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Artículo de método

Preparación electroquímica autónomo para enriquecer bacterias respirando de ánodo en el sitio

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DOI:

10.3791/57632

⸱

24 de julio de 2018

 ,  ,  , 
1International Center for Materials Nanoarchitectonics, National Institute for Materials Science, 2Department of Earth Sciences, University of Southern California, 3Department of Applied Chemistry, The University of Tokyo

En este artículo

Resumen

Técnicas de cultivo microbianas in situ del enriquecimiento o en situ pueden facilitar el aislamiento de difícil-a-cultura microbianos taxa, especialmente desde entornos de baja biomasa o geoquímicamente extremas. Aquí, describimos una configuración electroquímica sin utilizar una fuente de energía externa para enriquecer las cepas microbianas que son capaces de transporte de electrones extracelular (EET).

Resumen

Respiración anaerobia juntada con el transporte de electrones a los minerales insolubles (denominado transporte de electrones extracelular [OTA]) se cree que es crítico para la producción energética microbiana y persistencia en ambientes subterráneos, especialmente los carecer de aceptadores del electrón terminal soluble. Mientras que los microbios capaces de EET se han aislado con éxito de varios ambientes, la diversidad de bacterias capaces de EET es todavía mal entendida, especialmente en difícil-a-sample, baja energía o ambientes extremos, tales como muchos subsuperficial ecosistemas. Aquí, describimos un sistema electroquímico in situ para enriquecer bacterias EET capaz mediante un ánodo como aceptor terminal de electrones respiratorio. Este ánodo está conectado a un cátodo capaz de catalizar la reducción de oxígeno abióticos. Comparando este método con los métodos electrocultivation que usar un potenciostato para gemir el potencial de electrodo, el sistema de dos electrodos no requieren una fuente de energía externa. Presentamos un ejemplo de nuestro enriquecimiento in situ en un estanque de alcalino en los cedros, un sitio serpentinization terrestre en el norte de California. Anteriores intentos de cultivar bacterias reduciendo minerales eran fracasados, que es probablemente debido a la naturaleza de la biomasa, baja de este sitio o la baja abundancia relativa de metal reducción de microbios. Antes de implementar nuestro enriquecimiento de dos electrodos, medimos el perfil vertical de la concentración de oxígeno disuelto. Esto nos ha permitido colocar el carbón fieltro fieltro ánodo y carbono platino electrochapado procesos de cátodo a profundidades que apoyaría aeróbicas y anaeróbicas, respectivamente. Tras incubación in situ, más había enriquecido el electrodo anódico en el laboratorio y confirmó una comunidad microbiana distinta en comparación con la superficie adjunta o comunidades biofilm normalmente observadas en los cedros. Este enriquecimiento posteriormente condujo al aislamiento del microbio electrógenos primera de los cedros. Este método de enriquecimiento microbiano in situ tiene el potencial de mejorar enormemente el aislamiento de bacterias capaces de EET de la biomasa baja o difícil hábitat muestra.

Introducción

Han demostrado varios microbios reductores de mineral a utilizar minerales de fase sólida como aceptadores terminales del electrón, por procesos de transporte de electrones extracelular (EET) que realizan los electrones hacia el exterior de la célula a través de las enzimas redox1. EET es crítica, no sólo para procesos de microbios y minerales pero también energía aplicada y tecnologías del medio ambiente, tales como las células de combustible microbianas2, electrodo síntesis3y bioremediación4. Nuevas bacterias capaces de EET son muy buscadas y se han estudiado ampliamente desde un punto de vista fundamental o aplicada5. Sin embargo, sólo hemos limitada penetración en el significado ecológico o biogeoquímico de estas bacterias. La mayoría de los microbios capaces de EET se ha aislado tras enriquecimiento de aqua, sedimento o digestores anaerobios utilizando aceptadores del electrón sólido como MnO2, Fe2O3 electrodos posicionados en el laboratorio6, 7 , 8. sin embargo, estos métodos a menudo producen consorcios similares y potencialmente perder taxones más sensibles que pueden dominar el bajo consumo de energía o sistemas de biomasa baja, sesgar la capacidad de estos microbios para adaptar al laboratorio o axénicos cultura medio ambiente9 . Generalmente para los entornos de baja biomasa, se filtran grandes cantidades de agua de un sitio para concentrar las células bacterianas. Sin embargo, bacterias capaces de EET a menudo exhiben metabolismos anaerobios y por lo tanto exposición al oxígeno adicional puede inhibir o impedir su cultivo. Metodologías alternativas in situ para concentrar células sin exponer al oxígeno pueden facilitar el aislamiento de bacterias capaces de EET. Aquí, Divulgamos los datos de configuración de una técnica electroquímica in situ enriquecer microbios capaces de EET durante un largo período de tiempo sin necesidad de fuente de energía externa.

