Microscopia de la fuerza de protrusión: Un método para cuantificar las fuerzas desarrolladas por salientes de celular

Summary

Aquí detallamos las técnicas experimentales usadas para evaluar las fuerzas de la saliente que podosomes aplicar sobre una película compatible con, desde la preparación de la película para el análisis automatizado de imágenes topográficas.

Abstract

En numerosos contextos biológicos, las células animales necesitan interactuar físicamente con su entorno mediante el desarrollo de las fuerzas mecánicas. Entre ellas, las fuerzas de tracción han sido bien caracterizadas, pero hay una falta de técnicas que permite la medición de las fuerzas de protrusión ejercida por células ortogonalmente a su substrato. Se diseñó un montaje experimental para medir las fuerzas de protrusión ejercidas por las células adherentes a su substrato. Células sobre una hoja de Formvar compatible con este sustrato deforman y la topografía resultante se asigna por microscopía de fuerza atómica (AFM) en la escala de nanómetros. Valores de fuerza se extraen luego de un análisis del perfil de deformación basado en la geometría de las estructuras celulares protrusivo. Por lo tanto, las fuerzas ejercidas por las unidades individuales que sobresale de una célula viva pueden medirse con el tiempo. Esta técnica permite el estudio de generación de fuerzas y su regulación en los procesos celulares que implican protrusión. Aquí, Describimos su aplicación para medir las fuerzas protrusivo generadas por podosomes formado por macrófagos humanos.

Introduction

Las células animales interactúan físicamente con la matriz y las otras células que constituyen su medio ambiente¹. Esto es necesario para que puedan migrar, internalizar cuerpos, adquirir información externa o distinguir. En tales procesos, la célula debe generar fuerzas mecánicas y, como han demostrado numerosos estudios en los últimos años, la capacidad de una célula para generar fuerzas y probe su entorno influye en su comportamiento biológico, dirigir por ejemplo proliferación o diferenciación de^2,3. A su vez, la medición de fuerzas celulares es una ayuda importante para estudiar la....

Protocol

1. elaboración de rejillas de Formvar recubierto

1. Limpiar rejillas de microscopia electrónica con acetona pura y seca sobre papel filtro. Luego limpiar el portaobjetos de un microscopio con etanol puro, limpie con un papel de lente y quite el polvo con un soplador.
2. Colocar un portaobjetos de vidrio limpieza de etanol verticalmente en el embudo de un dispositivo de colada de película que contiene una solución de Formvar en la parte inferior. Cubrir la parte superior del embudo.
3. Bomba de 100 mL de solución de Formvar (0.5% en dicloruro de etileno) con el bulbo atomizador hasta que alcanza las dos terceras partes de la diapositiva.
4. ....

Results

El protocolo de arriba describe cómo preparar la configuración experimental para cuantificar la fuerza saliente por macrófagos podosomes en un substrato de Formvar. Esto se consigue utilizando AFM y se ilustra en la figura 1.

Al analizar una imagen topográfica de protuberancias debajo de podosomes usando el software de procesamiento de datos JPK, un polinomio de tercer grado ajuste debe restarse de .......

Discussion

Propiedades de los materiales

La elección del material de la membrana deformable, en nuestro caso Formvar, debe cumplir con unos requisitos. El material debe ser transparente a la luz visible y exhiben fluorescencia auto limitada para permitir observaciones en campo brillante y microscopía de fluorescencia. La rugosidad de la capa fina debe estar muy por debajo de 10 nm para evitar efectos topográficos sobre la adhesión celular y para permitir la observación clara de las protu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rejillas de níquel de malla 200	Electrónica Microscopy Sciences	G200-Ni
Papel de filtro	Sigma-Aldrich	1001-055
Portaobjetos de microscopio	Fisher Scientific	10235612
Pegatinas blancas 26 x 70 mm	Avery	DP033-100
Dispositivo de fundición de película con válvula en su salida	Electrónica Microscopy Sciences	71305-01
Cuchillas de afeitar	Microscopía electrónica Sciences	72000
Etanol	VWR	1.08543.0250
Acetona	VWR	20066.321
Formvar solución al 0,5% en dicloruro de etileno	Microscopía electrónica Sciences	15820
cubreobjetos de 12 mm	VWR	631-0666
Microscopio invertido	Carl Zeiss	Axiovert 200
Microscopio de fuerza atómica	JPK Instruments	NanoWizard III
Portamuestras con control de temperatura	JPK Instruments	BioCell
Voladizo de nitruro de silicio con una constante de resorte nominal de 0,01 N/m	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
Cinta adhesiva de doble cara	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
Placas de Petri con fondo de vidrio de 35 mm	WPI	FD35-100