Técnicas de micromanipulación que permite el análisis de las dinámicas morfogenéticas y facturación de los reguladores citoesqueléticos

Summary

Describimos cómo técnicas de micro - y Fotomanipulación como FRAP y fotoactivación permiten la determinación de los parámetros de motilidad y la dinámica espacio-temporal de las proteínas a migración de las células. Lecturas experimentales incluyen la dinámica subcelular y facturación de los reguladores de la motilidad o subyacente del citoesqueleto de actina.

Abstract

Examen de la dinámica espacio-temporal de las proteínas puede revelar su importancia funcional en diversos contextos. En este artículo, es discutida recuperación cómo fluorescente después de photobleaching (FRAP) y técnicas de fotoactivación puede utilizarse para estudiar la dinámica espacio-temporal de las proteínas en localizaciones subcelulares. Mostramos también cómo estas técnicas permiten la sencilla determinación de diversos parámetros relacionados con actina citoesqueleto célula y la regulación de la movilidad. Además, la microinyección de células se describe además como tratamiento alternativo (potencialmente anterior o como complemento de las técnicas mencionadas Fotomanipulación) a disparo instantáneo efectos de proteínas translocadas en celular morfología y función. Micromanipulación como proteína inyección o aplicación local de drogas permeable a la membrana plasmática o inhibidores de citoesqueleto puede servir como herramienta para registrar las consecuencias inmediatas de un tratamiento sobre el comportamiento de la célula en la célula y subcelular nivel. Esto se ejemplifica aquí por la inmediata inducción de protrusión de borde de celda de lamellipodial por la inyección de proteínas recombinantes en Rac1, establecido hace un cuarto de siglo. Además, proporcionamos un protocolo para determinar el volumen de negocios de mayor proteína verde fluorescente (EGFP)-VASP, una polimerasa del filamento de actina acumulación prominente en las puntas de la lamellipodial de las células B16-F1, empleo de FRAP e incluyendo el datos asociaron Análisis y ajuste de curvas. También presentamos las pautas para la estimación de los índices de polimerización de la red de lamellipodial actina, ejemplificado por las células que expresan EGFP-tagged β-actina. Por último, se dan instrucciones para que cómo investigar las tasas de movilidad de monómero de actina en el citoplasma de las células, seguido por la incorporación de actina en los sitios de montaje del filamento rápido, como las puntas que sobresalen lamellipodia, mediante fotoactivación se acerca. Ninguno de estos protocolos se limita a los componentes o las autoridades reguladoras del citoesqueleto de actina, pero puede ampliarse fácilmente para explorar de manera análoga la dinámica espaciotemporal y función de proteínas en varias diversas estructuras subcelulares o funcional contextos.

Introduction

Monitoreo de la dinámica espacio-temporal de las proteínas y otras moléculas en las células vivas se ha convertido en una herramienta esencial en muchos campos de la biología celular y molecular. Técnicas de microscopía como transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) y vida de FRET-fluorescencia (FLIM-FRET) la proyección de imagen avanzadas de fluorescencia o FRAP, pérdida de la fluorescencia photobleaching (FLIP) y la fotoactivación así como muchos otros permiten temporal y espacial de seguimiento de las interacciones proteína-proteína, cambios conformacionales, así como para determinar la cinética de la difusión y localización de diferentes proteínas en la célula^1,2. FRAP y fotoactivación técnicas, en particular, son ampliamente aplicables para el examen de los reguladores de la actinia citoesqueleto y migración celular. Estas técnicas pueden aplicarse solos o en combinación con técnicas de micromanipulación adicional como la microinyección³e implican la expresión de proteínas marcada con fluorescencia. Permite la estimación de la cinética de Asociación de la proteína a las estructuras ricas en actina participan en la migración celular, filopodios como lamellipodia, la facturación de las proteínas en adherencias focales⁴, o ramificadas redes de actina⁵. También permiten la determinación de lamellipodial tipos de polimerización de la actinia, la evaluación de la dispersión de la actina monomérica dentro del citosol, la tasa de translocación de monómero de actina subcelular al polimerizar filamentos de actina en la que sobresalen lamellipodia⁶y otros parámetros.

FRAP es un método para visualizar y cuantificar la movilidad de las proteínas dentro de una célula viva, originalmente desarrollado en la década de 1970 por Axelrod⁷. Una región de interés (ROI) dentro de una célula, poblada con proteínas marcada con fluorescencia, transitoriamente está expuesta a un láser de alta intensidad, suficiente para causar la decoloración de las moléculas de fluoróforo presentes en esta región durante un corto período de tiempo determinado. Sin blanquear, con la etiqueta fluorescente proteínas situadas fuera el retorno de la inversión durante el blanqueamiento, difusa e infiltrarse en la región blanqueada dependiendo de su dinámica espaciotemporal, causando el desplazamiento de las moléculas de photobleached en el tiempo. La tasa de recuperación de fluorescencia en regiones blanqueadas es dependiente en varios factores, incluyendo el tamaño y la tasa de difusión de una determinada molécula, y por supuesto su tasa de rotación dentro de los supuestos asociados estructura blanqueado. Así, proteínas solubles a mediar en la recuperación de la fluorescencia en el ROI blanqueado rápidamente por difusión, mientras que proteínas estrechamente relacionadas con las estructuras, tales como adherencias focales, tendrá tiempo de facturación, como su recuperación de fluorescencia dependen en la difusión de la fracción soluble de la cinética de disociación-asociación y proteína de la fracción asociada a la estructura. Recuperación de fluorescencia es generalmente adquirido y cuantificado hasta alcanzar el nivel inicial de bleach la intensidad de la fluorescencia. Sin embargo, esto no ocurre si una parte de la intensidad de fluorescencia inicial pertenece a la llamada fracción inmóvil, que es incapaz de ser reemplazados por difusión o reposición en tasas muy lentas en comparación con la mayoría de las moléculas con el móvil fracción. Para determinar la tasa de rotación de proteínas, se generan curvas FRAP, que representa el grado de recuperación de fluorescencia con el tiempo. De estas curvas de recuperación, se pueden calcular medios tiempos promedio de recuperación de proteína. Mediante la creación de ajustes de curva de los datos promedio de FRAP y análisis matemáticos por lo tanto, también es posible deducir si el índice de rotación promedio de la fracción móvil constituye un compuesto de una población homogénea de moléculas, o si está compuesto por dos o más subpoblaciones de volcar en el diferencial de tipos de moléculas. Además estimar tasas de rotación de proteínas por métodos cuantitativos, seguimiento de la recuperación de las regiones photobleached en lamellipodia puede también permiten la cuantificación precisa de los parámetros de motilidad lamellipodial como flujo retrógrado, protrusión, y tipos de polimerización de actina. Así, el FRAP constituye una herramienta versátil para aplicar para la evaluación de varios parámetros dentro de las estructuras de las células vivas.

Fotoactivación es un método utilizado para rastrear la difusión y movilidad de las proteínas o moléculas procedentes de una ubicación designada del celular. La técnica emplea, por ejemplo, una variante del salvaje-tipo proteína verde fluorescente (GFP), inicialmente desarrollada por Patterson y Lippincott-Schwartz,⁸, que está mutado en una forma que permite su fluorescencia muy aumentar con la exposición a luz ultravioleta (UV) (alrededor de 400 nm; aquí, 405 nm). Según Patterson et al., cromóforos de salvaje-tipo GFP existan como una población mixta de fenoles neutros y aniónicos phenolates, que producen un pico de absorbancia mayor a aproximadamente 397 nm y una menor, a 475 nm, respectivamente. Tras la irradiación de la proteína con luz UV, la población experimenta photoconversion, hacia la forma aniónica. Cuando excitado por 488 nm, la proteína de photoconverted/fotoactivado exhibe un 3-fold aumento en fluorescencia, insuficiente en la práctica para distinguir entre activado y desactivado GFP debido a la fluorescencia de fondo intrínseco alto. Sin embargo, se ha logrado una disminución en la intensidad de fondo introduciendo una mutación solo aminoácido en la secuencia GFP (substitución de la histidina en la posición 203). El mutante resultante de T203H, también conocido como photoactivatable-GFP (GFP-PA) se caracteriza por una reducción significativa en la absorbencia del pico menor, que por irradiación con luz UV se incrementa casi 100-fold cuando posteriormente excitado por luz de 488 nanómetro. Por lo tanto, la sobreexpresión de proteínas con la etiqueta PA-GFP es un enfoque ampliamente utilizado, que permite la determinación de difusión y movilidad de las moléculas dentro de las células. Previamente hemos aplicado actina PA-GFP-con la etiqueta para determinar la tasa de dispersión de monómeros de actina de las regiones citosólicas, permitiendo no sólo la exploración de su movilidad en el citosol, pero también su tasa de incorporación en el que sobresalen la red de actina lamellipodial⁶. La literatura más reciente describe también proteínas novedosas, Foto-convertible que pueden en principio ser utilizadas en una manera análoga, pero albergando la ventaja potencial para verse ya antes de la conversión de la foto. Ejemplos de este grupo de proteínas fluorescentes Dendra2 y mEos2^9,10,11,12.