Utilizando nuestros experimentos de electrocultivation de un manantial fuertemente alcalino en California del norte, los cedros10, se describe esta técnica electroquímica in situ. La geoquímica de los resortes en los cedros se ven afectados por serpentinization en el subsuelo. Los resortes son altamente reductivos, con concentraciones de oxígeno por debajo del límite de detección bajo la interfaz de aire agua destacando el potencial para la producción de energía microbiana vía OTA en este ambiente anóxico funcionalmente11. Sin embargo, no hay ninguna evidencia para apoyar microbios capaces de EET de los cedros (en 16S rRNA o análisis de metagenómica). A pesar de este entorno se ha caracterizado como aceptador del electrón limitado, el potencial para el uso de minerales insolubles como aceptadores del electrón terminal, incluyendo minerales como el hierro, minerales que resultan de serpentinization (es decir, dejando al descubierto Magnetita), no ha sido extensivamente investigada12. Por lo tanto, implantamos nuestro sistema electroquímico en el camping resorte, un pH elevado en los cedros, para enriquecer de EET-capaz de microbios (figura1)13.

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Protocolo

1. construcción de un sistema de dos electrodos para incubación ambiental

  1. Preparación del material del ánodo y el tratamiento de carbono sentían electrodo (figura 2).
    1. Cortar el carbón para iguales dimensiones dependiendo del enriquecimiento de biomasa deseado. Remoje cada electrodo en etanol al 90% durante 30 minutos, luego enjuagar por lo menos 8 veces con agua desionizada, sonicando durante 1 min después de cada enjuague.
    2. Lavar los electrodos dos veces en 1 M de HCl, agitando durante un mínimo de 12 h para cada lavado.
    3. Secar los electrodos en un horno caliente (37 ° C) durante 6-12 horas o hasta que quede libre de líquido.
    4. Conecte los electrodos al alambre de titanio con grafito resina según el protocolo del fabricante en una placa de politetrafluoroetileno (superficie antiadherente).
      Nota: Se utilizó un alambre de titanio debido a su alta tolerancia a la corrosión aeróbica.
    5. Hornear el electrodo a 120 ° C por 6 h.
    6. Comprobar la resistencia entre el alambre de titanio y carbono fieltro con un óhmetro y confirmar que la resistencia entre el alambre y electrodos de fieltro es de menos de 5 ohms.
  2. Electrodo para la preparación del material del cátodo del fieltro del nonhydrogen de platino en el carbono
    1. Sumerja los electrodos fieltro del carbón, preparados en el paso 1.1, en 2 M KOH durante un mínimo de 12 horas en un recipiente de vidrio.
    2. Para la limpieza electroquímica, coloque los electrodos como electrodo (nosotros) en un reactor de tres electrodos, que acomoda también un referencia (RE) y el contraelectrodo (CE). Conectar, RE y CE para el potenciostato por pinzas. Confirmar todas las conexiones con un ohmiómetro.
      Nota: Utilizamos un Ag/AgCl (KCl saturado) electrodo y un platino alambre RE y CE, respectivamente.
    3. Equilibrio el electrodo en V 1.0 vs. Ag/AgCl para 600 s en solución electrolítica que contiene M 2 KOH (usando una cantidad suficiente para sumergir el electrodo entero). Sacar el electrodo del reactor electroquímico (que está hecho de vidrio). Enjuague el electrodo en agua desionizada por lo menos 8 veces, sonicando durante 1 min después de cada enjuague. Electrodos secos a 100 ° C durante al menos 12 h.
    4. Para preparar la solución de la galjanoplastia, añadir 100 g de ácido cítrico 5 g de sulfato de sodio y 2 g de dihidrógeno hexachloroplatinate (IV) hexahidrato a 1 L de ácido sulfúrico de 2 M.
    5. Pesa limpiado y secado electrodos preparados en pasos 1.2.1–1.2.2 y entonces cubre el electrodo en una solución de la galjanoplastia como preparado en el paso 1.2.3. Someter a ultrasonidos el electrodo en la solución de la galjanoplastia tres veces durante 30 s cada uno.
    6. Electrochapa los electrodos por gemir el potencial de electrodo a -0.2 V vs Ag/AgCl para 460 s en la solución de la galjanoplastia. Enjuague los electrodos dos veces en agua desionizada y deseche los residuos de platino.
    7. Enjuague los electrodos en agua desionizada por lo menos 3 veces, sonicando durante 20 s después de cada enjuague. Enjuague sin sonicación por lo menos tres veces más.
    8. Electrodo del fieltro del electrodos secos a 100 ° C por al menos 12 h. pesaje electrodo para cuantificar el platino electrochapado sobre el carbono.

