Lentivirales mediación producción de ratones transgénicos: un método Simple y altamente eficiente para el estudio directo de los fundadores

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para promover la integración del transgén y la producción de ratones transgénicos fundador con alta eficacia por una simple inyección de lentivirales vector en el espacio perivitelino de un ovocito fertilizado.

Resumen

Durante casi 40 años, inyección pronuclear de ADN representa el método estándar para generar ratones transgénicos con la integración aleatoria de transgenes. Un procedimiento de rutina se utiliza extensamente en todo el mundo y su principal limitación reside en la pobre eficacia de la integración del transgén, resultando en un bajo rendimiento de los animales del fundador. Sólo pequeño porcentaje de animales nacidos después de la implantación de óvulos fertilizados inyectados ha integrado el transgén. Por el contrario, vectores lentivirales son poderosas herramientas para la transferencia de genes integradora y su uso para transducir ovocitos fertilizados permite producción altamente eficiente del fundador de ratones transgénicos con un rendimiento promedio superior al 70%. Además, cualquier cepa de ratón se puede utilizar para producir animales transgénicos y la penetrancia de la expresión del transgén es extremadamente alto, por encima del 80% con transgénesis mediada lentivirales comparado con microinyección de DNA. El tamaño del fragmento de ADN que puede ser carga por el vector lentivirales se limita a 10 kb y representa la principal limitación de este método. Usando un simple y fácil de realizar el procedimiento de inyección debajo de la zona pelúcida de ovocitos fertilizados, pueden producir más de 50 animales del fundador en una sola sesión de microinyección. Dicho método está altamente adaptado para llevar a cabo, directamente en los animales de fundador, rápida ganancia y pérdida de estudios de la función o a regiones de ADN genómicas de pantalla por su capacidad para controlar y regular la expresión génica en vivo.

Introducción

El trabajo pionero de Gordon et al. en 1980 demostró que después de la implantación en ratones seudopreñadas, la inyección de DNA de plásmido en la masculina pronúcleos de ovocitos fertilizados puede rendir la producción de animales transgénicos que integran el plásmido de ADN¹. La demostración que mamíferos transgénicos pueden ser generados tuvo un enorme impacto en Ciencias de la vida mundiales, abriendo el camino a nuevos campos de investigación tanto en ciencias básicas y ciencias biomédicas traslacionales. En las últimas cuatro décadas, microinyección de ADN se ha convertido en una práctica habitual. Aunque se han produci....

Protocolo

Todos los procedimientos que incluyen trabajo animal han obtenido aprobación ética y han sido autorizados por el Ministerio francés de investigación y educación bajo el número APAFIS #5094-20 v6 16032916219274 y 05311.02. El Animalario ICM PHENOPARC ha sido acreditado por el Ministerio francés de agricultura bajo el número de acreditación B75 13 19. El protocolo general requiere realizar cada procedimiento dentro de un marco de tiempo exacto que se resume en la figura 1.

1. animal compra y preparación de compuestos básicos

1. Compra de animales
   1. Ordenar 25 machos vasectomizados B6CBAF1/JRj que son....

Resultados

Animales transgénicos fueron generados usando el protocolo presentado aquí. Representante resultados tanto ubicua y expresión de transgenes específicos tipo de célula se ilustran.

Expresión constitutiva de transgenes

Promotores ubicuos son herramientas de investigación básica para expresar transgenes en forma sostenida y eficaz. Estos promotores se uti.......

Discusión

La inyección perivitelino de vectores lentivirales en ovocitos fertilizados descritos aquí dio lugar a la producción de embriones transgénicos que rindió más del 70% de los embriones transgénicos en relación con el número total de embriones colectados. Este resultado es consistente con informes anteriores y ejemplifica la especificidad del procedimiento^{2,7,10,11,12<.......}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
PMSG 50UI	Sigma	G4527
hCG 5000UI	Sigma	CG5-1VL
NaCl	Sigma	7982
100 mm placa de Petri	Dutsher	353003
4 pocillos Plato Nunc	Dutsher	56469	Plato de FIV
M2 medio	Sigma	M7167
M16 medio	Sigma	M7292
0,22 y micro; m Filtro de jeringa	Dutsher	146611
Enzima hialuronidasa 30mg	Sigma	H4272	embrión de ratón probado
Serynge de insulina	VWR	613-3867	Terumo Myjector
Pinzas curvas	Moria	2183
Tijeras curvas	Moria	MC26
Conjuntos de tubos de aspiración para pipetas microcapilares calibradas	Sigma	A5177-5EA
Capilares de vidrio de borosilicato Aparato	Harvard	GC 100-10
Extractor de micropipetas horizontal	Narishige	PN-30
Microforge	Narishige	MF-900
Microscopio invertido	Nikon	Transferman NK2 5188	Hoffman modulación iluminación de contraste
Micromanipulador	Eppendorf	Celltram aire
Controlador de pipeta de retención	Eppendorf	Femtojet
Aceite mineral	Sigma	M8410	embrión de ratón probado
Microinyector	Eppendorf	Femtojet	Se puede utilizar para inyectar ADN o vectores virales
Pinza Dumont # 5	Moria	MC 40
vannas micro tijeras	Moria	9600
Isoflurano	centravet	ISO005	ISO-VET 100% 250ml
ocrygel	centravet	OCR002
Povidone iodure	centravet	VET001	vetedine 120ml
Buprenorfina	centravet	BUP002	Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HCl	Sigma	T5941	Clorhidrato de Trizma
EDTA	Sigma	E9884
SDS	Sigma	436143
NaCl	Sigma	S7653	proteinasa en polvo
K	Sigma	P2308
oneTaq kit	NEB	M0480L
Primers	Eurogentec
Tira de 8 tubo de PCR	4titude	4ti-0781
termociclador de 96 pocillos	Applied Biosystems	4375786	Veriti Genomic
DNA mini kit	invitrogen	K1820-02
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000C
qPCR Master mix	Roche	4887352001	SYBR Green
Placa multipocillo 384	Roche	5217555001
instrumento qPCR 384 pocillo	Roche	5015243001	LightCycler 480