En este artículo, se explica la metodología de células microinjecting con proteínas. Además explicamos cómo esta técnica puede combinarse con FRAP, por photobleaching proteínas implicadas en la regulación del citoesqueleto de actina y de la motilidad, y cómo pueden obtenerse curvas FRAP y tiempo de recuperación de fracciones móviles. Además, ofrecemos un ejemplo de cómo se puede utilizar la técnica FRAP para determinar índices de polimerización de actina de lamellipodial redes. También proporcionamos instrucciones y consejos sobre cómo llevar a cabo experimentos de fotoactivación, que pueden utilizarse para determinar tarifas de actina incorporación lamellipodia y movilidad citosólica de la actina monomérica. Estas técnicas, por supuesto, no son solamente limitado a componentes del citoesqueleto de actina de seguimiento, pero potencialmente necesaria adaptación moderada o optimización, puede ser ampliamente aplicada a otros tipos de células o a investigar diversas proteínas, estructuras, y parámetros.

Protocol

1. cubreobjetos lavado y esterilización

1. Sumerja la cubierta de 15 mm (diámetro) gafas (no.1) en un matraz de 500 mL que contiene una mezcla de 40 mL 37% HCl y 60 mL 100% EtOH (cubreobjetos no más de 100 por cada 100 mL de solución de lavado).
   Nota: incluso si recién comprado, cubreobjetos deben estrictamente limpiarse antes de sembrar las células sobre sus superficies. Esto es porque pueden contener películas delgadas de grasa, que son macroscópicamente invisible, pero eficiente pueden interferir con la adhesión y difusión adecuada de células vivas. Considerando que tales películas pueden eliminarse eficazmente con soluciones que contengan ácido o base (ver Fischer et al. ¹³), habitualmente utilizamos la mezcla de alcohol ácido descrita anteriormente.
2. Agitar el frasco que contiene los vidrios de cubierta por 30 min en un agitador de rotación. Elige una velocidad que permite que los vidrios de cubierta se arremolinaban libremente, pero lo suficiente para evitar la frecuente rotura lenta. Filtrar la solución para retirar pedazos de cristal quebrado si reutilizar.
3. Transferir los vidrios de cubierta a un frasco que contenga al menos 200 mL de agua estéril e incubar en un agitador de rotación, mientras que cambiar varias veces el agua hasta que ha desaparecido el olor ácido. Múltiples lavados durante varias horas se recomiendan para la eliminación completa de trazas de ácido clorhídrico-EtOH.
4. Seca vidrios de cubierta individuales en una hoja de papel de filtro.
5. Lugar los vidrios de cubierta en la parte inferior de un plato de Petri de 10 cm (diámetro) cubiertos con papel de filtro y el calor seco-esterilizar. Evite el autoclave ya que esto tapa vidrios permanecer juntos.

2. tratamiento de las células, transfección y siembra en cubreobjetos

1. Crecen las células del melanoma del ratón B16-F1 según condiciones de cultivo de célula estándar en DMEM (glucosa de 4.5 g/L) que contiene suero de ternera fetal 10%, glutamina 2 mM y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C, 7% CO₂.
2. Cultivar células de fibroblastos NIH3T3 para microinyecciones según las condiciones de cultivo estándar celular (cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C, 7% CO₂) en DMEM (glucosa de 4.5 g/L) que contiene 10% suero fetal bovino, piruvato de sodio 1 mM, 1 x MEM no aminoácidos esenciales , glutamina 2 mM y 1% de penicilina-estreptomicina.
3. Por transfecciones, crecen las células B16-F1 al 100% de confluencia en un plato de 10 cm y paso en una proporción de 1:5 en un recipiente de plástico de 3 cm (diámetro).
4. El mismo día, después de que las células B16-F1 se les permitiera adherirse durante al menos 6 h, transfectar con 500 ng/plato de photoactivatable PA-GFP-actina o ADN del plásmido de EGFP-tagged β-actina. Para transfecciones Co de PA-GFP-actina con vectores codificar mCherry, mezcla un total de 1 μg de ADN de plásmido por caja de 3 cm.
5. Transfectar las células B16-F1 con el reactivo de transfección (Tabla de materiales). Para un plato de 3 cm, mezclar 200 μL de 150 mM de NaCl que contiene 500 ng de ADN construir con 200 μL de NaCl que contiene 1 μl de reactivo de transfección de 150 mM (es decir, ADN (μg): proporción de reactivo (μL) de 1:2 fue utilizado).
6. Incubar la mezcla por 20 min a temperatura ambiente (RT) y la pipeta mediante goteo sobre el plato de 3 cm que contiene las células de transfección. Agitar suavemente el plato para mezclar e incubar durante una noche a 37 ° C, 7% CO₂.
7. Preparar el tampón con revestimiento laminina que contiene 50 mM Tris, pH 7.4 y 150 mM NaCl.
8. Para las células B16-F1, capa de 15 mm tapa vidrios esparciendo 150 μL de laminina (25 μg/mL en tampón de recubrimiento de laminina) e incubar durante 1 h a TA. Para las células NIH3T3, cubrir los vidrios de cubierta con la solución de fibronectina (25 μg/mL en tampón fosfato salino (PBS)) e incubar 1 h a TA.
9. Lavar vidrios de cubierta laminina o fibronectina incubados con PBS, luego aspire el PBS y añadir 2 mL de células transfected.
10. Las células transfected B16-F1 de la semilla (en 1:30 relación de un plato confluente), en el día después de la transfección, en cubreobjetos recubierto de laminina. Semillas los fibroblastos NIH3T3 (en 1:20 relación de un plato confluente) sobre cubreobjetos recubierto de fibronectina.
11. Permitir a las células a laminina o fibronectina recubierto cubierta gafas durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C antes de la microscopia. Alternativamente, se pueden iniciar experimentos de microscopía en el mismo día, dado que las células se permiten difundir durante al menos 2-3 h.

3. montaje de la cámara de imágenes de microscopía

1. Utilizar un calor conductor 26 RC de aluminio de cámara para microscopía (figura 1a). Untar la grasa de silicona alrededor del contorno de la abertura de plástico sellador utilizando una jeringa (figura 1b).
2. Coloque el vidrio de la cubierta con la celdas hacia arriba en la cámara (figura 1c).
3. Coloque el sellador plástico sobre el vidrio de cubierta para hacer un sello seguro entre el cubreobjetos y la cámara. Fije el sellador plástico (diagonal para evitar la rotura del cubreobjetos) apretando las abrazaderas deslizantes en la cámara para evitar que el medio de filtración (figura 1d).
4. Medio de microscopia precalentado pipeta de 37 ° C en la zona central. Para medio reducido de Autofluorescencia y así optimizado para microscopía, utilizar la misma receta como medio de cultivo descrito arriba, pero con F12-jamón en lugar de DMEM, además que contiene 20 mM HEPES para el cultivo de células en ausencia de CO₂ (figura 1e).
5. Inserte el detector de calor en la ranura señalada de la cámara y conectar los electrodos de la cámara a un controlador de temperatura automático TC-324B manteniendo una temperatura constante de 37 ° C (figura 1f).
6. Coloque una pequeña gota de aceite de inmersión sobre el objetivo y colocar la cámara en la parte superior.
7. Incubar la cámara con las células de al menos 10-30 min para permitirles recuperarse de la caída de temperatura durante el montaje y adaptación al medio de la microscopia.
8. Antes de inicia la microscopia, sustituir el medio de cultivo en el depósito central de la cámara (aproximadamente 800 μL) para evitar una concentración inadecuada de componentes medio y suero debido a la evaporación media. Microscopía prolongadas sesiones con cámaras abiertas requieren cambio de rutina de la evaporación media.

