiliza la luz de una longitud de onda adecuada para activar photosensitizers. Esto conduce a la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), que son letales a las células diana por alterar la pared celular, inactivar enzimas y dañando DNA4. Esta característica de destino múltiples hace difícil para las bacterias desarrollar resistencia al tratamiento de PDT.

El efecto antimicrobiano de la TFD en biofilms de bacterianos y hongos, con photosensitizers múltiples, tales como azul de toluidina, verde malaquita, azul de metileno, cloro e6 y las porfirinas, se ha estudiado en anteriores informes5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, un profármaco de la real fotosensibilizador, PpIX, se caracteriza por su pequeño peso molecular y separación rápida12,14. Estas ventajas dan gran potencial ALA-PDT como un uso terapéutico. Aunque el efecto de ALA-PDT en bacterias planctónicas ha sido estudiado por muchos grupos12, el efecto antimicrobiano de ALA-PDT en biopelículas bacterianas ha todavía no se ha aclarado. Mientras tanto, es difícil comparar los resultados entre los estudios previos. Una de las razones es que los diferentes protocolos son utilizados por diversos grupos. Así, este protocolo describe un modelo en vitro de un sistema de ALA-PDT basado en nuestro anterior trabajo15. El efecto de este modelo fue confirmado por cálculo de UFC y viabilidad de tinción con CLSM.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Biofilm formación

  1. Formación de biopelículas en microplacas de 96 pocillos
    1. Recuperar la S. aureus cepa USA300 y 3 formación de biofilm clínicas cepas (C1 - C3) almacenadas a-80 ° C.
      Nota: La capacidad de las cepas clínicas para formar biofilms se determinó por el ensayo de placa de microtitulación descrito previamente15.
    2. Inocular la bacteria en medio de 5 mL triptona soja caldo (TSB) y cultivan en una incubadora con agitación a 37 ° C durante la noche a la fase estacionaria.
    3. Centrifugar el cultivo bacteriano durante la noche a 4.000 x g por 10 min a 25 ° C y luego descartar el sobrenadante. Resuspender el pellet en tampón fosfato salino (PBS) a una concentración final de 2.0 x 109 UFC/mL.
      Nota: La concentración de las bacterias fue estimada midiendo la densidad óptica y más determinada por la placa de la cuenta16, revelando que OD 1600 de suspensión contenida 1.5 x 108 UFC/mL.
    4. Diluir la suspensión bacteriana a 1: 200 (1.0 x 107 UFC/mL) en medio TSB conteniendo 0.5% de glucosa. Inocular 200 μL de suspensión bacteriana en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos poliestireno tratada con cultura de célula.
    5. Incube las microplacas estáticamente a 37 ° C durante 24 h. bajo un ambiente bien oxigenado.
      Nota: El tiempo de incubación para la formación de biopelículas maduras puede variar por diferentes cepas bacterianas; Esto debe determinarse antes de que el PDT experimento15.
    6. Desechar los medios de comunicación en los pozos y lavar los pocillos de la microplaca suavemente con PBS tres veces y luego desechar el sobrenadante.
      Nota: El paso debe ser realizado muy suavemente para evitar molestar a la biopelícula formada.
  2. Formación de biopelículas en platos
    1. Inocular la cepa de S. aureus USA300 en 5 mL de medio TSB y cultivan en una incubadora con agitación a 37 ° C durante la noche a la fase estacionaria.
    2. Centrifugar el cultivo bacteriano durante la noche a 4.000 x g por 10 min a 25 ° C y luego descartar el sobrenadante. Resuspender el pellet en PBS a una concentración final de 2.0 x 109 UFC/mL. Luego, diluir la suspensión bacteriana a 1: 200 (1.0 x 107 UFC/mL) en medio TSB conteniendo 0.5% de glucosa. Inocular 2 mL de la suspensión bacteriana en una placa de cultivo celular calidad óptica 35 mm cristal inferior e incubar estáticamente a 37 ° C durante 24 h.
      Nota: La concentración de las bacterias se estimó midiendo la densidad óptica.
    3. Aspire los medios con una pipeta y luego enjuague los biofilms en el plato suavemente con PBS 3 veces y luego, descartar el sobrenadante cuidadosamente.
      Nota: Evite tocar la punta de la pipeta hasta el fondo del plato. El paso 2.2 debe realizarse inmediatamente después de este paso para prevenir la resequedad de la biopelícula formada.

