Este protocolo describe los pasos críticos y precauciones necesarias para realizar la célula multiplex transcripción reversa reacción en cadena polimerasa después de patch-clamp. Esta técnica es un método simple y eficaz para analizar el perfil de expresión de un conjunto predeterminado de genes de una sola célula caracterizada por grabaciones de patch-clamp.
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Artículo de método
Sola célula Multiplex transcripción reversa reacción en cadena polimerasa después de Patch-clamp
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La corteza cerebral está compuesta por numerosos tipos celulares exhibe varias características morfológicas, fisiológicas y moleculares. Esta diversidad dificulta la identificación y caracterización de estos tipos de celulares, requisitos previos para el estudio de sus funciones específicas. Este artículo describe el protocolo de reacción en cadena (RT-PCR) multiplex unicelular transcripción reversa polimerasa, que permite, después de patch-clamp en rebanadas, para detectar simultáneamente la expresión de decenas de genes en una sola celda. Este sencillo método puede aplicarse con caracterización morfológica y es ampliamente aplicable para determinar los rasgos fenotípicos del diversos tipos celulares y su entorno celular particular, como en las proximidades de los vasos sanguíneos. El principio de este protocolo es para registrar un celular con la técnica de patch-clamp, cosecha e invertir transcribir su contenido citoplásmico, y para detectar cualitativamente la expresión de un conjunto predefinido de genes por multiplex PCR. Requiere un diseño cuidadoso de la abrazadera del remiendo intracelular solución compatible con RT-PCR y primers PCR. Para asegurar una transcripción selectiva y confiable detección, esta técnica también requiere controles apropiados de citoplasma cosechar a pasos de amplificación. Aunque aquí debe ser estrictamente precauciones, prácticamente cualquier laboratorio electrofisiológico puede usar el múltiplex célula técnica de RT-PCR.
Introducción
La corteza cerebral comprende numerosos tipos de células intervienen en diversos procesos fisiológicos. Su identificación y caracterización, un requisito previo para la comprensión de sus funciones específicas, pueden ser muy difíciles dada la gran diversidad morfológica, fisiológica y molecular que caracteriza los tipos de células corticales1 ,2,3,4.
Sola célula multiplex RT-PCR se basa en la combinación de técnicas de RT-PCR y abrazadera del remiendo. Puede probar al mismo tiempo la expresión de más de 30 genes....
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales con animales se realiza en estricta conformidad con la normativa francesa (Código Rural R214/87 a R214/130) y ajustados a las normas éticas de la comunitarias (86/609/CEE) y la carta nacional de francés sobre la ética de experimentación animal. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de ética de Charles Darwin y enviados al Ministerio francés de educación e investigación (aprobación 2015 061011367540). El Animalario IBPS es acreditado por las autoridades francesas (A75-05-24).
1. Consideraciones preliminares
Nota: Para evitar contaminaciones, se ajustan a las sigu....
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Resultados
Un representante de validación multiplex RT-PCR se muestra en la figura 3. El protocolo fue diseñado para probar simultáneamente la expresión de genes diferentes 12. El vGluT1 del transportador de glutamato vesicular fue tomada como control positivo para glutamatérgica neuronas42. El GABA síntesis de enzimas (GAD65 y GAD 67), el neuropéptido Y (NPY) y la somatostatina (SOM) fueron utilizados como marcadores de GABAérgico interneuronas<.......
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Discusión
Sola célula multiplex RT-PCR después de patch-clamp puede probar confiablemente y simultáneamente la expresión de más de 30 genes en células electrophysiologically identificados5. Análisis de expresión génica a nivel unicelular requiere iniciadores PCR altamente eficientes. Uno de los pasos más limitantes es la colección de contenido de la celda. Su eficiencia depende del diámetro de la punta de la pipeta de parche, que debe ser tan grande como sea posible mientras que el tamaño de celda. Pipetas .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Alexandre Mourot sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por becas de la Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 01 003; ANR-15-CE16-0010 y ANR-17-CE37-0010-03), BLG es apoyado por becas de la Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Agradecemos la facilidad animal de los IBPS (París, Francia).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| MACAW v.2.0.5 | NCBI | Alineación múltiple para el diseño de imprimación | |
| Dithiothreitol | VWR | 443852A | RT |
| Imprimadores aleatorios | Sigma-Aldrich (Merck) | 11034731001 | RT |