4. microinyección procedimiento

1. Cubrir el cubreobjetos, preparar las células y montar la imagen de la cámara como se describe anteriormente.
2. Descongelar una alícuota de la proteína purificada que se inyecta (típicamente 10 μl o menos) y diluir con el tampón adecuado microinyección.
   Nota: Composición del tampón puede varían según el tipo de proteína y de la célula, pero tenga cuidado de utilizar un pH 6.95 entre 8.00 y evitar el uso de PBS, como células más no ser inyectado con PBS.
3. Para microinyección de Rac1, preparar el tampón que contiene 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM de MgCl₂, 1 mM TDT. Los iones de Mg^{2 +} son esenciales para la estabilidad pequeña GTPasa.
   Nota: Las concentraciones de proteína normalmente varían entre 0.1 – 1 mg/mL (máximo 2 mg/mL), dependiendo de la proteína, el tipo de experimento y la célula tipo.
4. En su caso, añadir colorante fluorescente, como el dextrano inerte (0,5 μg/mL, 70 kDa) a la solución de la proteína, que puede confirmar la presencia de flujo de la aguja antes de inyecciones y permite la documentación de las inyecciones de éxito después de la experiencia.
   Nota: El experimento aquí no pretende seguir la dinámica de Rac1 inyectado, que sólo sería posible sobre etiquetado de fluorescencia directa de la proteína. Acoplamiento de proteínas con colorantes fluorescentes o fusión de una proteína fluorescente es posible, pero evitar pues alberga el riesgo de interferir con la función de señalización, en particular de proteínas pequeñas como la familia de Rho GTPase Rac1 (20 kDa).
5. Centrifugue la solución de la proteína a 10.000 x g durante al menos 30 min para eliminar los agregados de proteína que pueden llevar a obstrucción presente en la microinyección capilar de la aguja.
6. Una aguja microinyección (microinyección capilar) con 1 μl de mezcla de inyección de carga desde la parte posterior utilizando una pipeta de punta/microloader flexible.
7. Si hay burbujas de aire en la punta de la aguja, golpee suavemente la base de la aguja con el fin de eliminarlos. Proceder rápidamente para evitar la sequedad de la punta de la aguja, que puede provocar la obstrucción de la aguja.
8. Ajuste cuidadosamente el sostenedor de la aguja en el dispositivo de micromanipulación. Si usando un microscopio invertido para la proyección de imagen del contraste de la fase, antes de la carga de la aguja, asegúrese de que hay suficiente espacio para mover la aguja hacia arriba y hacia abajo sin obstruir el condensador del microscopio.
9. Al atornillar el microcapillary en el soporte de la aguja, aplicar presión (20 – 50 hPa fondo) a la aguja mediante un dispositivo de presión de microinyección antes de translocación de la punta de la aguja en el medio de cultivo celular.
   Nota: Activar la presión cuando la aguja está en el medio en el medio de ser aspirado por la fuerza capilar, máquina y así prohibir la inyección de la solución de interés.
10. Coloque la aguja en el campo de visión (facilitado por el uso de objetivos de bajo aumento). Aquí se utilizó un objetivo seco de 40 X para los experimentos de microinyección.
11. Macroscópicamente la posición de punta de la aguja en posición vertical en relación con el centro de la lente del objetivo (Esto acelerará la búsqueda de la punta de la aguja). Utilizar el microscopio con óptica de contraste de fase para mover la punta de la aguja en el plano horizontal en relación con el campo de visión, en un plano óptico bien-por encima de la capa de células.
    Nota: La aguja inicialmente aparece como una sombra en el campo de visión y entonces el plano de enfoque se puede ajustar para visualizar la punta. Una vez que se encuentra la punta de la aguja, reducir gradualmente el plano óptico seguido por la punta de la aguja a una posición cerca de la capa de células.
12. Compruebe el flujo de la aguja al cambiar a un canal fluorescente cuando se utiliza dextrán fluorescente y ajustar el flujo mediante el dispositivo de presión para obtener un flujo constante de "fondo".
    Nota: En este artículo, describimos la inyección manual, que es mediada por romper la membrana del plasma vía tocar la célula superficial y suave movimiento de la punta de la aguja durante el flujo constante de la aguja. Esto debe ser distinguido de los dispositivos de inyección automática acompañados por aumento de presión baja y la aguja aguja programada durante los eventos de la inyección, que son más apropiados para la inyección de un número de celular seguido por una población celular más adelante Análisis. El método descrito aquí está optimizado para el análisis unicelular por microscopia de lapso de tiempo antes, durante y después de la microinyección.
13. Encontrar una célula de interés y poco a poco baje la aguja por encima de la celda.
14. Cuando esté listo para microinject, baje la aguja poco a poco hacia la región perinuclear de la célula con el piñón fino del joystick de instrumental quirúrgico, manteniendo las células en el foco.
15. Para microinyección, toque suavemente la membrana plasmática de la célula, que puede ser suficiente para penetrar en la célula, o ayudar a ruptura de la membrana transitoria por un golpecito muy suave en la configuración del microscopio.
    Nota: Un punto blanco en la punta de la aguja indicará el tiempo de contacto con la membrana plasmática; Tras la ruptura de la membrana, se vuelva a sellar la punta de la aguja, acompañado de un suave flujo de la solución de la inyección dentro de la célula.
16. Detener el proceso de la inyección tan pronto como el flujo en la celda es visible (idealmente dentro de 0.3 s) moviendo la punta de la aguja en el medio. Cuando se utiliza dextrán fluorescente, inyecciones de éxito se pueden documentar inmediatamente por fluorescencia.
17. Si lo desea, iniciar la adquisición de imágenes de lapso de tiempo antes o después de la microinyección.
    Nota: Aplicación Local de medicamentos o inhibidores puede ser ejecutado en todos los pasos, excepto la microinyección evento propiamente. Para aplicaciones locales, la difusión de la molécula activa puede ser controlada por la presión de flujo, documentada por fluorescencia y punta de la aguja puede colocarse a la altura deseada. Ejemplos de experimentos de aplicación local, ver por ejemplo, pequeño y Rottner¹⁴ o Kaverina et al. ¹⁵
18. Tras la microinyección, espere hasta que se produce el efecto de la proteína. Para diversas proteínas y dependiendo de los resultados esperados, tiempos de incubación pueden variar. Para el pequeño GTPase Rac1, la respuesta de formación de lamellipodium puede ser iniciado dentro de 1 min o menos, pero tarda aproximadamente 10-15 min en promedio a desarrollar completamente (figura 1g, h).
19. Juzgar la viabilidad de las células después de la microinyección.
    Nota: Las inyecciones inapropiadas o dañinas pueden causar daño celular, que con frecuencia se acompaña de retracción del borde celular inespecífica o ruptura de la membrana plasmática.
    1. Evite meter a través de la membrana del plasma superior e inferior, que puede ocurrir para inyecciones en las regiones planas celulares.
       Nota: Los volúmenes de inyección deben mantenerse a un mínimo (idealmente < 5% del volumen celular) y generalmente en la gama de femtoliter. Requiere volúmenes de inyección también pueden ser controlados por cambios en la concentración, pero tenga en cuenta que para las proteínas, las concentraciones de > 2 mg/mL puede ser impráctico debido a la obstrucción frecuente aguja. Sin embargo, esto también depende de la calidad y el comportamiento de la proteína purificada; por ejemplo, inyección de la actina fluorescente acoplado es complicada por polimerización dependiente de la concentración e inevitable en la punta de la aguja, y tan raramente se ejecuta hoy en día (véase pequeño et al. ¹⁶).
20. Antes, durante, o después del efecto de la microinyección, FRAP o fotoactivación se puede realizar en la misma célula (véase la sección 5 y 6).

5. procedimiento de FRAP

1. Transfectar el tipo de la célula de interés (aquí células B16-F1) con el plásmido DNA codificando una proteína fluorescente etiquetado de interés (aquí, se utilizó una versión etiquetada de EGFP de β-actina). Semilla de las células sobre cubreobjetos recubierto de laminina (paso 2.10).
2. Montar la cámara de proyección de imagen (sección 3).
3. Utilice la siguiente configuración para lamellipodial región fotoblanqueo: energía del laser de 65 mW (variable según configuración y láser experimental de la fuente); diámetro de haz de láser pixel 10; bleach del 1 ms tiempo dwell/pixel; tiempo de exposición de la GFP de 500 ms; intervalo de tiempo ms de 1.500. Resultados experimentales en este trabajo se realizaron con un objetivo de 100 X 1.4NA apocromática.
4. Realizar la calibración del láser para asegurar la precisión en las dimensiones de la región de photobleached. Antes de la calibración, mueva el campo de visión a una zona que carece de cualquier señal de las células de la fluorescencia y observar la imagen en la pantalla.
5. Seleccionar la magnificación objetivo pulsando el botón de ampliación respectiva y reducir la potencia del láser (3 – 5 mW) en el "Panel | Menú de intensidad". Para iniciar la calibración manual en Visiview software (v2.1.4), seleccione la "configuración | FRAP"menú y haga clic en el" calibrar | Menú de ajuste Manual". Asegúrese de que el láser puede ser distinguido como un punto fuerte. Si no, reorientar o ajustar el hardware de láser.
6. Realizar la calibración manualmente guiar el láser a las coordenadas de determinado software X-Y. Esto indica el software cómo específicamente apuntar el láser a una región definida por el usuario para la ampliación actual.
7. Antes de accionar el láser, cambiar el canal del GFP e iniciar la adquisición de imagen/tiempo transcurrido.
8. Extraer manualmente la región para ser photobleached en el canal GFP, mientras mira la pantalla.
9. Iniciar fotoblanqueo un disparo manual del laser 405 nm, por lo menos 3-4 marcos después de la iniciación de la adquisición de la imagen. Adquisición de Marcos antes de photobleaching es necesaria para la normalización de la imagen en posterior análisis de datos.

6. fotoactivación procedimiento

Nota: Software, instalación de microscopio y ajustes, excepto la energía del laser, son similares a los de FRAP. En la fotoactivación, una diferencia importante en comparación con el FRAP, que es una potencia de 405 nm láser significativamente menor que la que empleó para fotoblanqueo se deberá utilizar, activar PA-GFP sin simultáneamente fotoblanqueo se.