2. fotopolimerización

  1. Almacenar 5-ALA en el refrigerador de 4 ° C. Antes del experimento, diluir 5-ALA con PBS a 10 mM.
    Nota: 5-ALA solución debe estar recién preparada antes del experimento.
  2. En el grupo experimental, añadir 200 μL de 10 mM de ALA en cada pocillo de la microplaca o 2 mL a la placa de cultivo. Cubrir el plato/plato con papel de aluminio e incubar durante 1 h. Entonces, irradiar el plato/plato con un diodo emisor de luz (LED) con una intensidad de luz de 100 mW/cm2 durante 1 hora lograr una ligera dosis de 360 J/cm2 en una gran longitud de onda de 633 ± 10 nm17.
    Nota: Para permitir que la energía de la luz efectivamente e igualmente entregar a la biopelícula en todos los pozos/platos, arreglar la distancia desde el pico de la fuente de luz para el bien/plato a 6,0 cm y limitar la región experimental en el área central de la irradiación (10 cm x 8 cm). para asegurar que los resultados son reproducibles, los experimentos deben realizarse a la misma temperatura de la habitación.
    En el paso de radiación de LED, para evitar la exposición directa de la placa a otras fuentes de luz, como luz solar, iluminación de la sala o luz artificial, el LED se enciende antes de mover el plato de placa a la zona de irradiación, y la luz era lo suficientemente brillante para terminar la operación.
  3. Configurar los grupos de control (grupos de control tres se establecieron en nuestro experimento).
    1. Para el control del primer grupo (ALA - LED-), añadir 200 μL de PBS a cada pocillo de la microplaca o 2 mL a la placa de cultivo. Cubrir el plato/plato con papel de aluminio e incubar durante 2 h.
    2. Para el segundo grupo de control (ALA + LED-), añadir 200 μL de 10 mM de ALA a cada pocillo de la microplaca o 2 mL a la placa de cultivo. Cubrir el plato/plato con papel de aluminio e incubar durante 2 h.
    3. En el tercer grupo de control (ALA-LED +), añadir 200 μL de PBS a cada pocillo de la microplaca o 2 mL a la placa de cultivo. Cubrir el plato/plato con papel de aluminio e incubar durante 1 h. Luego exponer la placa para el LED con 360 J/cm2 irradiación de la luz en una longitud de onda mayor de 633 ± 10 nm17.
      Nota: En el paso de radiación de LED, evite la exposición directa de la placa a otras fuentes de luz, como luz solar, iluminación de la sala o luz artificial.

3. determinación de la efectividad del tratamiento de PDT

Nota: Para confirmar el efecto de ALA-PDT en las biopelículas de S. aureus , la viabilidad de las células con o sin ALA-PDT se evaluó por conteo de UFC, así como por la coloración de la viabilidad.

  1. Determinación de las restantes células bacterianas viables
    1. Después del tratamiento de ALA-PDT, desechar los medios de comunicación en los pocillos y lavar los pocillos con PBS tres veces para eliminar todas las células no adherentes para ambos experimental y grupos de control.
      Nota: Este paso debe realizarse muy suavemente.
    2. Raspar las células de bacterias adherentes fondo de los pozos con la punta de la pipeta y recoger las células en tubos cónicos.
    3. Centrifugar la suspensión bacteriana a 4.000 x g por 10 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
    4. Resuspender las bacterias en 1 mL de enzima pancreatina de 0,25% en PBS e incubar a 37 ° C durante 1,5 horas.
    5. Centrifugar a 4.000 x g por 10 min; desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 μL de PBS.
    6. Hacer 1:10 diluciones seriadas de la solución de células con PBS; a continuación, añadir 5 μl de cada muestra de dilución seriada en la placa de agar (TSA) triptona soja. Incubar la placa TSA a 37 ° C por 16 h; entonces, la cuenta (por ojo) el número de colonias bacterianas (UFC/mL).
  2. Observación de biopelículas de S. aureus por CLSM
    1. Después de la irradiación de la luz, lavar las biopelículas en la placa de cultivo con PBS tres veces.
      Nota: Este paso debe realizarse muy suavemente.
    2. Añadir 1 mL de 1 μm fluorescente verde nuclear y mancha de cromosoma que es permeable a las membranas de células procariotas (por ejemplo, SYTO9) y 1 mL de yoduro de propidio 1 μm (PI) por 20 min a manchar el biofilm como células muertas.
    3. Observar células viables (verde fluorescencia, Ex / Em 485 nm/530 nm) y las células muertas (fluorescencia roja, Ex / Em 485 nm/630nm) bajo un CLSM con un objetivo de inmersión en aceite 63 X 1.4-NA.
    4. Generar imágenes utilizando el software de la microscopia.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

