Cuantificar la morfología de la microglía de microfotografías de la inmunohistoquímica preparado tejido con ImageJ

Resumen

Microglía son células inmunes del cerebro que encuesta y reaccionan a la fisiología alterada del cerebro a través de cambios morfológicos que pueden evaluarse cuantitativamente. Este protocolo describe un ImageJ basado en protocolos de análisis para representar la morfología de la microglia como datos continuos según métricas tales como ramificación de la célula, la complejidad y la forma.

Resumen

Microglia son fagocitos del cerebro que participan en la homeostasis cerebral y examinar continuamente su entorno por la disfunción, lesiones y enfermedad. Como los primeros respondientes, microglia tienen funciones importantes para atenuar la disfunción de la neurona y glia, y en este proceso, se someten a una amplia gama de cambios morfológicos. Morfologías de la microglia pueden clasificarse descriptivamente o, alternativamente, se pueden cuantificar como una variable continua para parámetros tales como ramificación de la célula, la complejidad y la forma. Mientras que los métodos para cuantificar la microglia se aplican a las células, algunas técnicas se aplican a múltiples microglia en una microfotografía todo. El propósito de este método es cuantificar múltiples y las células disponibles protocolos de ImageJ. Este protocolo es un resumen de los pasos y plugins ImageJ recomendadas convertir Microfotografías de campo claro y fluorescencia en imágenes representativas binarias y esqueletizadas y analizarlos utilizando plugins de software AnalyzeSkeleton (2D/3D) y FracLac para la recolección de datos de morfología. Morfología de la célula en términos de puntos finales del proceso, ensambladuras y longitud, así como complejidad, forma celular, descriptores de tamaño un resumen de las salidas de estos plugins. El protocolo de Análisis esquelético descrito es idóneo para un análisis regional de microglia múltiples dentro de un todo microfotografía o región de interés (ROI), mientras que FracLac proporciona un análisis de células individuales complementarios. Combinado, el protocolo proporciona un objetivo, la herramienta de evaluación sensible y completa que puede utilizarse para estratificar entre microglia diversas morfologías presentes en el cerebro sano y lesionado.

Introducción

Microglia tienen una respuesta inmediata y diversidad morfológica a las alteraciones en la fisiología de cerebro¹ a lo largo de un continuum de posibilidades que van desde morfologías hyper ramificación y muy complejas a la ramificada y ameboides morfologías² . Microglía también puede llegar a ser polarizado y barra-formado³. Ramificación de células de microglía se define comúnmente como una forma compleja con múltiples procesos y se divulga a menudo como el número de puntos finales por la célula y la duración de los procesos de la célula. Puesto que la microglia finalmente se ajustan a la función neuronal y glial a célula continua Charla cruzada y en vivo la motilidad^4,5, morfologías de microglia pueden servir como indicadores de diversas funciones y disfunciones en el cerebro. Un enfoque cuantitativo es necesario para describir adecuadamente la diversidad de estos cambios morfológicos y distinguir las diferencias entre las células ramificadas que se producen con sutiles perturbaciones fisiológicas (como la epilepsia^5,6 y conmoción cerebral⁷) además de lesión grave (como movimiento⁸). Un mayor uso de morfología cuantificación^{7,8,9,10,11,12,13,14} revelará la completa diversidad de morfologías de microglia en salud y enfermedad. El presente estudio los datos del progresivo uso de plugins ImageJ es necesario resumir la morfología de la microglía de fluorescentes o fluorescentes no Microfotografías de microglia adquirió en tejido fijo de roedor después de inmunohistoquímica (IHQ).

Central a las técnicas de análisis aquí descritas son el ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)¹⁵, desarrollado en 2010 para cuantificar grandes estructuras mamarias y FracLac¹⁶, desarrollado en 2014 para integrar análisis ImageJ y fractal cuantificar formas individuales de la microglia. Estos plugins proporcionan un análisis rápido de ramificación de la microglia en Microfotografías de todos o microglia múltiples de un ROI definido dentro de una microfotografía. Este análisis puede utilizarse sola o en complemento con el análisis fractal. El análisis fractal de unicelular (FracLac) requiere una inversión de tiempo pero proporciona múltiples salidas de morfología con respecto a la complejidad de microglia, tamaño y forma. El uso de ambas herramientas no es redundante, como célula de ramificación es complementaria a la complejidad de la célula y la combinación de varios parámetros puede utilizarse para distinguir entre microglia diversas morfologías dentro de conjuntos de datos^12,17.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por y realizados de acuerdo con los lineamientos establecidos por el Comité de uso y la atención Animal institucional de la Universidad de Arizona y las directrices de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Se tuvo cuidado para minimizar la incomodidad y el dolor animal. Métodos de eutanasia son de acuerdo a un protocolo aprobado y constan de decapitación cervical bajo anestesia isoflurano.