1. Transfectar conjuntamente el tipo de la célula de interés (B16-F1 células aquí; vea paso 2.5) con el plásmido ADN codificación PA-GFP-actina y otra proteína marcada con fluorescencia (p. ej., mCherry o mCherry-Lifeact).
   Nota: En la mayoría de los casos, las células positivas mCherry también será positivas para el vector PA-GFP-actina, este último generalmente no es visto en el canal GFP antes de fotoactivación. Para mejorar la posibilidad de que las células positivas mCherry también son positivas para el PA-GFP, usar una proporción de 1:2 la transfección de mCherry:PA-GFP-actina. Siguiendo este protocolo, más del 90% de las células expresando mCherry muestra activación con éxito de la PA-GFP-actina.
2. La semilla las células B16-F1 en cubreobjetos recubierto de laminina (paso 2.10).
3. Montar la cámara de proyección de imagen (sección 3).
4. Antes de iniciar los experimentos de fotoactivación, si es necesario, realice la calibración del láser para el objetivo seleccionado (paso 5.4-5.6).
5. Establece la adquisición de la imagen GFP/488 nm en el intervalo del tiempo de exposición y 1.500 ms de 500 ms (dependiendo del diseño experimental).
6. Ajustar la configuración de software para adquirir películas de Time-lapse dual-channel o triple channel marca la Plaza de la "Serie de longitud de onda" y seleccionando el número deseado de canales en la "adquisición | Menú de longitud de onda". Se recomienda que las películas de lapso de tiempo se adquieren con contraste de fases y canales de GFP.
   1. Opcionalmente, también incluyen el canal mCherry; sin embargo, exponer las células con demasiada luz puede inducir fotodaño. Esto podría evitarse con depuradores de oxígeno como Oxyrase¹⁷, aunque el tratamiento eficaz requiere sellado de cámara de celular.
7. Encontrar las células transfected en el canal mCherry.
8. Antes de accionar el láser, iniciar la adquisición de lapso de tiempo imagen y dibujar manualmente la región para ser fotoactivado en el canal de contraste de fase, mientras que la pantalla de visualización.
9. Iniciar un disparo manual de la 405 nm láser de fotoactivación (intensidad situado entre 5 y 15 mW de la "Panel | Menú de intensidad"), por lo menos 3-4 marcos después de la iniciación de adquisición de imagen.

7. Análisis y presentación de resultados FRAP

Nota: El método se utiliza para investigar el volumen de negocios de una proteína que se acumula en los sitios de ensamblaje de actina dinámico, en este caso VASP, que asocia con los sitios de adhesión y las puntas que sobresalen lamellipodia. Estamos analizando su facturación en la punta de lamellipodium, pero pueden aplicarse los mismos principios de análisis para investigar el volumen de negocios de VASP o cualquier otra proteína y otros compartimientos subcelulares.

1. Abierta las películas Time-lapse derivan de Visiview en el software de Metamorph. En este artículo, fue utilizado v7.8.10 Metamorph.
2. Derivar valores de intensidad para las regiones photobleached por manualmente, exponiendo regiones respectivas en Metamorph. Dibujar una forma en la punta de la lamellipodium que cubre el todo o parte de la zona de photobleached y ajusta manualmente la posición en fotogramas posteriores si es necesario (es decir, si el borde sobresale), en orden al seguimiento de los cambios en intensidad de lamellipodial de componente respectivo durante el desplazamiento de la punta.
3. Para la corrección de fondo y el fotoblanqueo, analizar regiones dentro y fuera de la célula. Vea la figura 2una para regiones representativas de intensidades medidas.
4. Mientras está seleccionado un ROI, extraer sus valores de intensidad de Metamorph mediante el menú "medida | Medidas de la región". Asegúrese de "Tiempo transcurrido" y "Intensidad media" las opciones se seleccionan en el menú "Configurar". Haga clic en "Registro abierto" y seleccione "Intercambio dinámico de datos". Haga clic en "Aceptar" para abrir una hoja de cálculo de Excel y haga clic en el botón "Abrir registro" otra vez para pegar los valores de Metamorph en Excel.
   Nota: Estos valores se utilizan para generar las curvas de recuperación de fluorescencia.
5. Para generar las curvas de recuperación de fluorescencia en el extremo lamellipodium de las regiones de photobleached (normalizada a la intensidad de la región antes de fotoblanqueo), aplicar la siguiente ecuación:
      Ecuación 1
   donde: FRAP^Tn es la intensidad de la región de photobleached para cada marco de interés después de photobleaching; A^Tn es una intensidad región tomada fuera de la célula (fondo) para cada marco de interés después de photobleaching; Ins^Tn es dos un promedio dentro de región de intensidades para cada marco de interés después de photobleaching (utilizado para normalizar para adquisición de fotoblanqueo en el tiempo); FRAP^T-1 es la intensidad de la región de photobleached antes de photobleaching; ^T-1 es una intensidad región tomada fuera de la célula (de fondo) antes de photobleaching; y Ins^T-1 es dos un promedio dentro de región de intensidades para cada marco de interés antes de fotoblanqueo.
6. Para cada marco de tiempo de interés, utilice la ecuación 1 para obtener una curva de recuperación de fluorescencia que contiene todos los marcos de tiempo para investigar. La longitud del tiempo es estrictamente dependiente de la proteína bajo investigación. Cuando desconocidos, realizar experimentos preliminares para obtener la tasa de rotación de la proteína.
7. Para calcular el tiempo medio de recuperación, pegar los valores de la curva de recuperación de fluorescencia con el tiempo correspondiente (en segundos) en una parcela de Sigma (v.12) y realizar una curva de ajuste utilizando el "Dynamic Fit asistente | Herramienta de subida exponencial al máximo". Seleccionar mono exponencial (single, 3 parámetros) o bi-exponencial (doble, 4 parámetros) funciones, dependiendo de la mejor curva de ajuste.
8. Utilice la siguiente fórmula para la función exponencial de mono:
      Ecuación 2
9. Utilice la siguiente fórmula para la función exponencial bi:
      Ecuación 3
10. Pasta de parámetros "b" y "d" derivada de Sigma Plot (ecuación 2 o 3 de la ecuación) en Excel para calcular el tiempo medio de recuperación. Se aplican las siguientes ecuaciones:
       Ecuación 4
    o
       Ecuación 5
11. Cuando la función mono exponencial resulta en una curva precisa ajuste, aplique solamente la ecuación 4.
12. Cuando la función exponencial de mono no da como resultado una buena curva de ajuste, aplicar la fórmula exponencial bi resolviendo la ecuación 4 y la ecuación 5. Considerar las resultantes dos de medio tiempo de recuperación como la representación de dos fracciones diferentes de proteínas: una rapidez y una fracción lentamente intercambiando, respectivamente.

8. determinar la tasa de polimerización de la actinia Lamellipodial por FRAP

1. Para determinar la tasa de polimerización de actina lamellipodial, transfectar las células B16-F1 con EGFP-tagged β-actina, y photobleach la región de lamellipodial (paso de 5.9) con 1,5 intervalo de tiempo s y 500 ms GFP exposición.
2. Metamorph, abrir las películas Time-lapse de Visiview y calibrar la relación pixel/μm según el objetivo utilizado por la "medida | Herramienta para calibrar distancias".
3. Reproducir la película Time-lapse y parada en el marco de la recuperación de la fluorescencia de la lamellipodial, que fluye hacia atrás hacia la laminilla como una línea, ha llegado a la laminilla y no se puede rastrear flujo hacia atrás.
4. Medir la distancia en μm entre la punta de la lamellipodium y la parte posterior de recuperación de la fluorescencia. Esta distancia corresponde a la suma del flujo retrógrado y distancias de protrusión.
5. Por otra parte, para separar el saliente de flujo retrógrado, marca la punta de lamellipodial con una línea un marco antes el fotoblanqueo. Uso la línea como referencia el punto en posteriores marcos para referirse a la posición original de la punta de lamellipodium en el momento de photobleaching; el punto de referencia puede utilizarse para medir la distancia de protrusión y flujo retrógrado.
6. Tenga en cuenta el tiempo (en segundos) requerido para recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo para ocurrir. El tiempo puede ser calculado manualmente de la velocidad de fotogramas o visualizado por Metamorph a través de la "medida | Herramienta de medición de la región".
7. La tasa de polimerización de actina se derivan usando la siguiente ecuación (con algunos parámetros de la ecuación basadas en medidas de Metamorph de pasos 8.4 y 8.6):
      Ecuación 6
   donde tasa de polimerización de la actinia es en μm/min, flujo retrógrado distancia es en μm, lamellipodial saliente distancia es en μm, y el tiempo es en segundos.

9. Análisis de la difusión de proteínas y la movilidad en la fotoactivación

Nota: El método presentado aquí describe el análisis de la movilidad del monómero de actina empleando la fotoactivación de la actina fusionada a GFP de PA, como se ilustra por la visualización y cuantificación de la difusión de proteínas a través del citosol.