La viabilidad de las bacterias en los biofilms disminuyó después del tratamiento de ALA-PDT en comparación con los controles (ALA - LED-, ALA + LED - y ALA-LED +) USA300 y las tres cepas clínicas (figura 1).

Para confirmar los resultados de la UFC de ensayo y observan el anti-bacteriano efecto de ALA-PDT en el S. aureus biofilm en situ, el USA300 biofilms se visualizaron por CLSM c...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

PDT ha sido una terapia muy estudiada para el tratamiento del cáncer desde que fue inventado hace más de 100 años18. En la última década, PDT ha sido aplicada como una estrategia antimicrobiana y ha mostrado eficacia contra algunas bacterias patógenas resistentes a los antibióticos12. En comparación con el estado planctónico, biopelículas bacterianas parecen ser más resistentes al tratamiento antibiótico3, mientras que el efecto de ALA-PDT en biofilm...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la nacional naturaleza ciencia Fundación de China para jóvenes académicos (Nº 81300810), programa de formación de médico joven de Shangai (Nº 20141057) y Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (81671982, 81271791 y 81571955). Nos gustaría dar las gracias a LetPub (www.letpub.com) para prestar asistencia lingüística durante la preparación de este manuscrito.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Caldo de Soja de Triptona (TSB)OXOIDCM0129B
Agar de Soja de Triptona (TSA)OXOIDCM0131
SYTO9Thermo Fisher ScientificL7012Los Kits de Viabilidad Bacteriana BacLight VIVOS/MUERTOS 
Yoduro de propidio (PI)Thermo Fisher ScientificL7012Los kits de viabilidad bacteriana BacLight VIVOS/MUERTOS 
PancreatinaSigma-AldrichP3292
Ácido 5-aminolevulínico (ALA)Fudan Zhangjiang Bio-Pharm3.1
Staphylococcus aureus cepa USA300//La fuente de las referencias de USA 300 " Tenover FC, Goering RV. J Quimiotera antimicrobiana. septiembre de 2009; 64(3):441-6".
Staphylococcus aureus cepas clínicas (C1-C3)//Todas las cepas clínicas se aislaron de pacientes con rinosinusitis crónica en el Departamento de Otorrinolaringología-Cirugía de Cabeza y Cuello, Hospital Oftalmológico y Otorrinolaringólogo de la Universidad de Fudan [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627].
Microplaca de 96 pocillosCorning Inc3599Poliestireno transparente de fondo plano Microplacas tratadas con TC, envueltas individualmente, con tapa,
fluoroplatoNEST Biotechnology801001Fondo de vidrio, no pirogénico
Tubos Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mLMicrocentrífuga Eppendorf0030120086
Eppendorf 5417EppendorfZ365998 |  Incubadora SIGMA
Thermo Fisher ScientificSHKE4000MaxQ 4000 Agitadores orbitales de sobremesa
Diodo emisor de luz (LED)Wuhan Yage Técnica óptica y electrónica COLED-IB
Microscopio de barrido láser confocal Leica TCS SP8Leica Microsystems
Leica LAS AF SoftwareLeica Microsystems
IMARIS Plano de bits
estéril de software

Referencias

  1. Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
  2. Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
  3. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
  4. Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
  5. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
  6. Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
  7. Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
  8. Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
  9. Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202(2015).
  10. Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D'Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
  11. De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039(2015).
  12. Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
  13. Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. Antifungal photodynamic therapy. Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).
  14. Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
  15. Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627(2017).
  16. Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863(2013).
  17. Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
  18. St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
  19. O'Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
  20. Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
  21. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
  22. Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
  23. Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Unidades Formadoras de ColoniasMicroscop a Confocal de Barrido L serTinci n FluorescenteViabilidad BacterianaFormaci n de BiofilmsEfecto Antimicrobiano

Artículos relacionados