Artículo de método

Sola célula Multiplex transcripción reversa reacción en cadena polimerasa después de Patch-clamp

DOI:

10.3791/57627

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20 de junio de 2018

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1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine - Institut de Biologie Paris Seine (NPS - IBPS), Sorbonne Université

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe los pasos críticos y precauciones necesarias para realizar la célula multiplex transcripción reversa reacción en cadena polimerasa después de patch-clamp. Esta técnica es un método simple y eficaz para analizar el perfil de expresión de un conjunto predeterminado de genes de una sola célula caracterizada por grabaciones de patch-clamp.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La corteza cerebral está compuesta por numerosos tipos celulares exhibe varias características morfológicas, fisiológicas y moleculares. Esta diversidad dificulta la identificación y caracterización de estos tipos de celulares, requisitos previos para el estudio de sus funciones específicas. Este artículo describe el protocolo de reacción en cadena (RT-PCR) multiplex unicelular transcripción reversa polimerasa, que permite, después de patch-clamp en rebanadas, para detectar simultáneamente la expresión de decenas de genes en una sola celda. Este sencillo método puede aplicarse con caracterización morfológica y es ampliamente aplicable para determinar los rasgos fenotípicos del diversos tipos celulares y su entorno celular particular, como en las proximidades de los vasos sanguíneos. El principio de este protocolo es para registrar un celular con la técnica de patch-clamp, cosecha e invertir transcribir su contenido citoplásmico, y para detectar cualitativamente la expresión de un conjunto predefinido de genes por multiplex PCR. Requiere un diseño cuidadoso de la abrazadera del remiendo intracelular solución compatible con RT-PCR y primers PCR. Para asegurar una transcripción selectiva y confiable detección, esta técnica también requiere controles apropiados de citoplasma cosechar a pasos de amplificación. Aunque aquí debe ser estrictamente precauciones, prácticamente cualquier laboratorio electrofisiológico puede usar el múltiplex célula técnica de RT-PCR.

Introducción

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La corteza cerebral comprende numerosos tipos de células intervienen en diversos procesos fisiológicos. Su identificación y caracterización, un requisito previo para la comprensión de sus funciones específicas, pueden ser muy difíciles dada la gran diversidad morfológica, fisiológica y molecular que caracteriza los tipos de células corticales1 ,2,3,4.

Sola célula multiplex RT-PCR se basa en la combinación de técnicas de RT-PCR y abrazadera del remiendo. Puede probar al mismo tiempo la expresión de más de 30 genes predefinidos en células electrophysiologically identificados5. La inclusión de un trazador neuronal en la pipeta de grabación adicional permite la caracterización morfológica de las células registradas después de la revelación histoquímicas6,7,8,9, 10. es una técnica muy útil para la clasificación de tipos neuronales basados en análisis multivariado de sus rasgos fenotípicos5,9,10,11,12 ,13,14. Sola celda multiplex RT-PCR también se adapta a la caracterización de células no-neuronales tales como astrocytes15,16,17y puede aplicarse prácticamente a cada cerebro estructura18, 19,20,21,22,23 y célula tipo, asumiendo que pueden grabarse en configuración de celulares.

Esta técnica es muy conveniente para la identificación de fuentes celulares y/o objetivos de transmisión sistemas7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, especialmente cuando carecen de anticuerpos específicos. Se basa en grabaciones de patch-clamp de células identificados visualmente29y así también permite la segmentación de células en un entorno específico celular8,15,16. Además desde la Citoarquitectura del tejido de cerebro se conserva en rebanadas de cerebro, este enfoque también permite el estudio de las relaciones anatómicas de las células caracterizadas con elementos neuronales y no neuronales7,8 , 18.

Ya que esta técnica es limitada por la cantidad de citoplasma cosechada y por la eficacia de la RT, la detección de mRNA expresado en número de copias bajo puede ser difícil. Aunque otros enfoques basados en la tecnología RNaseq permiten analizar el transcriptoma conjunto de células3,4,30,31, que no necesariamente necesitan caros secuenciadores de alto rendimiento disponible en cada laboratorio. Puesto que la técnica de RT-PCR multiplex de unicelular utiliza PCR de punto final, sólo requiere termocicladores ampliamente disponibles. Puede desarrollarse fácilmente en laboratorios equipados con configuraciones electrofisiológicos y no requiere de equipo costoso. Puede proporcionar, dentro de un día, un análisis cualitativo de la expresión de un conjunto predefinido de genes. Por lo tanto, este enfoque ofrece un fácil acceso a la caracterización molecular de las células de una manera rápida.