1. Para la medición de la difusión de la actina del photoactivatable una región citosólica, como la acumulación dentro de una región de lamellipodial, utilice Metamorph para determinar la intensidad con el tiempo en las siguientes regiones (ilustrado en la figura 3un ): una región citosólica fotoactivado (PA); una región de lamellipodial, en que fotoactivado se espera que las proteínas se acumulan con el tiempo (Lam); una región fuera de la célula utilizada para la normalización de la fluorescencia del fondo (hacia fuera).
2. Al determinar la movilidad de la actina en el citosol, medir distintas regiones citosólicas (ver figura 3a, regiones R1-R5). Tenga en cuenta que la adquisición de fotoblanqueo no puede determinarse de manera similar al FRAP, debido a un aumento en fluorescencia focal - y eventualmente toda la célula en la activación.
3. Transferir los valores de intensidad para todas las regiones de Metamorph en una hoja de cálculo de Excel, como se describe en el paso 7.4.
4. Para examinar la tasa de desplazamiento de la actina del photoactivatable de la región citosólica de fotoactivación o su tasa de incorporación dentro de una región de lamellipodial (ambos representados como intensidad porcentual de la región de fotoactivado citosólico al tiempo 0) , generación de curvas de fluorescencia de los datos en el paso 9.3. Se aplican las siguientes ecuaciones:
      Ecuación 7
      Ecuación 8
   donde: PA^Tn es la intensidad de una región citosólica fotoactivado por cada marco de interés después de fotoactivación; LAM de^Tn es la intensidad de una región de lamellipodial para cada marco de interés después de fotoactivación; A^Tn es la intensidad de una región tomada fuera de la célula (fondo) para cada marco de interés después de fotoactivación; PA^T-1 es la intensidad de una región citosólica fotoactivado antes de fotoactivación; LAM^T-1 es la intensidad de una región de lamellipodial antes de fotoactivación; ^T-1 es la intensidad de una región tomada fuera de la célula (de fondo) antes de fotoactivación; PA^T0 es la intensidad de una región citosólica fotoactivado a tiempo 0 (es decir, primer fotograma después de la fotoactivación); y^T0 es la intensidad de una región tomada fuera de la célula (fondo) a tiempo 0 (es decir, primer fotograma después de la fotoactivación).
5. Opcionalmente, para mejor visualización de los datos, normalizar las curvas de intensidad a 0 restando la intensidad del primer fotograma después de la fotoactivación de cada fotograma posterior.
   Nota: El siguiente método de análisis (pasos 9.6 – 9.8) permite también calcular la dispersión citosólica de la actina fotoactivado en el citosol.
6. Medir las intensidades para regiones citosólicas, que consecutivamente se colocan de distal de la región de activación.
7. Para representar las intensidades de estas regiones como intensidad porcentual de la región de fotoactivado a tiempo 0, aplicar la ecuación 8, donde se reemplazan lamellipodial intensidades con intensidades para cada ROI citosólica. El tamaño y el número de las regiones pueden variar dependiendo de la distancia de tamaño y dispersión de células a medir.
8. Para derivar un valor cuantificable para la tasa de proteína fotoactivado infiltrando cada región citosólica, pegar los valores de tiempo y de la curva de aumento de intensidad de fluorescencia para cada región en parcela de Sigma (similar al análisis del FRAP en la sección 7), use Ecuación 2 y 4 de la ecuación para obtener el tiempo de la intensidad de la fluorescencia alcanza una meseta. Comparar los valores de t_1/2 entre los diferentes grupos experimentales.

Results

G Figura 1 h Mostrar imágenes de contraste de fase de una célula de fibroblastos NIH3T3 previo y 10 min post-microinyección de Rac1, que es una pequeña GTPasa Rho-familia capaz de inducir la formación de lamellipodia a través de su interacción con la onda compleja. La celda se visualiza en primer lugar antes de la microinyección (figura 1g), para confirmar su viabilidad y morfología, por ejemplo, falta de lamellipodia. En 10 min post-microinyección, la célula ha cambiado claramente su morfología, que se espera de este tratamiento e indica una inyección exitosa (figura 1h).

Por sencillez y claridad, a continuación ofrecemos resultados ejemplares análisis FRAP y fotoactivación en células, que no han sido microinyectados además.

Análisis de la facturación de VASP tagged EGFP en la punta de lamellipodium se muestran en la figura 2a-f. Tenga en cuenta que VASP apunta además a adherencias focales y nacientes, puntos pequeños y alargados en la celda interior^18,19. La intensidad de fluorescencia de una región lamellipodial con una clara acumulación de la VASP en la punta fue blanqueada y medida para cada marco temporal, siguiendo el contorno del ROI antes, durante y después del blanqueamiento como el lamellipodium sobresale a remite. Como blanqueado de EGFP-VASP de proteínas están siendo recicladas por moléculas no blanqueada en estos sitios, la gradual recuperación de la fluorescencia se observa (figura 2b). La curva de recuperación FRAP obtiene de esta manera y normalizado a la intensidad de la lejía (expresada como 1) puede verse en la figura 2c. Eficiencia de fotoblanqueo puede variar y fue aproximadamente el 20% del valor antes en este ejemplo, como determinada por el valor de t0 (el primer fotograma después de photobleaching). El aumento de la fluorescencia alcanza una meseta en el ejemplo mostrado en aproximadamente un 80% de la fluorescencia antes. En una estructura estática durante el curso del tiempo del experimento, como una adhesión focal, la diferencia entre la intensidad de la lejía y la fluorescencia de la Meseta alcanzado después de recuperación se define como la fracción inmóvil (IF, flecha roja en la figura 2 c, e), mientras que la cantidad de fluorescencia se recuperó entre el tiempo de recuperación blanqueo y completo se define como la fracción móvil (doble flecha verde en la figura 2c, e). Tenga en cuenta que en una estructura dinámicamente cambiante como la punta de lamellipodium analizada aquí, el alcance del IF puede no sólo representan las moléculas inmóviles, pero también derivan de una reducción de la velocidad de la protuberancia, como intensidad de EGFP-VASP se sabe que dependen de este parámetro¹⁸. Para calcular el tiempo medio de recuperación, una curva de ajuste se creó el trama de la Sigma (figura 2d). En este caso, el valor del parámetro "b" extraído de resolver la ecuación 2 es igual a 0.0754, que cuando aplica a la función logarítmica (ecuación 4) resultados en un tiempo medio estimado de recuperación de 9.19 s (figura 2d , grupo de extrema derecha), que es relativamente rápido en esta celda particular en comparación con el promedio publicaron anteriormente⁵. Debe ser observado que media-tiempos de recuperación pueden a veces varía de célula a célula dentro de la misma población. Por lo tanto, para la obtención de resultados representativos, se recomienda determinar este parámetro como un promedio de al menos 15-20 células. Para ilustrar el grado de variación, medios aritméticos de EGFP-VASP recuperación promedio de 15 celdas para cada punto del tiempo fueron generados (figura 2e), y curva promedio creado y mostrado de una manera similar (figura 2 f).

La tasa de polimerización de la red de actina lamellipodial compone de la suma de protrusión hacia delante de la red y flujo retrógrado. FRAP puede ser aplicado para medir la tasa de polimerización de la actinia de transfectar células (en este caso B16-F1) con etiquetado de EGFP β-actina y photobleaching una protuberante región de lamellipodial (figura 2g). Para el análisis de la polimerización lamellipodial de la red de actina, se evalúa la recuperación de fluorescencia sobre blanqueo de EGFP-tagged β-actina en el tiempo. Como la polimerización de progresa de monómeros de actina en los extremos de púas de los filamentos de actina lamellipodial (que todos apuntan hacia el frente²⁰), la red está constantemente desplazados hacia atrás y avanzando hacia adelante, las tarifas que pueden ser fácilmente obtenidos a través de polarizado recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo. Recuperación de fluorescencia de la lamellipodium es completa tan pronto como la zona blanqueada ha llegado a la zona de transición entre la parte posterior de la lamellipodium y las láminas, que se caracterizaron por una baja densidad de haces de filamentos dispuestos en horizontal más dar la vuelta mucho más lentamente que lo que se observa en la lamellipodium. Como se ilustra en la figura 2g, recuperación de fluorescencia puede visualizarse como una línea horizontal al borde y que fluye hacia atrás hacia la laminilla, que permite medir las distancias de protrusión y flujo retrógrado (representado individualmente en el panel derecho del figura 2g como naranjas y rojas flechas de dos puntas, respectivamente).