1. preparación de tejido

Nota: Llevar a cabo análisis de morfología de microglia en muestras de tejido de cryoprotected fijo, para preservar la morfología celular. El siguiente es un protocolo estándar para preparar y cortar directamente tejido fijo para fluorescencia IHC.

1. Quitar cerebros de ratón o rata de un sacrificio animal después de la experiencia deseada y de acuerdo con un protocolo estándar de laboratorio. Colocar el cerebro en un frasco de 10 mL que contiene 5 mL de una solución de paraformaldehído al 4% durante 24 h a 4 ° C. Luego enjuague y lugar en 5-10 mL de un fosfato de sacarosa al 30% de solución amortiguadora (SSAF, 0.01 M por 72 h) a 4 ° C. Almacenar los cerebros enteros a-80 ° C hasta tejido seccionado con un criostato, o a 4 ° C si Seccionando con un micrótomo.
   Nota: Este Protocolo no ha todavía ha probado utilizando tejido en rebanadas del tejido parafina-encajado.
2. Sección de tejido cerebral para el grueso de la sección deseada y la orientación mediante un criostato o un micrótomo y tienda secciones flotan libremente en una solución de crioprotección (50 mM PBS, etilenglicol, glicerol) a-20 ° C.
   Nota: Este protocolo ha sido realizado con éxito en secciones de tejido coronal entre 50 μm y 200 μm de espesor. Secciones de tejido menos de 50 μm, no captura el intervalo completo de los procesos de la microglia, mientras que en secciones de tejido grueso, tinción IHQ puede ser imperfecta por la penetración del anticuerpo en tejidos. Tejido puede ser seccionado o bien en una coronal o sagital orientación y esta elección dependerá de las regiones meta y cerebro experimentales a estudiar.

2. inmunohistoquímica

Nota: Pueden aplicarse métodos de análisis de esqueleto y fractal fluorescencia o 3, 3 '-diaminobenzidina (DAB) IHC. El siguiente es un protocolo IHC de fluorescencia estándar y puede ser sustituido cuando sea necesario. Fluorescencia IHC rendimientos superior visualización de procesos de la célula en comparación con DAB IHQ.

1. Coloque las secciones de tejido en un frasco de vidrio de 4 mL (hasta 15 mouse cerebro secciones/vial) e incubar con 1 mL de solución con un contenido de 10% de suero de caballo, PBS (0,01 M), 0,5% Tritón, 0.04% NaN₃ a temperatura ambiente (23 ° C) durante 1 h.
2. Lavar durante 5 minutos con PBS (0.01 M) tres veces a temperatura ambiente.
3. Incubar con el anticuerpo primario (Iba1, 1:1, 000) a temperatura ambiente durante 72 h en 1 mL de solución contiene 0,5% Triton en PBS (0.01 M), 0.04% NaN₃y cubierto (para preservar la eficacia de₃ NaN).
4. Lavar durante 5 minutos con PBS (0.01 M) tres veces a temperatura ambiente.
5. Incubar con el anticuerpo secundario (anti-conejo 488, 1: 250) cubierto a temperatura ambiente durante 4 h en 1 mL de solución PBS (0.01 M), 0,5% Tritón, 0.04% NaN₃
6. Lavar durante 5 minutos con PBS (0.01 M) tres veces a temperatura ambiente.
7. Montar las secciones de tejido cerebral (número y orientación según preferencia) a portaobjetos subbed, aplicar un medio de montaje suave-set a la diapositiva y colocar el cubreobjetos sobre el tejido. Almacenar las diapositivas a 4 ° C.
   Nota: Un grueso cubreobjetos de 1.5 vidrio es necesario para la proyección de imagen confocal. Soft-set es un medio de montaje recomendado: debido a la alta viscosidad no comprime el tejido y mejor conserva la morfología en comparación con medios de montaje observó.