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Protocolo

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Todos los procedimientos experimentales con animales se realiza en estricta conformidad con la normativa francesa (Código Rural R214/87 a R214/130) y ajustados a las normas éticas de la comunitarias (86/609/CEE) y la carta nacional de francés sobre la ética de experimentación animal. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de ética de Charles Darwin y enviados al Ministerio francés de educación e investigación (aprobación 2015 061011367540). El Animalario IBPS es acreditado por las autoridades francesas (A75-05-24).

1. Consideraciones preliminares

Nota: Para evitar contaminaciones, se ajustan a las siguientes recomendaciones antes de célula única empresa RT-PCR después de patch-clamp.

  1. No utilizar plásmidos que contienen genes de interés en el laboratorio ya que son una fuente potencial de contaminación.
  2. Reservamos una mesa de laboratorio de la habitación de electroforesis de gel para preparar PCRs.
  3. Dedicar una serie de pipetas y puntas de filtro resistentes de aerosol para manipular el ADN y el ARN en concentraciones inferiores a 1 ng/μl. Nunca use estos para analizar productos de PCR.
  4. Siempre usar productos libres de RNasa y DNasa y guantes.
  5. Utilizar productos químicos dedicados para la preparación de soluciones de parche-abrazadera interna. Nunca use una espátula pero pesa bastante papel para pesar polvos.
  6. Utilizar un electrodo de pH dedicado y soluciones estándar de pH, como pueden ser una fuente de contaminación (por ejemplo, RNasa).
  7. Capillares de vidrio de borosilicato de tienda; 20 μl largo, fino y flexible puntas; una micropipeta de 20 μl; una torta hecha en casa (patch-clamp pipeta soporte conectado a una jeringa de 10 mL); Tubos de PCR de 500 μl; 10 μl puntas de filtro resistentes de aerosol; y finas marcadores permanentes en una caja dedicada (figura 1).

2. primer diseño

Nota: Multiplex RT-PCR se basa en dos pasos de amplificación. Durante la primera PCR, todos los genes de interés son amplificados conjuntamente por mezclando todos los primers PCR. Para detectar confiablemente las transcripciones de las células, es esencial para el diseño de primers PCR selectivas y eficientes. El uso de cartillas (internos) anidados para las segunda rondas de PCR mejora la especificidad y la eficacia de la amplificación.