También hemos aplicado fotoactivación en B16-F1 en células transfectadas con GFP-PA-actina de la movilidad de los monómeros de actina en el citosol y la tasa de su incorporación en la que sobresalen lamellipodia. Como se ilustra en la figura 3a, b, una región citosólica fue fotoactivado por la exposición a un 405 nm láser, mientras que las imágenes fueron adquiridas en la GFP canal cada 1,5 s para visualizar la distribución de la GFP-tagged, fotoactiva actina. Photoactivated GFP-actina puede verse difunde fuera de la región citosólica en la figura 3b. La tasa de disminución de intensidad de fluorescencia en la región citosólica de fotoactivado está representada como el porcentaje de la intensidad inicial en t0 (primero marco después de la fotoactivación; Figura 3 c). fotoactivado actina también se integra en la punta del lamellipodia, donde se añaden nuevos monómeros de actina en los extremos de púas creciente de alargar filamentos de actina durante la protrusión. Para estimar la tasa de incorporación de lamellipodial, medimos la intensidad de fluorescencia con el tiempo de una contorno o región bidimensional de aproximadamente 5 μm de ancho y 1 de altura; la región era constantemente volver a colocar en la punta de la lamellipodium que asomaba. Incorporación de actina fue representado como el porcentaje de intensidad de fluorescencia de la región citosólica fotoactivado en t0 (figura 3d). Mientras que progresó el alargamiento de los filamentos de actina, se incorporaron nuevos monómeros de actina en el frente de lamellipodial. Una fracción de estos monómeros de actina estocástico se deriva de la piscina cytosolic donde monómeros fueron fotoactivado. Esto se traduce en el rápido aumento de la fluorescencia en lamellipodia en los primeros 20 s después de la fotoactivación. Como se añaden monómeros de nuevo al frente del lamellipodial, flujo de monómeros de actina previamente incorporado con filamentos hacia la laminilla por flujo retrógrado. Con el tiempo, el retorno de la inversión está completamente lleno de monómeros fluorescentes y se llega a una meseta en fluorescencia (figura 3d). Una caída gradual en la fluorescencia entonces se observa cuando, tras la difusión de monómeros fotoactivado a lo largo de la célula, no fotoactivado monómeros de actina son cada vez más que volver a agregar al frente lamellipodial. Esta disminución de la fluorescencia encuentra una nueva meseta, que se alcanzará tan pronto como se llega a un equilibrio en toda la célula entre monómeros fotoactivado y no fotoactivado (datos no mostrados).

La movilidad de los monómeros de actina en el citosol se deriva mediante la medición de intensidades de fluorescencia en las regiones de igual tamaño posicionada distal de la región de fotoactivado (ejemplificada en la figura 3una por regiones de colores con la etiqueta R1-R5). Como se ilustra en la figura 3e, intensidad de fluorescencia en cada una de estas regiones está disminuyendo gradualmente lejos de la cytosolically región de Fotoactivado, como la fracción de monómeros de actina fotoactivado se convierte cada vez más diluido con no activado monómeros (es decir, no fluorescente). Además, se llega al pico de fluorescencia más adelante: más lejano la región medida se encuentra desde la región de Fotoactivado, más tiempo que se requiere para los monómeros de actina difundir en estas regiones. Un valor representativo para el grado de infiltración de monómeros de actina en cada región se puede derivar por cuantificar el tiempo medio de llegar a la meseta de fluorescencia. Más distante de la región, más tiempo tarda para que la actina de fotoactivado a difundir en él, y así más tiempo se requiere para la meseta fluorescente hasta llegar, en última instancia conduce a un valor mayor de_1/2 t (figura 3e).

Figura 1 : Procedimiento de montaje y microinyección del compartimiento de la proyección de imagen. (a) proyección de imagen de cámara de componentes. (b) silicona grasa es manchada con cuidado alrededor de la abertura de un sellador plástico. (c) el cubreobjetos se coloca con el lado de la célula hacia arriba en el centro de la imagen cámara de apertura. (d) un seguro sello establecido colocando el sellador plástico encima el cubreobjetos y apretando las abrazaderas laterales. medio (e) microscopía se pipetea en la ranura de la cámara. (f) la sala de proyección de imagen se coloca en la platina del microscopio, electrodos y detector de calor están vinculados a una unidad de calefacción preajustado a 37 ° C, y las células pueden adaptarse para por lo menos 30 minutos antes de inicia la microscopia. En este ejemplo, la platina del microscopio también está equipada con un instrumental quirúrgico para la realización de microinyecciones, y la aguja de la microinyección se sumerge en el medio que cubre la capa de células en la cámara de proyección de imagen. (g) NIH3T3 un celular de fibroblastos es visualizado antes de microinyección por microscopia de contraste de fase. La Cruz Roja en el compartimiento perinuclear indica la ubicación de la futura microinyección, que corresponde a una región citoplásmica alta debido a la proximidad al núcleo voluminoso. (h) 10 minutos después de la microinyección con Rac1, la célula reacciona por la formación prominente de lamellipodia alrededor de la periferia de la célula entera (indicada por las flechas verdes). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: FRAP permite determinar índices de polimerización de la actina del volumen de ventas o lamellipodial proteína. (un) representante ejemplo de celda B16-F1 expresaban EGFP-VASP antes de fotoblanqueo de una región de lamellipodial como se indica. Formas de contornos diferentemente coloreadas están etiquetadas para indicar que las regiones se consideraron para las mediciones de intensidad de fluorescencia con el tiempo. Nota el contorno rojo marcado con un signo de exclamación, que etiquetas una región citosólica colocada en un área que contiene múltiples vesículas y volantes de superficie celular. Áreas dinámicas como esta deben evitarse para seleccionar regiones de referencia de fluorescencia, ya que se caracterizan por fuertes fluctuaciones a corto plazo de la fluorescencia, puede provocar resultados inexactos. (b) Lamellipodial región de la célula expresan EGFP-VASP antes y después de photobleaching. Se visualiza la recuperación de la señal fluorescente después de photobleaching dentro de la región marcada en morado con el tiempo. La flecha indica la punta de un microspike, enriquecido por VASP probablemente debido a la alta densidad de filamentos de la actinia polimerización allí¹⁹. curva de recuperación (c) un ejemplo de un FRAP como derivado de la cuantificación de la intensidad fluorescente de lamellipodium photobleached (contorno púrpura) en b. rojo y líneas verdes a la derecha indican, respectivamente, fracciones inmóviles y móviles. (d) una forma de la curva de recuperación FRAP en c (panel izquierdo) y un ejemplo del método de cálculo utilizado para obtener el tiempo medio de recuperación (panel derecho). (e) un ejemplo de una recuperación FRAP curva deriva de un promedio de las curvas de recuperación de fluorescencia de 15 células, con barras de SEM que indica el grado de variabilidad dentro de la población de muestra. (f) una curva de ajuste se deriva de un promedio de los ajustes de la curva de recuperación FRAP de 15 células (panel izquierdo) y un ejemplo del método de cálculo utilizado para obtener el tiempo medio de recuperación (panel derecho). (g) paneles de Time-lapse de salientes lamellipodium de una celda B16-F1 expresaban EGFP-tagged β-actina antes y después de blanqueamiento de una región de lamellipodial como se indica, seguida de recuperación de fluorescencia en el lamellipodium con el tiempo. En el panel de la derecho, los valores medidos de protrusión y se proporcionan distancias retrógradas (en naranja y rojo, respectivamente). Cálculos bajo los paneles de imagen revelan cómo la suma de distancias retrógradas y protrusión se utilizan para derivar la tasa de polimerización de la red de actina lamellipodial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Fotoactivación de la PA-GFP-actina para monómero seguimiento a lo largo de la célula. (a) A ejemplo de una celda B16-F1 expresando GFP-PA-actina antes de dispararla fotoactivación en una región citosólica según lo indicado por el círculo rojo (PA). Contornos coloreados diferentemente están etiquetados para indicar que las regiones se consideraron para las mediciones de intensidad de fluorescencia con el tiempo. (b) una ilustración de la distribución temporal de los siguientes PA-GFP-actina fotoactivación. Tenga en cuenta la reducción gradual de la fluorescencia en el Fotoactivado, región citosólica (círculo rojo), como la actina fotoactivado difunde lejos de ella. Debido a su difusión a la frente y en la red, monómeros de actina fotoactivado se mejoran gradualmente en lamellipodia (región de cian) y en el citosol (regiones colores diferentes) en una forma dependiente de la distancia y del tiempo. (c) representante, temporal disminución de fluorescencia dentro de la región citosólica fotoactivado (contorno rojo en b). (d) Temporal de cambios en la intensidad de fluorescencia en la región de lamellipodial (cian contorno en b). (e) las curvas representativas de los cambios temporales en la intensidad de fluorescencia de regiones citosólicas (color-coded en b) debido a la colocación en distancias variables de la zona de fotoactivación. Nota cómo medios tiempos de llegar a la fluorescencia de la meseta (indicado en la leyenda a la derecha) aumentan con la distancia de dado la región a la zona de fotoactivación, probable correlacionar con la mayor veces necesarios para la difusión de monómeros de actina en la región respectiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Aquí discutimos los pasos críticos en las técnicas descritas en este artículo, y cómo puede ser optimizados para el uso en diferentes condiciones experimentales.