3. la proyección de imagen

1. Imagen Iba1 las células positivas en la sección de tejido cerebral utilizando un microscopio de campo brillante o confocal que tiene una capacidad de adquisición de z-pila usando un 20 X objetivo o mayor.
   Nota: Parámetros y configuración de software de imagen debe ser constante para todos adquisición de microfotografía en un experimento. Detalle de proceso excelente se obtiene utilizando un 40 X u objetivo X 63. Es posible aplicar el protocolo de Análisis esquelético descrito una microfotografía entera o un ROI múltiples de la célula dentro de una microfotografía más grande.
   1. Adquisición de imágenes de 8 bits mediante la configuración de software apropiado específica para el software del microscopio.
      Nota: La conversión de ficheros en 8 bits después de la adquisición puede distorsionar la recolección de datos.
   2. Adquirir al menos un z-stack de 30 μm con no más de un intervalo de 2 μm entre imágenes usando la configuración de software apropiado específica para el software del microscopio.
      Nota: El microscopio y el software deben permitir la adquisición de imágenes en un eje X, Y y Z. Un z-stack puede aumentarse, y el intervalo puede reducirse para proporcionar el detalle adicional de la microglia. En cambio, tiempo de la proyección de imagen va a aumentar. Uso de muestreo de Nyquist posible para microscopía de fluorescencia.
2. Guarde todos los archivos como archivos Tif o como requerido por el software del microscopio.
3. Abra los archivos Tif en ImageJ y utilice la barra de herramientas para dividir canales haciendo clic en imagen | Color | Dividir canalesy pila de imágenes haciendo clic en imagen | Pilas | X proyecto | Proyección de intensidad máxima cuando proceda. Guardar archivos de .tif.