2. construcción e instalación de sistema de dos electrodos

  1. Investigación del sitio de instalación para cada electrodo en el entorno natural.
    1. Determinar la concentración de oxígeno utilizando una sonda de oxígeno disuelto (OD).
    2. Compruebe el perfil de profundidad de DO en el sitio.
      Nota: Las condiciones ambientales deseadas para el ánodo son la anoxia y la hidratación constante. Si lo desea, eliminar la influencia de la fotosíntesis oxygenic por blindar el ánodo de la luz. Las condiciones ideales para la colocación de cátodo están constantemente hidratadas y cerca de la superficie las aguas ser oxic. Si es necesario, colocar flotadores para mantener el contacto de la superficie en el cátodo.
  2. Construcción de sistema de incubación de 2-electrodo tipo pila de combustible
    1. Conecte el alambre aislado de la longitud deseada y un plomo de alambre de titanio de los electrodos (un ánodo y un cátodo plateado platino) girando las dos líneas. Cubra las conexiones con cera resistente al agua y proteger aún más usando tubos de encogimiento del calor de grado marino.
    2. Conecte dos cables con un cátodo y un ánodo por un resistor de resistencia conocida.
      Nota: Para los sistemas biológicos, resistencias inferiores (10 a 1.000 Ω) resultan en actividad biológica más consistente. Si lo desea, una resistencia de alta resistencia evitará actividad biológica, como un control negativo. Para evitar la corrosión de las conexiones entre cables y resistencia, estaremos protegidos con tubos de encogimiento de calor.
  3. Medición de tensión y registro de temperatura con el tiempo.
    1. Compruebe el voltaje entre los extremos de la resistencia para estimar la producción actual de la reacción de celda de combustible.
    2. Medir la diferencia del voltaje en el tiempo utilizando un voltímetro de registro de datos con las conexiones apropiadas hacia el ánodo y el cátodo (ver protocolo del fabricante).
      Nota: Registro de datos de temperatura simultánea es opcional, pero esta información puede ayudar a relacionar cambios en corriente a abióticos como fluctuaciones biológicas.
  4. Protección de conexiones eléctricas y registrador de datos
    1. Use una bolsa inmóvil o plástica para proteger el registrador y todas las conexiones eléctricas de la lluvia.
    2. Fijar la bolsa de plástico y los cables firmemente para proteger de viento fuerte. En la figura 1se muestra un ejemplo.

3. recolección de la muestra de electrodo del ambiente Natural

  1. Para evitar que la calidad de la muestra de ánodo se dañe debido a la contaminación del oxígeno, recoge el electrodo bajo condiciones anaerobias.
  2. Por lo menos 30 minutos antes de recoger la muestra de electrodo, poner un tubo de ensayo en una zona anaeróbica. Por ejemplo, poner el tubo de ensayo y la tapa por separado en la parte inferior del estanque para hacer la botella dentro de anaerobios.
  3. Cortar la cabeza titanium del electrodo con un cortador de alambre, recoja la muestra de electrodos en el tubo de ensayo suavemente y sellarlo en la zona anaerobia del agua. Para mantener la muestra fresca, guardar la muestra a 4 º C inmediatamente después de la recolección de la muestra.
    Nota: Como alternativa, electrodos pueden transferirse directamente a anóxico (N2 purgado) medio. Se utilizó un medio de cedros (descrito por Suzuki et al. 11) que fue diseñado de la geoquímica acuosa medido en el sitio y modificado para proporcionar suficientes nutrientes para el crecimiento microbiano. Este medio fue modificado para experimentos de laboratorio diferentes.

4. laboratorio confirmación para la actual producción y análisis de la DNA

  1. Confirmación electroquímica para la actual capacidad de producción de consorcios microbianos al electrodo.
    1. Construcción de un reactor electroquímico14,15 con el electrodo de la muestreo, un alambre de platino y un Ag/AgCl (KCl saturado) electrodo como nosotros, CE y RE, respectivamente, en una cámara de anaerobia. Llene el reactor electroquímico con medio de cedros con donadores de electrones de carbohidratos solubles.
    2. Equilibrio el potencial de electrodo en + 0,2 V vs Ag/AgCl y medida de la producción actual.
  2. El kit de extracción de ADN de la muestra de electrodos usando un ADN microbiano (véase tabla de materiales).
    1. Limpie el interior de la guantera anaerobio con etanol al 70% y un plato de esterilizado en papel de aluminio.
      Nota: Cámara anaerobia mantiene la concentración de oxígeno de menos de 1 ppm por mantener un ambiente de hidrógeno en un ~ 2-3% a buscar oxígeno en presencia de un catalizador de paladio.
    2. Abrir el reactor electroquímico en la guantera, colocar el electrodo de la muestra en el plato y cortar a un tamaño para ajustarse al tubo utilizado en el kit de ADN. Proceda con el protocolo del fabricante.