Microinyección es un método que puede aplicarse para controlar en las células de los efectos inmediatos de introducir proteínas exógenas, inhibidores o medicamentos. Puede ser particularmente ventajoso para la determinación de las funciones de las proteínas en difícil para transfectar tipos de la célula o en situaciones cuando no se desea la expresión a largo plazo. Debe ser observado que la supervivencia de ciertos tipos de células varía dependiendo de la matriz extracelular que se siembran en. Más endoteliales, epiteliales y fibroblasto-como tipos de la célula, incluso pequeños como peces queratocitos (véase Dang et al. ²¹ y Anderson y Cruz²²) se pueden inyectar con éxito. Sin embargo, hay excepciones, como las células B16-F1 sembradas en laminina, que constituyen un sistema modelo excelente de migración de la célula, pero son incompatibles con la inyección en este tipo de sustrato por razón desconocida. De células de fibroblastos NIH3T3, realizamos rutinariamente inyecciones sobre sustrato de fibronectina y técnicas de Fotomanipulación adicional como FRAP (incluso con fotoactivación; se muestra para las células B16-F1 aquí) puede ser igualmente bien realizada en estos fibroblastos (véase por ejemplo, Köstler et al. ³). también se debe considerar que las proteínas diferentes, según sus propiedades funcionales y los objetivos del experimento, pueden tomar diferentes cantidades de tiempo para provocar cambios, varían de segundos a horas. Una ventaja de la técnica es que la dosificación o concentración del agente exógeno puede ser controlada con mayor precisión en el nivel unicelular que por ejemplo, cuando se usa la transfección del plásmido. Además, el marcaje fluorescente de una proteína no es una necesidad para garantizar su presencia en la célula, que puede aumentar la flexibilidad si se requiere visualización simultánea de varios canales de otras proteínas con etiqueta fluorescente. Microinyección puede ser particularmente útil para el análisis instantáneos efectos de mezclas de proteína o de proteínas específicas en los cambios dinámicos de la morfología celular o citoesqueleto (p. ej., Dang et al. ²¹ un ejemplo de efectos instantáneos en migración por el inhibidor complejo Arp2/3 Arpin). Una desventaja de la técnica es su invasividad, que puede causar daño celular o influir en la morfología de la célula. Por lo tanto, una consideración importante cuando se realizan microinyecciones está monitoreando la viabilidad celular. El método introducido aquí se basa en la manipulación manual. En condiciones probadas para ser compatibles con éxito inyecciones, como fibroblastos creciendo en sustrato de la fibronectina, el protocolo de inyección manual descrito aquí permite una tasa cerca del 100% de éxito; Esto es esencial cuando se combina este enfoque con experimentos seguimiento sofisticados y desperdiciador de tiempo incluyendo microscopia video o FRAP, publicado anteriormente³. Esto no excluye que de vez en cuando, las células individuales podrían sufrir de un evento de la microinyección, que puede ser reconocido con seguridad por los abruptos cambios de contraste del núcleo y el citoplasma, seguido por retracción del borde de la célula. Estos raros casos experimentales están excluidos y no considerados así para mayores análisis.

Sin embargo, un enfoque automático de media también utiliza comúnmente, empleando por ejemplo rápido (< 300 ms) aguja máquina controlada bajando coincidente con el aumento de la presión de inyección, por lo que la aguja sólo tiene que colocar encima de cada célula antes de la respectiva inyección. La tasa de éxito de las inyecciones mitad-automático es por definición más baja que el método manual descrito arriba, simplemente porque está optimizado para velocidad, seguido por el análisis de varias celdas que sobrevivió con éxito este tratamiento; así no se basa en inyección exitosa de una célula individual. Por lo tanto, en comparación con análisis unicelular, mitad-automático inyecciones mejor son adecuadas para analizar los efectos de la inyección de varias cientos de células, por ejemplo, por video microscopio a bajo aumento o fijación de células y tinción. Cualquiera que sea el enfoque detallado empleado, microinyección no constituye un análisis de punto final, pero puede combinarse con una variedad de técnicas, incluyendo FRAP o fotoactivación³.

Al determinar la tasa de rotación de la proteína por el FRAP, la intensidad del láser debe optimizarse, dependiendo de las condiciones de instalación y proyección de imagen del microscopio (ampliación, objetivos, etc., así como el tipo de célula, estructura y proteína fluorescente para fotoblanqueo). Tenga en cuenta que en la energía del láser óptimo, eficiente blanqueo se combina con el fotoenvejecimiento lo menos posible, para evitar la contracción o la completa retracción de la estructura bajo análisis (por ejemplo, lamellipodia o filopodios) o incluso daños a nivel celular. Idealmente, al menos el 70-80% de eficacia de blanqueo se debe alcanzar, aunque blanqueo completo puede verse obstaculizado por rotación extremadamente rápida de la proteína, en cuyo caso, algo superior al 50% también podría ser aceptable. Poder blanqueador óptimo para una estructura dada y un tinte fluorescente debe probarse experimentalmente, a partir de una potencia de láser de baja seguido de su aumento gradual. Por supuesto, cualquier colorante fluorescente puede por definición ser blanqueado con laser de luz cerca de su punto máximo de excitación (488 nm para tintes verdes utilizados tales como FITC o EGFP). Sin embargo, láseres con longitudes de onda más cortas, como cerca de UV, láser ofrecen potencias superiores y así pueden utilizarse también para el blanqueo eficaz de colorantes utilizados. Habitualmente utilizamos un láser de diodo de 405 nm (120 mW) para el blanqueo de EGFP y tintes fluorescentes rojos (como mCherry), aunque con eficacia ligeramente inferior en el caso de los última (datos no mostrados). Como el 405 nm-diodo también puede ser utilizado para la fotoactivación de PA-GFP (véase abajo), dota a este sistema de máxima flexibilidad.

Para las estructuras de células B16-F1 y proteínas fluorescentes photobleached aquí, se aplicaron 405 poderes nm-láser entre 65 – 100 mW. Al analizar una región photobleached, es importante considerar si la estructura dada se conserva en su forma original sobre el análisis de periodo de tiempo. Por ejemplo, al analizar el volumen de proteínas en las puntas lamellipodia, debe tenerse cuidado si la curvatura del lamellipodia es alterada con el tiempo, como cambios en curvatura podrían conducir a resultados inexactos si el región/contorno analizado no abarcar plenamente la totalidad de la estructura en cada marco de la medida. Además, debe señalarse que paquetes incrustados en lamellipodia, como microspikes, pueden causar desviaciones en la intensidad de la fluorescencia. Como se ilustra en la figura 2b (flecha blanca en 9 s de tiempo), una estructura microspike está situada junto a la región de photobleached medido, pero permanece fuera de él durante toda la duración de la medida y así no hace ninguna inexactitud. Para el análisis de la facturación de la proteína, consideraciones importantes al seleccionar la ubicación y el tamaño de analiza regiones son que su fluorescencia con el tiempo debería no ser significativamente influenciado por cambios en la morfología de la célula o factores que duro para evitar adquisición de fotoblanqueo. Por ejemplo, estructuras proporcionando la contribución cuantitativa a la estructura analizada no deben moverse fuera de la región medida durante el análisis; Además, entidades sin relación, fluorescentes como estructuras vesiculares que atraen a la proteína no deben entrar el campo de interés durante el análisis. Para la determinación de la tasa de polimerización de la actina lamellipodial, debe tener cuidado que ninguna cuerda o fruncido (es decir, doblar hacia arriba) lamellipodia son analizados, ya que esto influenciará fuertemente la exactitud de los resultados. Además, retracción del lamellipodial regiones puede aparecer como desplazamiento hacia atrás rápido, potencialmente hacia la sobreestimación de las tasas de polimerización de la actina lamellipodial. Una consideración adicional es la distancia de las regiones de normalización intracelular (tomado como posiciones de referencia para la corrección de fotoblanqueo de adquisición) de la posición actual de fotoblanqueo, que debe ser lo suficientemente grande como para evitar directo influencia de la zona de photobleached.

Al crear las condiciones óptimas para la fotoactivación de PA-GFP-tagged construcciones, se debe tener cuidado para evitar blanqueamiento instantánea durante la fotoactivación. En nuestro trabajo, los mejores resultados se obtuvieron con potencias láser 5 - 10 veces inferior al normalmente empleado para el blanqueo de EGFP. Para adquisición de imágenes de moléculas Fotoactivado, tiempo de exposición y el intervalo de tiempo entre fotogramas deben ser optimizados teniendo en cuenta el tamaño de las regiones y estructuras a ser fotoactivado y analizados, así como la movilidad potencial de fotoactivado proteínas a otras localizaciones subcelulares. En cuanto a todo tipo de imágenes por fluorescencia, mantenimiento de la viabilidad celular es crucial para la obtención de resultados relevantes fisiológicamente.