  1. Recuperar el comisariado secuencias de mRNA de los genes de interés en la base de datos de secuencia de NCBI referencia32 como los de su familia (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/).
    1. Escriba el nombre de los genes y las especies de interés como una consulta y haga clic en la secuencia relevante obtenida.
    2. Para restringir el análisis a la secuencia de codificación de los genes, haga clic en Enviar a (esquina superior derecha) y seleccione codificación secuencias y FASTA nucleótido como formato. Luego haga clic en Crear archivo y guarde la secuencia FASTA utilizando una extensión de archivo ".nt".
  2. Utilice guacamayo software33 (construcción de alineación múltiple y Banco de trabajo de análisis) o cualquier otro software de alineación múltiple para determinar las regiones de homología.
    1. Haga clic en archivo de | Nuevo proyecto... y seleccione el ADN como el tipo de secuencia. Para importar las secuencias de genes, seleccione secuencia | Secuencia de importación... y cargar un archivo de ".nt". Repita el procedimiento para todas las secuencias relacionadas.
    2. Haga clic y arrastre todas las secuencias en la ventana de esquema para seleccionar las secuencias de todas.
    3. Las regiones de homología de búsqueda seleccionando alineación | Búsqueda de bloques... (CTRL + S). Seleccione el par de segmentos se superponen en el Método de búsqueda. Ajustar la Pairwise puntuación corte a un valor relativamente alto (p. ej., 1.000) y el seqs. de minutos por bloque para el número total de secuencias a alinear y haga clic en iniciar.
    4. En la ventana Resultados de búsqueda que aparece, seleccionar los resultados con la máxima puntuación de MP y haga clic en el enlace. Si no se encuentra ningún resultado, disminuir la Pairwise puntuación límite o seqs. minutos por bloque.
    5. Para facilitar la visualización de regiones homólogas, seleccione alineación | Malla sombreadora | Significa puntaje.
    6. Seleccionar piezas disociadas de las secuencias y repetir los pasos 2.2.3–2.2.4 para determinar potencialmente otras regiones de homología con una MP-puntuación más baja.
    7. Para obtener las cartillas más específicas, seleccione las regiones de la homología de secuencia por lo menos.
  3. Obtener las secuencias de todas las variantes del empalme y repita los pasos 2.2.1–2.2.6. Seleccione su región común para una detección general. Considerar alternativas cassettes para dedicado empalme variantes análisis20,34,35,36.
  4. Alinear las secuencias de mRNA en el genoma de modelo animal con genomas de37 BLAST (Basic Local búsqueda herramienta de alineación) para determinar la estructura intrón-exón de los genes (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
    1. Seleccione el genoma de ratón explosión haciendo clic en el ratón y sube la secuencia FASTA obtenida en la sección de Entrar en secuencia de consulta . En la Selección del programa, seleccione optimizar para secuencias altamente similares (megablast)y, a continuación, haga clic en el botón de ráfaga .
    2. En la sección de Descripción , seleccione la alineación con la identidad más alta (100%). Asegúrese de que corresponde al gen de interés como se indica en las características de la sección alineación .
    3. Ordenar la alineación por consulta posición de arranque en la misma sección para obtener la sucesión de los exones de la secuencia de codificación. Tenga en cuenta las posiciones inicial y final de todos los golpes que corresponden aproximadamente a la posición de los intrones en la secuencia de consulta (figura 2A).
  5. Seleccione dos exones diferentes para los cebadores sentido y antisentido para diferenciarse fácilmente cDNA genomic amplificación de ADN (gDNA) basada en un criterio de tamaño (figura 2).
    Nota: La amplificación del gDNA puede ocurrir en una frecuencia baja cuando se cosecha el núcleo con el citoplasma. Por lo tanto, es fundamental diseñar intrón overspanning pares de cartilla (figura 2A). En el caso menos intrón de genes, la colección del núcleo es problemática como puede llevar a la confusión potencialmente resultados. Para tratar este tema, incluyen un conjunto de iniciadores para amplificar una secuencia intronic a punta de prueba para la presencia del gDNA25. Si el control genómico es positivo, los resultados de todos los genes del intrón menos deben ser desechados.
  6. Para lograr una eficiente amplificación, seleccione cartillas generar amplicones con una longitud ideal comprendida entre 200 y 400 pares de bases (figura 2).
  7. Para amplificar simultáneamente varios cDNAs durante el paso de la polimerización en cadena múltiplex, diseño de primers con una longitud de entre 18 y 24 nucleótidos y una temperatura de fusión (Tm) entre 55 y 60 ° C.
  8. Para minimizar la formación de estructuras secundarias, que reducen el rendimiento de la amplificación, seleccione sentido y anti-sentido cartillas con horquilla mínima y longitudes de dos caras (figura 2B).
  9. Diseño de primers internos utilizando los mismos criterios (pasos 2.5-2.8).
  10. Verificar la especificidad de los iniciadores de la polimerización en cadena alineando los iniciadores en la base de secuencia de ARN de referencia del organismo de interés utilizando un nucleótido BLAST.
    1. En BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), haga clic en nucleótido BLAST. Pegue la secuencia de una cartilla en la Secuencia de consulta entrar.
    2. En la sección Elegir conjunto de búsqueda , haga clic en otros (nr, etc.), seleccionar secuencias de ARN de referencia (refseq_rna) en la opción de base de datos y especificar el organismo (p. ej., Mus musculus (taxid:10090) ) para restringir el análisis a la especie deseada.
    3. En la Selección del programa seleccione optimizar para secuencias algo similares (blastn). En la sección de parámetros de algoritmo reduce el tamaño de palabra hasta 7 para aumentar la posibilidad de obtener éxitos.
  11. Para el diseño de primers selectivas, mantener sólo aquellos cuya secuencia tiene al menos 3 desajustes con cDNAs indeseada cuando sea posible.
  12. Solicitar cartillas desaladas en una concentración relativamente alta (por ejemplo, 200 μm) para asegurarse de que los iniciadores externos se pueden mezclar juntos en una concentración final de 1 μm.