4. esqueleto análisis

1. Descargar FIJI o ImageJ de < https://imagej.net/Fiji/Downloads>. Para los plugins individuales, descargar AnalyzeSkeleton(2D/3D) de < http://imagej.net/AnalyzeSkeleton>¹⁵ y descarga FracLac de < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/fraclac.html>¹⁶.
   Nota: Todo el proceso de conversión de una microfotografía a una imagen binaria del esqueleto tarda menos de 1 minuto.
2. Si utiliza una microfotografía de fluorescencia, garantizar que la imagen es de 8 bits y convertir a escala de grises para mejor visualizar la coloración positiva todos. Utilice la barra de herramientas y haga clic en imagen | Tablas de búsqueda | Greys. Si se utiliza una fotografía de campo brillante de DAB, primer uso las FFT bandpass filtro plugin (utilizando la barra de herramientas haciendo clic en proceso | FFT | filtro paso de banda) y luego convertir a escala de grises.
   Nota: Para los efectos del presente Protocolo, ImageJ por defecto para un filtro pasabanda de FFT es suficiente (filtro de hasta 3 píxeles, hasta 40, no supresión de la banda). Aplicación de un Filtro Bandpass de FFT elimina el ruido (pequeñas características) preservando los aspectos generales más grandes de la imagen. Esto es particularmente útil en imágenes de campo claro, donde se divide y grietas en el tejido pueden aparecer como fondo y así complicar el análisis esquelético¹⁸.
3. Ajustar el brillo y contraste si la imagen es demasiado oscura y no se pueden visualizar el proceso de la microglia. Utilice la barra de herramientas y haga clic en imagen | Ajustar | Brillo/contraste. Ajuste los controles deslizantes de mínimos o máximos según sea necesario, hasta los bordes el histograma pero no más.
   Nota: En ImageJ, brillo y contraste son cambiadas por actualización de tabla de búsqueda de la imagen (LUT), para que valores de píxel han cambiado. Deslizadores de Max y min de control los límites inferiores y superiores de la gama de la pantalla, con valores de los píxeles sobre 255 aparece blanco y valores de los píxeles por debajo de 0 que aparece negro¹⁸. En el caso de microfotografías de fluorescencia, debe utilizarse el máximo regulador, mientras que el regulador mínimo se usará para Microfotografías de DAB manchado microglia.
4. Ejecutar un filtro máscara de enfoque para aumentar aún más el contraste usando la barra de herramientas haciendo clic en proceso | Filtros | Máscara de enfoque. Para los efectos del presente Protocolo, por defecto de ImageJ (un radio de píxeles de 3 y peso de 0,6 de la máscara) se utilizan.
   Nota: La máscara de desenfoque agudiza y mejora las características del borde de una imagen por restar una versión borrosa de la imagen (máscara de enfoque) de la original y luego fusionar la imagen resultante con una versión de alto contraste de la imagen original. Por lo tanto, el filtro máscara de enfoque no crea detalles, sino que aclara bastante el detalle existente en una imagen. El radio ajuste cambios como borrosa la máscara de enfoque será (y se eliminarán así cómo mucho desenfoque), y el peso de la máscara ajuste cambios el grado de contraste que se fusionará con la máscara de enfoque (y así se ajusta el contraste de la imagen final).
5. Realizar un paso de eliminar exceso de puntos para sacar de estriada ruido generado por la máscara de enfoque. Utilice la barra de herramientas y haga clic en proceso | Ruido | Refinar.
   Nota: Refinar quita ruido entrecano sustituyendo cada píxel por el mediana valor en su vecindario de 3 × 3. El efecto es que afloramientos en intensidad son substituidos por pixel mediano sin afectar la nitidez de los bordes¹⁸.
6. Convertir la imagen a binario usando la barra de herramientas haciendo clic en imagen | Ajustar | Umbral.
   Nota: Umbral estratifica las imágenes en escala de grises en características de interés versus fondo y convierte la imagen en binario¹⁸.
7. El refinar, cercano-, de poner y quitar funciones de afloramientos: en la imagen binaria resultante, puede haber ruido de fondo del píxel y las diferencias entre procesos.
   1. Aplicar la función de eliminar exceso de puntos utilizando la barra de herramientas haciendo clic en proceso | Ruido | Refinar.
      Nota: Aplicación de refinar al binario imagen elimina cualquier ruido píxel restantes.
   2. Aplicar la función cercana utilizando la barra de herramientas haciendo clic en proceso | Binario | Cierre.
      Nota: Este plugin conecta dos píxeles oscuros si están separados por un máximo de 2 píxeles.
   3. Aplicar la función de afloramientos de eliminar usando la barra de herramientas haciendo clic en proceso | Ruido | Eliminar valores extremos.
      Nota: Para los efectos del presente Protocolo, brillantes afloramientos están dirigidas con un radio de píxeles de 2 y un umbral de 50. Este plugin reemplaza un píxel brillante u oscuro aislados por los píxeles mediana en el área circundante si se desvía por más de un determinado valor (umbral)¹⁸.
8. Guarda la imagen como un archivo independiente para el futuro análisis de uso o fractal y skeletonize la imagen con la barra de herramientas haciendo clic en proceso | Binario | Skeletonize.
9. Seleccione la imagen esqueleto y ejecutar el plugin AnalyzeSkeleton(2D/3D) usando la barra de herramientas haciendo clic en Plugins | Esqueleto | Analizar el esqueletoy marca la casilla de información de la rama.
   Nota: Es probable que el proceso de imagen requiere optimización con la adición o supresión de los pasos sugeridos anteriormente. En este proceso, se evalúan los imágenes esbozados para exactitud creando una superposición de la imagen original y el esqueleto. Somas se deben puntos de origen con procesos que emana desde el centro; somas circular confundir los datos y deben evitarse con ajuste de protocolo. Un ejemplo de un punto de origen frente a Soma circular se ilustra en la figura 1.

Problemas comunes resultante en esqueletos no representativa y sugiere soluciones:

• Imagen muy tenue: convertir a escala de grises, ajustar los controles deslizantes de brillo y contraste o aplicar máscara de enfoque
• Mucho fondo: ajustar los controles deslizantes de brillo y contraste, aplicar refinar o quitar outliers
• Circular somas en imagen esqueleto (sobre todo para imágenes de fluorescencia): aplicar Filtro Bandpass de FFT, o máscara de enfoque
• Grietas en el tejido (especialmente para imágenes de campo claro): aplicar Filtro Bandpass de FFT, o refinar