En principio, photoconversion de verde a rojo de proteínas fluorescentes como mEos o Dronpa variantes¹² constituye un método igualmente poderoso de la siguiente dinámica y volumen de negocios de estructuras subcelulares como el lamellipodium (véase por ejemplo, Burnette et al. ²³). la ventaja de este último método en lugar de PA-GFP sería la posibilidad de seguir la dinámica de proteínas antes y después de la conversión con dos colores distintos, sin la necesidad de expresar Co una proteína fluorescente roja adicional. Sin embargo, en nuestros experimentos preliminares, la magnitud del cambio de contraste y la intensidad de la señal fluorescente conseguido con fotoactivación de PA-GFP fueron mayores en comparación con las sondas photoconverted, tal vez debido a las características espectrales superiores verde versus rojo sondas fluorescentes (datos no mostrados). En cualquier caso, estudios de detalle de facturación de filamento de actina en protuberancias celulares edge como lamellipodia o colas de actina inducida por el virus de Vaccinia hasta ahora sólo han publicado usando PA-GFP derivados^5,6,24.

Cuando se considera qué región de células a analizar después de fotoactivación, varios factores deben tenerse en cuenta, que se discuten con el ejemplo se muestra a continuación (incorporación de monómeros de actina en el borde de la célula en la activación en el citosol), pero ciertamente puede ser extrapolado a diferentes problemas científicos análogos. En primer lugar, cuando mide la tasa de incorporación de lamellipodial de cytosolically fotoactivado proteínas, por ejemplo, en distintas condiciones experimentales (como se muestra en Dimchev et al. ⁶), tamaños de regiones citosólicas y sus distancias a los bordes de la lamellipodial deben ser comparables entre los grupos experimentales. También es importante considerar cuando photoactivating regiones citosólica, el grueso de la célula es mayor en las posiciones más cercanas al núcleo. Activar regiones celulares más gruesas podría producir mayores cantidades de proteínas activadas, dado que la distribución de la proteína para ser activa se distribuye homogéneamente en el citosol. Por último, niveles de expresión de la proteína para ser activa sin duda pueden ser muy variables en las células individuales. Debido a todas estas consideraciones de variabilidad, es fundamental comparar niveles de incorporación de proteínas cytosolically activados en otras partes de la célula en relación con la fluorescencia total obtenida después de la activación en las regiones específicas.

Hemos descrito cómo microinyección puede ser utilizado como una herramienta para investigar los efectos de las proteínas en la morfología celular y han ejemplificado este demostrando la potente inducción de estructuras lamellipodial en NIH3T3 células fibroblastos microinyectadas con los pequeño GTPase Rac1. Previamente hemos aplicado esta técnica para interferir con la función de Arp2/3 en las células microinyectados con el dominio c-terminal WCA de cicatriz/WAVE³. Varios parámetros en células microinyectados pueden ser analizados por otros ensayos, como el FRAP o fotoactivación. Hemos descrito cómo FRAP y fotoactivación pueden emplearse para investigar la dinámica subcelular y la movilidad de los monómeros de actina. FRAP ha sido utilizado por nuestro grupo anteriormente⁵ investigar el volumen de negocios de proteínas localizar a lamellipodia, como VASP, Abi, cortactina, cofilin y recubrimiento de proteína o para dilucidar el volumen de negocios de componentes de adherencias focales en la presencia y ausencia de señalización⁴Rac. Por otra parte, medir índices de polimerización de la actinia puede lograrse por photobleaching tagged EGFP β-actina⁵, pero existen métodos alternativos. Seguimiento inhomogeneidades fluorescentes como se ve por las puntas de prueba compatible con la proyección de imagen de células vivas etiquetado filamentos de actina celular, tales como Lifeact²⁵, también puede ser empleado^6,26. La ventaja aquí es que la sobreexpresión de β-actina se puede evitar, que es capaz de aumentar la protrusión del borde de la célula y la migración y por lo tanto potencialmente interfiere con el ensayo específico o cuestión experimental (ver por ejemplo, Kage et al. ²⁶; Peckham et al. ²⁷). sin embargo, una clara desventaja de la sonda de Lifeact constituye su rápido encendido/apagado de la cinética de unión a filamentos de actina, por lo que blanqueo de actina filamentos estructuras etiquetadas por Lifeact en las células proporciona información sólo sobre el volumen de negocios de sonda, pero no el volumen de negocios de los filamentos de actina, a la que se une a²⁵. El seguimiento de inhomogeneidades fluorescencia empleado previamente^6,26 proporcionan un compromiso práctico, mucho similar al seguimiento ampliamente utilizado de fluorescencia puntos incorporados filamentosos citoesqueleto estructuras (ver por ejemplo, salmón y Waterman²⁸), pero puede no ser tan precisa como FRAP de estructuras etiquetadas de EGFP F-actina y como derecho hacia adelante para utilizar. Fotoactivación ha sido aplicada por nosotros para calcular las tasas de incorporación de actina monomérica que sobresalen lamellipodia, así como su movilidad en el citosol, en el contexto de F-actina citosólica sintonizado experimentalmente los niveles⁶. La técnica es útil al examinar la movilidad y distribución de proteínas derivadas de áreas relativamente grandes, como las regiones citosólicas. Sin embargo, examinando la distribución de proteínas derivados de estructuras fotoactivado relativamente pequeño; por ejemplo, conos de crecimiento pueden ser difíciles debido al bajo número de moléculas fluorescentes activados, señales débiles y así falta de sensibilidad. Posibles técnicas alternativas a la fotoactivación o photoconversion de la fluorescencia (ver arriba) pueden incluir inversa FRAP, que depende de toda la célula excepto el retorno de la inversión, seguido del seguimiento de la movilidad de las moléculas fluorescentes de fotoblanqueo esta región. La técnica no requiere overexpressing photoactivatable versiones de proteínas, pero siempre implica la exposición a una dosis inusualmente alta de energía del laser, puede provocar efectos colaterales no deseados como fotoenvejecimiento.

Claramente, fotoactivación y FRAP no pueden distinguir si las proteínas son móviles como monómeros, dímeros o incluso los pequeños oligómeros, y si se mueven en combinación con los socios de unión adicional. Ese tipo de información puede obtenerse en cambio de fluorescencia de las técnicas de espectroscopia de correlación²⁹ o, alternativamente, FLIM-FRET³⁰. Sin embargo, FRAP y fotoactivación constituyen enfoques sencillos evaluar directamente la dinámica local y global de la proteína en las células, independientemente de la proteína de interés, localización subcelular o tipo de célula estudiado.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B16-F1 células de melanoma de piel de ratón	Colección de cultivos tipo americano, Manassas, VA	CRL-6323
Células NIH-3T3	Colección de cultivos tipo americano, Manassas, VA	CRL-1658
DMEM 4,5 g/L glucosa	Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Alemania	41965-039
Ham' s F-12 medio	Sigma-Aldrich	N8641
Suero fetal de ternero  (FCS)	Laboratorios PAA, Linz, Austria	A15-102
Suero fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich, Alemania	F7524	Lot054M3396
MEM Aminoácidos no esenciales	Gibco, ThermoFisher Scientific, Alemania	11140035
L-Glumatine 200mM (100x)	Life Technolgies	25030-024
Pen-Strep 5000 U/mL	Life technologies	15070063
Piruvato de sodio (100 mM)	Gibco, ThermoFisher Scientific, Alemania	11360-039
Laminina	Sigma-Aldrich	L-2020
Laminina tampón de recubrimiento			De fabricación propia: 50 mM de Tris ph7.4, 150 mM
de NaCl Fibronectina de plasma humano	Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania	11 051 407 001
Jetpei	Polyplus Transfection, Illkirch, Francia	101-10N
JetPei	buffer Polyplus Transfection, Illkirch, Francia	702-50	150mM NaCl
PA-GFP-actina plásmido ADN			descrito en Koestler et al.2008
pEGFP-actina plásmido DNA	Clontech, Mountain View, CA, EE. UU
Proteína Rac1 para microinyección			Purificada como versión marcada con GST y escindida de GST antes de la inyección
Tampón			Hecho propio: 100 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl ph7.5, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT
Dextrano, Texas Red, 70.000 MW, Sondas moleculares fijables por lisina	, Thermno Fisher Scientific, Alemania	D1864
Microscopio cubreobjetos circulares 15 mm, n.º 1 y nbsp;	Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Alemania	1001/15
Puntas de microcargador Eppendorf Femtotips	Eppendorf, Hamburgo, Alemania	5242 956 003
Puntas capilares de microinyección Eppendorf Femtotip	Eppendorf, Hamburgo, Alemania	930000035
Grasa de silicona	ACC Silicones, Bridgewater, Inglaterra	SGM494
Cámara de imagen de baño de diamante abierto de aluminio	Warner instruments	RC-26
Controlador de temperatura automático	Warner Instruments	Microscopio TC-324B
: Axio Observer	Carl Zeiss, Jena, Alemania
Cámara CoolSnap-HQ2	Fotometría, Tucson, AZ
Fuente de luz Lambda DG4	Sutter Instrucment, Novato, CA
Fuente láser	Visitron Systems
	Eppendorf, Hamburgo, Alemania		Con compresor incorporado para el suministro de presión
Nikon Narishige Sistema de micromanipulación	Nikon Instruments, Japón
Visiview software v2.1.4	Visitron Systems, Puchheim, Alemania
Metamorph software v7.8.10	Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Sigma Plot v.12	Systat Software Inc.