3. preparación de los reactivos de RT

  1. 5 x RT-mix: preparar en agua libre de ARNasa 400 μL de la solución de mezcla RT (x 5) con cebadores aleatorios a 25 μm y dNTPs 2,5 mm. Guarde esta mezcla trabajo como 20 alícuotas μL en tubos μl 500.
  2. 20 x Dithiothreitol (DTT): preparar 1 mL de 0,2 M TDT en libre de Rnasa agua y guárdelo como alícuotas μl 50.
  3. Almacenar 2.500 U de inhibidor de la Rnasa (40 U/μL) y 10.000 U de transcriptasa reversa (RTase, 200 U/μL) con 5 alícuotas μl.
  4. Para asegurar una óptima calidad de los reactivos de RT, almacenar las alícuotas a-80 ° C. Utilizarlos para hasta 10 células y sólo por un día.

4. PCR validación

  1. Preparar cDNAs haciendo una transcripción inversa en una cantidad relativamente grande de ARN (típicamente 1 μg) extraído total38 de la estructura de interés.
    1. No utilice las pipetas dedicadas a sola célula RT-PCR para estos pasos preliminares, pero usar las pipetas libres de Rnasa. Diluir el ARN total hasta 1 μg/μl.
    2. En tubo 500 μl PCR, añadir 1 μl de RNA total diluido y 8 μl de agua libre de ARNasa. Desnaturalizar a 95 ° C por 1 min y enfriar el tubo en hielo.
    3. Añadir 4 μL de la RT 5 x buffer suministrado por el fabricante, 4 μL de solución de mezcla RT, 1 μl de RTase, 1 μl de inhibidor de la Rnasa y 1 μl de 200 mM TDT (ver sección 3).
    4. Película el tubo, girar e incubar durante una noche a 37 ° C.
    5. Almacenar los cDNAs a-80 ° C por hasta varios años. Preparar una alícuota de cDNAs diluido a 1 ng/μl de equivalentes de ARN total.
  2. Mezclar y diluir cada par de cartilla en 1 μm con pipetas dedicadas a unicelular RT-PCR. Utilice 20 μl de cada mezcla de cartilla para 100 μl PCRs.
  3. En el hielo, preparar para cada par de primer una premezcla que contiene: agua (c.s.p., 80 μL), 10 μl de 10 X 0,5 μl (2.5 U, 5 U/μL) de Taq polimerasa, tampón y 1 μl de 100 x dNTPs (50 μm cada uno), 500-1.000 pg del cDNA diluidos en 1 ng/μl.
  4. Utilizar tubos PCR que se ajustan bien los pozos de la máquina de la polimerización en cadena para un control óptimo de temperatura. Añadir 2 gotas (~ 100 μL) de aceite mineral a la mezcla preparada de antemano sin tocar la pared o la tapa del tubo PCR.
  5. Para minimizar la formación de dímeros de primer, realizar un arranque en caliente mediante la colocación de los tubos PCR en termociclador precalentado a 95 ° C. Después de 30 s, expulsar rápidamente a 20 μl de la mezcla de imprimación sobre el aceite.
  6. Después de 3 min a 95 ° C, correr 40 ciclos (95 ° C, 30 s; 60 ° C, 30 s, 72 ° C, 35 s) seguido por un paso de elongación final a 72 ° C durante 5 minutos.
  7. Analizar 10 μl de cada producto PCR mediante gel de agarosa electroforesis (2%, peso/volumen)39. Si algunos productos de la PCR no tiene el tamaño esperado rediseño otras imprimaciones (ver sección 2).
    PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es un intercalante químico que puede inducir mutaciones de la DNA. Consulte la oficina local de seguridad antes de usar. Siempre utilice guantes al manipularlo. Utilice una solución comercialmente disponible de solución (10 mg/mL) el bromuro de etidio en lugar de polvo para minimizar el riesgo de inhalación. Del mismo modo, la luz UV puede ser perjudicial, así que asegúrese de llevar gafas de seguridad de protección de rayos UV o una mascarilla. Retirar suciedad geles, consejos, guantes y buffer en contenedores de basura de etidio.
  8. Una vez que todos los pares de cartilla han sido validados individualmente, probar el protocolo multiplex (figura 3).
    1. Mezclar y diluir cebadores externos todos juntos en 1 μm. Almacene las primers multiplexores mezclan a-20 ° C por hasta varias semanas.
    2. En el hielo, preparar una premezcla que contiene: agua (c.s.p., 80 μL), 10 μl de 10 X buffer, 1 μl de 100 x dNTPs (50 μm de cada uno), 500-1.000 pg de cDNAs diluido en 1 ng/μl y 0,5 μl (2.5 U, 5 U/μL) de Taq polimerasa.
    3. Quitar el tubo PCR, girar y añadir dos gotas (~ 100 μL) de aceite mineral.
    4. Realizar un arranque en caliente como se describe en el paso 4.5 con 20 μl de la mezcla del primer múltiplex. Después de 3 min a 95 ° C, 20 PCR ciclos idénticos a los de paso 4.6.
    5. Preparar una serie de tubos PCR idénticos al número de genes para analizar. Preparar una mezcla preparada de antemano como en paso 4.8.2, pero usando 1 μl del producto PCR primer por gene como plantilla. Ajuste todos los volúmenes según el número de genes para analizar y considerar el uso de 10% de volumen adicional para compensar los errores de pipeteo.
    6. Agite suavemente, girar el tubo, enviar 80 μl de la mezcla preparada de antemano en cada tubo PCR y añadir dos gotas (~ 100 μL) de aceite mineral por el tubo sin tocar la pared o la tapa de los tubos.
    7. Realizar un hot start (consulte el paso 4.5) por expulsión 20 μl de mezcla interna cartilla preparada en el paso 4.2. Correr 35 ciclos PCR idéntico al paso 4.6.
    8. Analizar el segundo productos PCR por electroforesis en gel de agarosa. Asegúrese de que cada segundo PCR genera un amplicón del tamaño esperado. En caso de amplificaciones ineficientes o no específicos, volver a diseñar nuevos cebadores (pasos 2.5 – 2.12) y validarlos (pasos 4,2 – 4,8).

