Aquí detallamos las técnicas experimentales usadas para evaluar las fuerzas de la saliente que podosomes aplicar sobre una película compatible con, desde la preparación de la película para el análisis automatizado de imágenes topográficas.
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Artículo de método
Microscopia de la fuerza de protrusión: Un método para cuantificar las fuerzas desarrolladas por salientes de celular
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
En numerosos contextos biológicos, las células animales necesitan interactuar físicamente con su entorno mediante el desarrollo de las fuerzas mecánicas. Entre ellas, las fuerzas de tracción han sido bien caracterizadas, pero hay una falta de técnicas que permite la medición de las fuerzas de protrusión ejercida por células ortogonalmente a su substrato. Se diseñó un montaje experimental para medir las fuerzas de protrusión ejercidas por las células adherentes a su substrato. Células sobre una hoja de Formvar compatible con este sustrato deforman y la topografía resultante se asigna por microscopía de fuerza atómica (AFM) en la escala de nanómetros. Valores de fuerza se extraen luego de un análisis del perfil de deformación basado en la geometría de las estructuras celulares protrusivo. Por lo tanto, las fuerzas ejercidas por las unidades individuales que sobresale de una célula viva pueden medirse con el tiempo. Esta técnica permite el estudio de generación de fuerzas y su regulación en los procesos celulares que implican protrusión. Aquí, Describimos su aplicación para medir las fuerzas protrusivo generadas por podosomes formado por macrófagos humanos.
Introducción
Las células animales interactúan físicamente con la matriz y las otras células que constituyen su medio ambiente1. Esto es necesario para que puedan migrar, internalizar cuerpos, adquirir información externa o distinguir. En tales procesos, la célula debe generar fuerzas mecánicas y, como han demostrado numerosos estudios en los últimos años, la capacidad de una célula para generar fuerzas y probe su entorno influye en su comportamiento biológico, dirigir por ejemplo proliferación o diferenciación de2,3. A su vez, la medición de fuerzas celulares es una ayuda importante para estudiar la....
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Protocolo
1. elaboración de rejillas de Formvar recubierto
- Limpiar rejillas de microscopia electrónica con acetona pura y seca sobre papel filtro. Luego limpiar el portaobjetos de un microscopio con etanol puro, limpie con un papel de lente y quite el polvo con un soplador.
- Colocar un portaobjetos de vidrio limpieza de etanol verticalmente en el embudo de un dispositivo de colada de película que contiene una solución de Formvar en la parte inferior. Cubrir la parte superior del embudo.
- Bomba de 100 mL de solución de Formvar (0.5% en dicloruro de etileno) con el bulbo atomizador hasta que alcanza las dos terceras partes de la diapositiva.
- ....
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Resultados
El protocolo de arriba describe cómo preparar la configuración experimental para cuantificar la fuerza saliente por macrófagos podosomes en un substrato de Formvar. Esto se consigue utilizando AFM y se ilustra en la figura 1.
Al analizar una imagen topográfica de protuberancias debajo de podosomes usando el software de procesamiento de datos JPK, un polinomio de tercer grado ajuste debe restarse de .......
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Discusión
Propiedades de los materiales
La elección del material de la membrana deformable, en nuestro caso Formvar, debe cumplir con unos requisitos. El material debe ser transparente a la luz visible y exhiben fluorescencia auto limitada para permitir observaciones en campo brillante y microscopía de fluorescencia. La rugosidad de la capa fina debe estar muy por debajo de 10 nm para evitar efectos topográficos sobre la adhesión celular y para permitir la observación clara de las protu.......
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Divulgaciones
No hay conflicto de interés declarado.
Agradecimientos
Los autores agradecemos a Anna Labernadie, Guillaume Charrière y Patrick Delobelle por su contribución inicial a esta obra y a Matthieu Sanchez y Françoise Viala por su ayuda con video filmación y edición. Este trabajo ha sido apoyado por la Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM Plan cáncer, Fundación Toulouse cáncer humano programa de ciencia de frontera (RGP0035/2016).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Rejillas de níquel de malla 200 | Electrónica Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Papel de filtro | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Portaobjetos de microscopio | Fisher Scientific | 10235612 | |
| Pegatinas blancas 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Dispositivo de fundición de película con válvula en su salida | Electrónica Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Cuchillas de afeitar | Microscopía electrónica Sciences | 72000 | |
| Etanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetona | VWR | 20066.321 | |
| Formvar solución al 0,5% en dicloruro de etileno | Microscopía electrónica Sciences | 15820 | |
| cubreobjetos de 12 mm | VWR | 631-0666 | |
| Microscopio invertido | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Microscopio de fuerza atómica | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Portamuestras con control de temperatura | JPK Instruments | BioCell | |
| Voladizo de nitruro de silicio con una constante de resorte nominal de 0,01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Cinta adhesiva de doble cara | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Placas de Petri con fondo de vidrio de 35 mm | WPI | FD35-100 |
Referencias
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Paszek, M. J., et al. Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Engler, A. J., Se....
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Reimpresiones y permisos