10. Copiar todos los datos de los resultados e información de la rama salidas y pegar los datos en una hoja de cálculo de Excel.
11. En Excel, recortar los datos para eliminar fragmentos de esqueleto que resultan de la adquisición de IHC y de imagen.
    1. Duplicado del libro de experimento con la salida de datos de Análisis esquelético y agregar ajuste al nombre de archivo. Todo recorte de datos posteriores debe ocurrir en el libro duplicado para preservar los datos en bruto para referencia y uso futuro.
    2. Determinar que longitud de los fragmentos se recortará del conjunto de datos abriendo la imagen esqueleto en ImageJ y seleccionar la herramienta línea. Medir varios fragmentos, tomando nota de la longitud media y decidir sobre un valor de corte.
       Nota: Para los efectos de los datos presentados aquí, la longitud de corte de fragmentos no deseados es de 0,5. Este valor debe ser consistente a través de un conjunto de datos.
    3. Custom ordenar la hoja de cálculo Excel por haga clic en ordenar y filtrar | Ordenación personalizada. Ordenar por "extremo voxels" de mayor a menor y, en un nuevo nivel, por "Mx rama pt" de mayor a menor.
    4. Quitar cada fila que contiene 2 extremos con una longitud máxima de la rama de menor que el valor de corte (es decir., 0.5). Suma los datos en la columna de criterios de valoración para calcular el número total de criterios de valoración recogidos en la imagen.
    5. Repetición de datos rama: ordenar por 'longitud de la rama' de mayor a menor. Desplazarse por los datos y quitar cada fila que tiene una longitud de rama de menor que el valor de corte(es decir., 0.5). Suma los valores en la columna de longitud de rama para calcular la longitud sumada de todas las ramas de la imagen.
    6. Repita los pasos 4.11.3-4.11.5 para cada imagen/hoja hasta que todos los datos han sido recortados y suman.
    7. Dividir los datos de cada imagen (suman número de puntos finales y sumar la longitud de la rama) por el número de microglía somas en la imagen correspondiente. Entrar los datos finales (extremos de la célula y longitud/célula) en el software estadístico.
       Nota: Los datos sumados rama del longitud/celular pueden requerir conversión de longitud en píxeles a micras.

5. Análisis fractal

Nota: FracLac es capaz de ejecutar una serie de análisis de formas que no están cubiertos en el presente Protocolo. Para una explicación más detallada de FracLac de distintas funciones, consulte el manual de FracLac en < https://imagej.nih.gov/ij/plugins/fraclac/FLHelp/Introduction.htm> y referencias asociadas ^2,16,19. Análisis fractal utiliza los pasos del Protocolo 4.1-4.7 descrito anteriormente.

1. Determinar el tamaño del ROI que se utilizará para todos los análisis fractal. Utilice la herramienta Rectángulo para dibujar el ROI. Asegúrese de que la caja sea lo suficientemente grande como para capturar toda la célula y puede permanecer constante a lo largo del conjunto de datos.
   Nota: Utilice la selección de rectángulo en lugar de la selección a mano alzada para que ROIs todos son el mismo rectángulo de tamaño, y por lo tanto, las células tienen la misma escala. Esto no sería el caso si la selección a mano alzada se utiliza pues ImageJ escala automática un ROI cuadrado para adaptarse a diferentes ventanas rectangulares tamaño dando como resultado células con diferentes escalas. Mientras que formas fractales son independientes de la escala, el proceso de análisis fractal usando FracLac para ImageJ depende de escala¹⁶. Por lo tanto, es la necesidad de un ROI siempre tamaño a lo largo de la recolección de datos.
2. Al azar seleccione microglia para análisis fractal en cada fotomicrografía e imagen binaria correspondiente. En la ventana del administrador de ROI, seleccione actualización para bloquear el retorno de la inversión en la posición de la celda. Utilice Ctrl + Mayús + D para duplicar el área dentro del ROI como una nueva ventana y guarde la célula cultivada. En la imagen binaria correspondiente (desde el análisis del esqueleto), duplicar el área con la misma célula mediante el ROI manager. Repita hasta que un número suficiente de células ha sido seleccionado al azar para el análisis fractal y guarde todos los archivos.
   Nota: Un generador de números aleatorios y una cuadrícula numerada pueden utilizarse para seleccionar aleatoriamente las células.
3. Abra la imagen binaria con la célula individual. Haga doble clic en la herramienta de pincel, establecer el color a negro y ajuste el ancho del pincel según sea necesario. La fotomicrografía correspondiente como referencia, utilizar la brocha para eliminar procesos de la célula adyacente, conectar procesos fragmentados y aislar la célula de interés. Una vez aislada la celda binaria, guarde el archivo binario.
   Nota: Holding 'alt' cambiará el pincel desde el color frontal (negro) al color de fondo (blanco).
4. Convertir la celda binaria a un esquema utilizando la barra de herramientas a través de proceso | Binario | Esquema.
   Nota: FracLac de imagen J puede ser utilizado en cualquiera de los dos formas sólidas o forma describe, sin embargo, Convenio actual es a utilizar forma describe¹⁶.
5. En la barra de herramientas, abra el FracLac usando la barra de herramientas haciendo clic en Plugins | Análisis fractal | FracLac y seleccione BC (cuenta caja). En la configuración de Diseño de cuadrícula , establezca Num G en 4. Bajo Opciones de gráficos , marque el cuadro de mediciones para analizar el casco convexo y círculo delimitador de la célula. Cuando haya terminado, seleccione OK.
   Nota: Num G es el número de la caja contando orientaciones de rejilla utilizados durante la exploración y el intervalo recomendado para Num G es 4-12. El valor de Num G y el rango sugerido bien se revisa en el manual de FracLac¹⁶. Aumentar Num G puede retardar significativamente tiempos de cálculo. FracLac configuración sólo tendrá que configurar una vez por sesión. Una vez que se han introducido los ajustes, estará disponible el botón Scan.
6. Seleccione el botón Scan para ejecutar una exploración de la cuenta de caja en la imagen seleccionada.
   Nota: El análisis generará tres ventanas con salidas de datos: casco y círculo resultados, archivo de Resumen de cuenta de caja y tipos de análisis. La ventana tipos de escaneo contiene un registro de la configuración utilizada, desviaciones estándar, así como para ciertas medidas. Para los efectos del presente Protocolo, la ventana tipos de análisis no se utiliza y puede ser cerrada o guardar para referencia futura.
7. En la ventana Resultados de círculo y casco , copiar datos del todo deseados (es decir., densidad, proporción de palmo y circularidad) resultados. En la ventana de Resumen de cuenta de caja , copia los datos deseados (es decir., dimensión fractal y lagunaridad) resultados. Transferencia de los datos copiados a un archivo de Excel o software estadístico.
   Nota: Un listado completo de lo FracLac de salida de datos son proporcionados y bien explicados en el FracLac de ImageJ manual¹⁶.