5. elaboración y validación de la solución intracelular de Patch-clamp

Nota: El siguiente protocolo describe la preparación y validación de un /gluconate K+base solución interna, pero puede utilizarse prácticamente cualquier tipo de solución de patch-clamp como no obstaculizan la eficacia de la RT-PCR. Uso de guantes es obligatorio para obtener una solución interna libre de Rnasa.

  1. Para 60 mL de solución de grabación interna abrazadera del remiendo, preparar espontáneamente 10 mL de 0,1 M de KOH.
  2. Disolver 11,4 mg de EGTA (0,5 mM final) en 0,9 mL de 0,1 M de KOH.
  3. Añadir 40 mL libre de Rnasa de agua y disolver 2,02 g de K-gluconato (144 mM final), 143 mg de HEPES 10 mM (final) y 180 μl de 1 M de MgCl2 (3 mM final).
  4. Ajustar el pH a 7.2 Añadir ~ 6 mL de 0,1 M de KOH.
  5. Ajuste de la osmolaridad a 295 mOsm ~ 13 ml de agua libre de ARNasa.
  6. Puesto que la solución interna también se utiliza como almacenador intermediario para la transcripción inversa, controlar concentración de Mg2 + . Compensar una menor Mg2 + concentración en la solución interna mediante la adición de MgCl2 luego para alcanzar una concentración final de 2 mM en la reacción de RT.
  7. Para etiquetar las células cosechadas después de patch-clamp de grabación, añadir de 2 a 5 mg/mL de biocitina libre de Rnasa a la solución interna descrita anteriormente (pasos 5.1 – 5.5).
  8. La solución interna del filtro (tamaño de poro de 0,22 μm) y almacenar a-80 ° C alícuotas de como 100 – 250 μl.
  9. Para validar el uso de la solución interna para RT-PCR unicelular, Añadir 0,5 μl de ARN total diluido en 1 ng/μl a 6 μl de solución de patch-clamp y dejarlo en el Banco durante unos 30 minutos.
  10. Con una micropipeta de 2 μl, añadir 2 μl de 5 x RT-mix, 0.5 μl de DDT de 20 x, inhibidor de Rnasa de 0.5 μl y 0,5 μl RTase e incubar toda la noche a 37 ° C.
  11. Girar el tubo. En el hielo añadir agua (c.s.p., 80 μL), 10 μl de 10 X buffer y 0,5 μl (2.5 U, 5 U/μL) de Taq polimerasa.
  12. Realizar 40 ciclos de PCR utilizando un conjunto de cartillas validados (pasos 4.4-4.6).
  13. Analizar los productos PCR por electroforesis en gel de agarosa (ver paso 4.7) y verificar que tengan el tamaño esperado.
    Nota: Omitir el 0,5 μl de RNA total y reemplazarlo con 0,5 μl de agua libre de ARNasa se asegurará de que la solución interna está libre de contaminaciones de RNA o DNA.