| dNTPs | GE Healthcare Life Sciences | 28-4065-52 | RT y PCR |
| RNasin Inhibidores de la ribonucleasa | Promega | N2511 | RT |
| SuperScript II Transcriptasa inversa | Invitrogen | 18064014 | RT |
| Taq ADN polimerasa | Qiagen | 201205 | PCR |
| Aceite mineral | Sigma-Aldrich (Merck) | M5904-5ML | PCR |
| Imprimaciones PCR | Sigma-Aldrich (Merck) | PCR / desalado y diluido a 200 µ Tubos M | |
| , 0,5 mL, tapa plana | ThermoFisher Scientific | AB0350 | RT y PCR |
| Serie BT10 - 10 µ L Punta de filtro | Neptune Scientific | BT10 | RT y PCR |
| BT20 Series - 20 µ L Punta de filtro | Neptune Scientific | BT20 | RT y PCR |
| Serie BT200 - 200 µ L Punta de filtro | Neptune Scientific | BT200 | RT y PCR |
| Serie BT1000 - 1000 y micro; L Punta de filtro | Neptune Scientific | BT1000.96 | RT y PCR |
| DNA Thermal Cylcer | Perkin Elmer Cetus | PCR | |
| Bromuro de etidio | Sigma-Aldrich (Merck) | E1510-10ML | Electroforesis en gel de agarosa |
| Tampón Tris-Borato-EDTA | Sigma-Aldrich (Merck) | T4415-1L | Electroforesis en gel de agarosa |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | Electroforesis en gel de agarosa |
| y Phi; X174 DNA-Hae III Digest | NEB (New England BioLabs) | N3026S | Electroforesis en gel de agarosa |
| EDA 290 | Kodak | Electroforesis en gel de agarosa | |
| Electroforesis Fuente de alimentación EPS 3500 | Pharmacia Biotech | Electroforesis en gel de agarosa | |
| Midi Elecrophoresis horizontal Modelo de unidad SHU13 | Sigma-Aldrich (Merck) | Electroforesis | |
| en gel de agarosaPapel liso con aspecto satinado | Fisherbrand | 1748B | Solución interna de pinza de parche |
| Hidróxido de potasio | Sigma-Aldrich (Merck) | 60377 | Solución interna de pinza de parche |
| Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético | Sigma-Aldrich (Merck) | E3889 | Solución interna de pinza de parche |
| HEPES | Sigma-Aldrich (Merck) | H4034 | Solución interna de pinza de parche |
| D-gluconato de potasio | Sigma-Aldrich (Merck) | G4500 | Solución interna |
| de pinza de parche Solución de cloruro de magnesio | Sigma-Aldrich (Merck) | M1028 | Solución interna de abrazadera de parche |
| 5500 Osmómetro de presión de vapor | Wescor | Solución interna de abrazadera de parche | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich (Merck) | B4261 | Solución interna de pinza de parche |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich (Merck) | S5016 | Preparación de lonchas |
| D-(+)-Glucosa monohidrato | Sigma-Aldrich (Merck) | 49159 | Preparación de lonchas |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich (Merck) | S6191 | Preparación de lonchas |
| Cloruro de potasio | Sigma-Aldrich (Merck) | 60128 | Preparación de lonchas |
| Bicarbonato de sodio | Sigma-Aldrich (Merck) | 31437-M | Preparación de lonchas |
| Fosfato de sodio monobásico | Sigma-Aldrich (Merck) | S5011 | Preparación de lonchas |
| Solución de cloruro de magnesio | Sigma-Aldrich (Merck) | 63069 | Preparación de lonchas |
| Solución de cloruro de calcio | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | Preparación |
| Ácido quinurénico | Sigma-Aldrich (Merck) | K3375 | Preparación de lonchas |
| Isoflurano | Piramal Healthcare UK | Preparación de lonchas | |
| VT 1000S | Leica Biosystems | 14047235613 | Preparación de lonchas |
| Solución de peróxido de hidrógeno | Sigma-Aldrich (Merck) | H1009 | Limpieza de la configuración de la abrazadera de parche |
| Capilares de vidrio de pared delgada con filamento | World Precision Instruments | TW150F-4 | Abrazadera de parche |
| PP-83 | Narishige | Abrazadera de parche | |
| Microcargador Eppendorf | 5242956003 | Abrazadera de parche | |
| BX51WI Microscopio vertical | Olympus | Pinza de parche | |
| XC-ST70/CE CCD B/N Cámara de vídeo | Sony | Patch Clamp | |
| Axopatch 200B Amplificador | Molecular Devices | Pinza de parche | |
| Digidata 1440 | Molecular Devices | Pinza de parche | |
| pCLAMP 10 paquete de software | Molecular Devices | Pinza | |
| parche de 10 ml jeringa | Terumo | SS-10ES | Expulsión |
| Serie E con Cuerpo Recto (Soporte) | Phymep | 64-0997 | Expulsión de |
| fosfato de sodio dibásico | Sigma-Aldrich (Merck) | S7907 | Revelación histoquímica |
| Fosfato de sodio monobásico | Sigma-Aldrich (Merck) | S8282 | Revelación histoquímica |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich (Merck) | P6148 | Revelación histoquímica |
| Tritón X-100 | Sigma-Aldrich (Merck) | X100 | Revelación histoquímica |
| Gelatina de piel | de pescado de agua fríaSigma-Aldrich (Merck) | G7041 | Revelación histoquímica |
| Estreptavidina, Alexa Conjugado con flúor 488 | ThermoFisher Scientific | S11223 | Revelación histoquímica |
| Placa de 24 pocillos | Greiner Bio-One | 662160 | Revelación histoquímica |
Referencias
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nat.Rev.Neurosci. 9 (7), 557-568 (2008).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the class....
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Reimpresiones y permisos