Resultados

Los protocolos de análisis de morfología microglia descritos Resumen pasos útiles en el procesamiento de fluorescentes y Microfotografías de DAB para el análisis morfométrico. Estos pasos se resumen visualmente en la figura 2 y figura 3. El objetivo de estos pasos es crear una imagen representativa de binario y esqueleto que modela adecuadamente la microfotografía original tal que los datos acumulados son válidos. Después de la aplicación del Protocolo, el plugin de AnalyzeSkeleton resulta en una imagen esqueleto etiquetado de que el número de puntos finales y rama (es decir., proceso) resumir lengthcan de archivos de salida resultantes. Extremos y datos de longitud de proceso entonces se utilizan para estimar el grado de ramificación de la microglia en la microfotografía o ROI. Figura 4 se resumen los datos resultantes (extremos de la célula y el proceso largo/célula) recolectados con y sin la aplicación del protocolo. Mientras que existen tendencias similares, la información resumida en la figura 4F es menos variables que en figura 4E. Además, estos datos ilustran el aumento de la sensibilidad para detectar diferencias entre grupos cuando se aplica el protocolo. Por último, debe tenerse cuidado con respecto a la variabilidad inter-usuario en la aplicación del protocolo. Estas diferencias se resumen por figura 5 donde el mismo conjunto de datos fue analizado por dos usuarios independientes aplicando un protocolo idéntico como resumido arriba.

Se recogen datos adicionales de la morfología de las células aisladas de las imágenes binarias creadas durante la aplicación del protocolo. Los pasos del protocolo para analizar la morfología de la microglia antes y usando el plugin de FracLac se resumen en la figura 6. Ilustramos este análisis en ambas lesionadas (figura 6A) y lesiones del tejido (Figura 6B). Imágenes representativas de binario, contorneado, convex hull/encapsulado círculo y ejemplos de cuenta de caja para cada célula analizada con y sin el protocolo de aplicación se muestran en la figura 6–F. Estas imágenes ayudan a ilustrar los orígenes de las diferencias en datos de morfología que se resumen en la figura 6.