6. agudo rodaja preparación

Nota: Este protocolo describe el procedimiento de corte para menores (es decir, menos de 28 días postparto) ratones masculinos y femeninos. Otras soluciones de corte, como la basada en sacarosa de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) también son utilizables40.

  1. Preparar 2 L de la aCSF que contiene (en mM) 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 glucosa y sacarosa 15. Para reducir la actividad glutamatérgica en rodaja preparación, preparar una solución de corte mediante la adición de 1 mM de ácido quinurénico.
  2. Antes de cortar, preparar un kit de disección con tijeras quirúrgicas, tijeras iris fino, dos espátulas, fórceps, un disco de papel filtro y el pegamento del cianocrilato.
  3. Corte helado solución saturada de O2/CO2 (95% / 5%) y enfriamiento de la cámara de la corte a-20 ° C.
  4. Anestesiar el ratón con una toalla de papel pequeña empapada con isoflurano. Después de 2 min, asegúrese de que el ratón está bajo anestesia profunda mediante la verificación de la ausencia de respuesta a la pizca de la pata.
  5. Rápidamente decapitar el ratón. Quitar el cuero cabelludo y abrir el cráneo. Extraer el cerebro cuidadosamente y coloque en un vaso de precipitados pequeño llenado de hielo frío (~ 4 ° C) solución de corte oxigenada con O2/CO2.
  6. Extraiga la cámara de corte de-20 ° C condiciones y eliminar la humedad con una toalla de papel.
  7. Disecar cuidadosamente el cerebro para aislar la región de interés, pegamento en la cámara de corte y corte helada solución oxigenada con O2/CO2.
  8. Corte rebanadas gruesas de 300 μm con un vibratome. Transferencia a temperatura ambiente en una cámara de descansa llenada de solución del corte oxigenada y permitirles recuperar durante al menos 0,5 h.

7. célula RT-PCR después de la grabación de Patch-clamp

  1. Limpiar el sistema de perfusión con ~ 100 mL de solución de 30% H2O2 y enjuague con ~ 500 mL de agua destilada para evitar el crecimiento de las bacterias, ya que es una fuente pasada por alto de contaminación de Rnasa.
  2. Cloro el filamento con una pipeta de parche llenada de blanqueador concentrado cada día de recolección. No utilice una micropipeta para llenar la pipeta de parche sino más bien una 20 μl largo, fino, flexible punta conectada a una jeringa de 1 mL. Luego, enjuague exhaustivamente con agua libre de ARNasa y séquela con un paño de gas.
  3. Preparar una pequeña caja de hielo que contiene 5 x RT-mix y 20 alícuotas de x DTT. Almacenar las alícuotas inhibidor RTase y Rnasa a-20 ° C en un enfriador de sobremesa.
  4. Transferencia de un segmento en la cámara de grabación de perfusión a 1-2 mL/min con oxigenada aCSF.
  5. Tirar pipetas de patch (1-2 μm abrir diámetro de la punta, 3 – 5 MΩ) de vidrio borosilicato usando guantes y uno de ellos se llenan de 8 μL de la solución interna. Tenga en cuenta que los mandos del tirador pipeta son una fuente de contaminación de Rnasa.
  6. Coloque la pipeta en el soporte de pipeta nuevo guantes y no tocar el filamento con los dedos.
  7. Acercarse a la pipeta del parche con una presión positiva y realizar el registro de celulares para caracterizar la célula específica (figura 4).
  8. Con el fin de preservar los mRNAs, limitar el tiempo en configuración de celulares a 20 min41.
  9. Al final de la grabación, preparar un tubo PCR de 500 μl con 2 μl de 5 x RT mezcla 0,5 μl de 20 x DTT, girar y almacenar en hielo.
  10. El citoplasma de la célula de la cosecha aplicando una suave presión negativa (figura 4). Visual control que contenido de la celda viene dentro de la pipeta manteniendo un sello hermético.
    1. Evitar tanto como sea posible recoger el núcleo si se consideran algunos genes del intrón-menos. En tal caso siempre incluyen un conjunto de iniciadores para amplificar gDNA sondeo genómico de contaminación.
    2. Si el núcleo está saliendo cerca de la punta de la pipeta, suelte la presión negativa y mueva la pipeta lejos del núcleo. Asegurarse que el sello hermético y reinicie para recoger el citoplasma en la nueva ubicación de la pipeta.
  11. Parar la recolección viniendo no más material o antes de perder el sello hermético.
  12. Retirar la pipeta suavemente para formar un parche fuera de salida para limitar la contaminación por los desechos extracelular (figura 4) y para favorecer el cierre de la membrana celular para posterior análisis histoquímico.
  13. Tenga en cuenta las perillas, micromanipuladores, teclado o ratón de la computadora son las fuentes potenciales de contaminación de Rnasa. Si se han tocado durante la grabación, cambiar de guantes.
  14. Coloque la pipeta en el expeller y vierta su contenido en el tubo PCR aplicando una presión positiva (figura 1).
  15. Romper la punta de la pipeta en el tubo PCR a la colección de su contenido.
  16. Brevemente el tubo de centrífuga, agregar 0.5 μl de inhibidor de la Rnasa y 0,5 μl de RTase, mezclar suavemente, centrifugar nuevamente e incubar durante una noche a 37 ° C.
  17. Girar el tubo y guardarlo a-80 ° C por hasta varios meses, hasta el análisis de PCR.
  18. Realizar el primer paso de amplificación directamente en el tubo que contiene el ~ 10 μl de los productos de la RT añadiendo agua (c.s.p., 80 μL), 10 μl de tampón de x 10 y (2.5 U) de 0,5 μl de Taq polimerasa. A continuación, siga las indicaciones descritas en pasos 4.8.2–4.8.8.