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Resultados

La producción actual se midió con éxito por aproximadamente 3 meses usando un registrador de datos de voltaje como se muestra en la figura 3. Esta vez fue elegida como el más largo período de incubación estable para la primavera, debido a la caída fuertes lluvias que afectan a la primavera. Un período más corto podría ser suficiente, aunque un período más largo podría proporcionar más fuerte enriquecimiento de biomasa. Había confirmada la conexión del sistema...

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Discusión

En el estudio descrito, se muestra el enriquecimiento de un consorcio microbiano, vinculado con la producción actual de en situ . La escala de los patrones observados en la actividad microbiana apoyo actual en este sistema en el corto y largo tiempo. El paso crítico para la construcción de un sistema funcional de dos electrodos (tipo de célula de combustible) es identificar y utilizar una ubicación con un estable nivel de agua y concentración de oxígeno en el medio ambiente. El cátodo está expuesto al oxígeno en...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría reconocer Roger Raiche y David McCrory nos permite el acceso a los cedros y la consulta sobre lugares para la incubación de largo plazo. También agradecemos al equipo de campo de los cedros durante la temporada 2013-2014: Shino Suzuki, Shunichi Ishii, Greg Wanger, Grayson Chadwick, Bonita Lam y Matthew Schechter. Adicional gracias a Shino Suzuki y Gijs Kuenen de profunda investigación y cultivo de apoyo. Este trabajo fue financiado a través de una subvenciones para jóvenes científicos A y B de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) KAKENHI Grant número 17H 04969 y 26810085, respectivamente y la Agencia Japonesa para la investigación médica y el desarrollo (17gm6010002h0002). Estados Unidos fondos provistos por el nos oficina de Naval investigación Global (N62909-17-1-2038) y el centro de investigaciones de la Biosfera de energía oscura (C-DEBI) (OCE0939564) y el Instituto de Astrobiología de la NASA - vida subterránea (NAI-LU) (NNA13AA92A). Parte de este trabajo se realizó como parte de una sociedad de Japón para la promoción de las Ciencias: a corto plazo beca postdoctoral para Annette Rowe (PE15019) de la Universidad de Tokio en el laboratorio de Kazuhito Hashimoto.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Hoja de fieltro de carbonon/an/aUtilizada para ánodo y cátodo Alambre de
titanioLa Corporación NilacoTI-451485Se utiliza para construir un sistema de pila de combustible
Grafito epoxiElectrolytica lnc.n/aSe utiliza para conectar los electrodos
y el horno de
secadoTi YamatoDY300hornear el electrodo a
solidificar el epoxi de grafito conductor
digitalFluke616-1454para comprobar el valor óhmico
de resistencia
SperScience#  850045para comprobar la concentración de oxígeno
en el entornos
ResistenciaSodialSe utiliza para construir un sistema de pila de combustible
Cable conductorPico81141sSe utiliza para construir un sistema de pila de combustible
Voltímetro y registrador de datosT& Corporación DVR-71Utilizado para el registro de datos
Hidrógeno Hexacloroplatinato (IV) Hexahidratowako18497-13-7Utilizado para electropolación
Ácido cítricoWako038-06925Utilizado para electropolación
Ácido sulfúricoWako192-04696Utilizado para electropolación
HClWako083-01095Utilizado para el lavado de electrodos
Cilindro de vidrioN/AN/AHecho a medida, utilizado como reactor electroquímico
Cubierta y base de PTFEN/AN/AHecho a medida, utilizado como cubierta y base del reactor electroquímico
Caucho butílicoN/AN/AHecho a medida, insertado entre cada componente del reactor electroquímico
SeptaGL Science3007-16101Utilizado como puerto de inyección del reactor electroquímico
Electrodo de óxido dopado con indio y estaño (ITO)GEOMATECNo.0001Utilizado como electrodo de trabajo, 5Ω/sq
Ag/AgCl Electrodo saturado de KCAlHOKUTO DENKOHX-R5Utilizado como electrodo de referencia, Φ Alambre de platino de 0,30 mm
La cooperación NilacoPT-351325Utilizado como contraelectrodo
NaHCO3Wako191-01305Utilizado para The Cedars Media (CMS)
CaCO3Wako030-00385Utilizado para CMS
NH4ClWako011-03015Utilizado para CMS
MgCl2  y toro; 6H2OWako135-00165utilizado para CMS
NaOH Wako198-13765Utilizado para CMS
Na2SO4Wako194-03355Utilizado para CMS
K2HPO4Wako164-04295Utilizado para CMS
CABS SANTA CRUZSC-285279Utilizado para
incubadoraTOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.LTI-601SDUtilizado para
la máquina de autoclaveTOMY SEIKO CO., LTD.LSX-500Se utiliza para la esterilización del reactor electroquímico y el medio
Banco limpioSANYOMCV-91BNFSe utiliza para prevenir la contaminación del reactor electroquímico y el medio con otros microbios
Separador de centrífugaEppendorf5430RVelocidad de rotación de hasta 6000 veces; g se requiere
generador de gas nitrógenoPuequ CO. LTD.PNTN-2El cilindro de gas nitrógeno también se puede utilizar en lugar del generador de gas
espectrómetro UV-visSHIMADZUUV-1800Se utiliza para la optimización de la densidad celular
PotenciostatBioLogicVMP3Se utiliza para la formación de biopelículas y experimentos de efecto cinético de isótopos
Circulador de agua térmicaAS ONETR-1ASe utiliza para el mantenimiento de la temperatura del reactor electroquímico
Jaula de FaradayHOKUTO DENKOHS-201SUtilizada para experimentos electroquímicos
anaeróbicaCOYTipo B (Vinilo)Para realizar experimentos
en condiciones anaeróbicas
Kit de extracción de ADN ultralimpioMoBio
de alambre múltiple la CMS de precultivo Cámara