8. coloración histoquímica de la célula registrada (opcional)

  1. Tras las grabaciones electrofisiológicas, mantener la rodaja por 20 min en aCSF oxigenada para permitir la difusión de la biocitina en el árbol dendrítico y axonal.
  2. Coloque la rebanada en un pozo de una placa de 24 pocillos y fix noche a 4 ° C con 1 mL de paraformaldehído al 4% en 0.1 M tampón fosfato.
  3. Lavar las rodajas de 4 veces, 5 minutos cada uno, con 1 mL de tampón fosfato salino (PBS).
  4. En el mismo, permeabilizar y saturar la rebanada durante 1 h a temperatura ambiente con 1 mL de PBS suplementado con 0.25% Tritón X-100 y 0.2% de gelatina de piel de pescado de agua fría (PBS-GT).
  5. Incubar durante una noche con una fluorescencia etiquetada avidina diluido en 1/400 en 250-500 μl de PBS-GT.
  6. Lavar 5 veces, 5 minutos cada uno, con 1 mL de PBS y Monte las rebanadas.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un representante de validación multiplex RT-PCR se muestra en la figura 3. El protocolo fue diseñado para probar simultáneamente la expresión de genes diferentes 12. El vGluT1 del transportador de glutamato vesicular fue tomada como control positivo para glutamatérgica neuronas42. El GABA síntesis de enzimas (GAD65 y GAD 67), el neuropéptido Y (NPY) y la somatostatina (SOM) fueron utilizados como marcadores de GABAérgico interneuronas<...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sola célula multiplex RT-PCR después de patch-clamp puede probar confiablemente y simultáneamente la expresión de más de 30 genes en células electrophysiologically identificados5. Análisis de expresión génica a nivel unicelular requiere iniciadores PCR altamente eficientes. Uno de los pasos más limitantes es la colección de contenido de la celda. Su eficiencia depende del diámetro de la punta de la pipeta de parche, que debe ser tan grande como sea posible mientras que el tamaño de celda. Pipetas ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos al Dr. Alexandre Mourot sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por becas de la Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 01 003; ANR-15-CE16-0010 y ANR-17-CE37-0010-03), BLG es apoyado por becas de la Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Agradecemos la facilidad animal de los IBPS (París, Francia).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
MACAW v.2.0.5NCBIAlineación múltiple para el diseño de imprimación
DithiothreitolVWR443852ART
Imprimadores aleatoriosSigma-Aldrich (Merck)11034731001RT
dNTPsGE Healthcare Life Sciences28-4065-52RT y PCR
RNasin Inhibidores de la ribonucleasaPromegaN2511RT
SuperScript II Transcriptasa inversaInvitrogen18064014RT
Taq ADN polimerasaQiagen201205PCR
Aceite mineralSigma-Aldrich (Merck)M5904-5MLPCR
Imprimaciones PCRSigma-Aldrich (Merck)PCR / desalado y diluido a 200 µ Tubos M
, 0,5 mL, tapa planaThermoFisher ScientificAB0350RT y PCR
Serie BT10 - 10 µ L Punta de filtroNeptune ScientificBT10RT y PCR
BT20 Series - 20 µ L Punta de filtroNeptune ScientificBT20RT y PCR
Serie BT200 - 200 µ L Punta de filtroNeptune ScientificBT200RT y PCR
Serie BT1000 - 1000 y micro; L Punta de filtroNeptune ScientificBT1000.96RT y PCR
DNA Thermal CylcerPerkin Elmer CetusPCR
Bromuro de etidioSigma-Aldrich (Merck)E1510-10MLElectroforesis en gel de agarosa
Tampón Tris-Borato-EDTASigma-Aldrich (Merck)T4415-1LElectroforesis en gel de agarosa
UltraPure AgaroseLife Technologies16500-500Electroforesis en gel de agarosa
y Phi; X174 DNA-Hae III DigestNEB (New England BioLabs)N3026SElectroforesis en gel de agarosa
EDA 290KodakElectroforesis en gel de agarosa
Electroforesis Fuente de alimentación EPS 3500Pharmacia BiotechElectroforesis en gel de agarosa
Midi Elecrophoresis horizontal Modelo de unidad SHU13Sigma-Aldrich (Merck)Electroforesis
en gel de agarosaPapel liso con aspecto satinadoFisherbrand1748BSolución interna de pinza de parche
Hidróxido de potasioSigma-Aldrich (Merck)60377Solución interna de pinza de parche
Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacéticoSigma-Aldrich (Merck)E3889Solución interna de pinza de parche
HEPESSigma-Aldrich (Merck)H4034Solución interna de pinza de parche
D-gluconato de potasioSigma-Aldrich (Merck)G4500Solución interna
de pinza de parche Solución de cloruro de magnesioSigma-Aldrich (Merck)M1028Solución interna de abrazadera de parche
5500 Osmómetro de presión de vaporWescorSolución interna de abrazadera de parche
BiocytinSigma-Aldrich (Merck)B4261Solución interna de pinza de parche
SacarosaSigma-Aldrich (Merck)S5016Preparación de lonchas
D-(+)-Glucosa monohidratoSigma-Aldrich (Merck)49159Preparación de lonchas
Cloruro de sodioSigma-Aldrich (Merck)S6191Preparación de lonchas
Cloruro de potasioSigma-Aldrich (Merck)60128Preparación de lonchas
Bicarbonato de sodioSigma-Aldrich (Merck)31437-MPreparación de lonchas
Fosfato de sodio monobásicoSigma-Aldrich (Merck)S5011Preparación de lonchas
Solución de cloruro de magnesioSigma-Aldrich (Merck)63069Preparación de lonchas
Solución de cloruro de calcioSigma-Aldrich (Merck)21115Preparación
Ácido quinurénicoSigma-Aldrich (Merck)K3375Preparación de lonchas
IsofluranoPiramal Healthcare UKPreparación de lonchas
VT 1000SLeica Biosystems14047235613Preparación de lonchas
Solución de peróxido de hidrógenoSigma-Aldrich (Merck)H1009Limpieza de la configuración de la abrazadera de parche
Capilares de vidrio de pared delgada con filamentoWorld Precision InstrumentsTW150F-4Abrazadera de parche
PP-83NarishigeAbrazadera de parche
Microcargador Eppendorf5242956003Abrazadera de parche
BX51WI Microscopio verticalOlympusPinza de parche
XC-ST70/CE CCD B/N Cámara de vídeoSonyPatch Clamp
Axopatch 200B AmplificadorMolecular DevicesPinza de parche
Digidata 1440Molecular DevicesPinza de parche
pCLAMP 10 paquete de softwareMolecular DevicesPinza
parche de 10 ml jeringaTerumoSS-10ESExpulsión
Serie E con Cuerpo Recto (Soporte)Phymep64-0997Expulsión de
fosfato de sodio dibásicoSigma-Aldrich (Merck)S7907Revelación histoquímica
Fosfato de sodio monobásicoSigma-Aldrich (Merck)S8282Revelación histoquímica
ParaformaldehídoSigma-Aldrich (Merck)P6148Revelación histoquímica
Tritón X-100Sigma-Aldrich (Merck)X100Revelación histoquímica
Gelatina de pielde pescado de agua fríaSigma-Aldrich (Merck)G7041Revelación histoquímica
Estreptavidina, Alexa Conjugado con flúor 488ThermoFisher ScientificS11223Revelación histoquímica
Placa de 24 pocillosGreiner Bio-One662160Revelación histoquímica
de lonchas de

Referencias

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