Referencias

  1. Nealson, K. H., Saffarini, D. Iron and manganese in anaerobic respiration: environmental significance, physiology, and regulation. Annual Reviews of Microbiology. 48, 311-343 (1994).
  2. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 4 (7), 497-508 (2006).
  3. Rabaey, K., Rozendal, R. A. Microbial electrosynthesis - revisiting the electrical route for microbial production. Nature Reviews Microbiology. 8 (10), 706-716 (2010).
  4. Lovley, D. R., Coates, J. D. Bioremediation of metal contamination. Current Opinion in Biotechnology. 8 (3), 285-289 (1997).
  5. Dinh, H. T., et al. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).
  6. Myers, C. R., Nealson, K. H. Bacterial manganese reduction and growth with manganese oxide as the sole electron acceptor. Science. 240 (4857), 1319-1321 (1988).
  7. Lovley, D. R., Phillips, E. J. Novel mode of microbial energy metabolism: organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese. Applied and Environmental Microbiology. 54 (6), 1472-1480 (1988).
  8. Arnold, R. G., DiChristina, T. J., Hoffmann, M. R. Reductive dissolution of Fe(III) oxides by Pseudomonas sp 200. Biotechnology and Bioengineering. 32 (9), 1081-1096 (1988).
  9. Rowe, A. R., et al. In situ electrochemical enrichment and isolation of a magnetite-reducing bacterium from a high pH serpentinizing spring. Environmentakl Microbiology. 19 (6), 2272-2285 (2017).
  10. Suzuki, S., et al. Microbial diversity in The Cedars, an ultrabasic, ultrareducing, and low salinity serpentinizing ecosystem. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (38), 15336-15341 (2013).
  11. Suzuki, S., et al. Physiological and genomic features of highly alkaliphilic hydrogen-utilizing Betaproteobacteria from a continental serpentinizing site. Nature Communications. 5, 3900(2014).
  12. McCollom, T. M., et al. Temperature trends for reaction rates, hydrogen generation, and partitioning of iron during experimental serpentinization of olivine. Geochimica et Cosmochimica Acta. 181, 175-200 (2016).
  13. Morrill, P. L., et al. Geochemistry and geobiology of a present-day serpentinization site in California: The Cedars. Geochimica et Cosmochimica Acta. 109, 222-240 (2013).
  14. Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes. Electrochimica Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).
  15. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nakamura, R. Spectroelectrochemical Investigation on Biological Electron Transfer Associated with Anode Performance in Microbial Fuel Cells. , InTech. 207-222 (2012).
  16. Deng, X., Nakamura, R., Hashimoto, K., Okamoto, A. Electron from an Extracellular Electrode by Desulfovibrio ferrophilus Strain IS5 Without Using Hydrogen as an Electron Carrier. Electrochemistry. 83 (7), 529-531 (2015).

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