Figura 1. Ilustraciones de microglia esqueletizado con un soma circular (subóptimo) versus un soma de origen (óptimo) y la correspondiente superposición entre el esqueleto de la célula y la microfotografía original. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Protocolo aplicación fluorescentes fotomicrografías. Ilustraciones del esqueleto análisis protocolo aplicado a una microfotografía fluorescente con una sola célula recortada para mostrar detalles. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Aplicación de protocolo para campo brillante DAB fotomicrografías. Ilustraciones del Protocolo de análisis del esqueleto que una microfotografía DAB de campo claro se aplica con una sola célula recortada para mostrar detalles. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Análisis de datos con y sin la aplicación del protocolo. (A) una microfotografía de ejemplo de IHC fluorescente y célula cultivada correspondiente a la caja de amarillo (B). Imágenes binarias y esqueleto de ejemplo con (C) y sin (D) del Protocolo de aplicación como se describe. Datos de Resumen de microglia extremos de la célula y el proceso largo/celda de ileso (blanco) y lesiona el tejido cortical (gris) con (E) y sin (F) el protocolo aplicado. Análisis estadístico mediante la prueba t de student y n = 3, ** denota p < 0.01. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Diferencias de usuario con la aplicación del protocolo. Un ejemplo de una conversión de imagen y protocolo original a imágenes binarias y esqueletos por usuario 1 y usuario 2. Diferencias entre las dos imágenes se resaltan con círculos de colores a juego. Gráficos Resumen de microglia extremos de la célula y proceso de datos de la longitud celular en regiones del cerebro lesionadas y lesionados por usuario 1 y usuario 2. Análisis estadístico con ANOVA y muestra el tamaño es n = 3; p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Análisis fractal con y sin la aplicación del protocolo. Ejemplo de fotomicrografías recortadas de microglía en el ileso (A) y herido (B) la corteza con binario correspondiente (C) e imágenes de esquema (D) que resultan con y sin el protocolo aplicado. El casco convexo asociado (azul) y que encierra círculo (rosa) para las formas de contorno correspondiente (E) se utilizan para calcular la densidad de forma, proporción y circularidad (G) del palmo. La caja cuenta método es ilustrada en (F) y utilizada para cálculos de lagunaridad (λ) (G) y dimensión fractal (D_B). Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Las células de microglía están finamente sintonizadas a la fisiología y la patología dentro de sus micro-dominios y mostrar una amplia gama de morfologías² en sutil^7,14 y grave lesión⁸. El uso de protocolos de ImageJ hace cuantificación de morfología microglia accesible a todos los laboratorios como la plataforma y los plugins son una imagen de la abrir-fuente software de procesamiento. Mientras que el protocolo descrito se centra en el procesamiento de imágenes y análisis de uso de este software, la consistencia de recopilación de datos, validez y confiabilidad comienza con excelente IHC y microscopía. Este protocolo se utiliza para mejorar el binario, el esqueleto y representaciones de contorno de microfotografías de todos y de las células pero no puede tomar el lugar de pobre tinción IHQ y microscopia que resulta en bajo contraste, borrosas o distorsionadas imágenes. Como una consideración adicional, se debe tener cuidado no a aplanar el tejido cerebral durante el almacenamiento, antes de seccionar, que irrevocablemente altera la morfología de la microglia. Por último, dentro de cada experimento, microglia debe ser reflejada utilizando la misma escala, así como el mismo microscopio. Software, instrumentación y objetivos varían entre microscopios que resultará en Microfotografías de tamaño diferentes a pesar de objetivos similares y cambiar el detalle así como el número de células en cada marco. Por ejemplo, adquisición de imágenes con objetivo 40 X sobre una Leica SPII resultados en dos veces el número de células y menos detalle de adquisición con un Zeiss 880. Esto es particularmente importante para la célula ramificación datos recopilados de toda la trama en lugar de una sola célula, como esto se convierte en un problema de muestreo de datos.

En general, Análisis esquelético que utiliza la microfotografía todo precede el análisis fractal de célula única por dos razones. Ramificación de célula determinante de todas las células en una microfotografía es rápida en comparación con el análisis de fractal de la célula y puede ser considerado como una herramienta de detección si el tiempo es un factor. Además, las imágenes binarias derivadas durante el análisis del esqueleto se utilizan para el análisis fractal. Una vez reflejado, hay una serie de pasos críticos que pueden influir en los resultados del análisis del esqueleto e introducir usuario influencia. Los pasos de protocolo que son más variables entre los usuarios son paso 4.2 (cada vez mayor brillo de la imagen) y paso 4.5 (determinar el umbral). Siempre que sea posible, un número óptimo para aumentar el brillo (max o min deslizante entre 0-255) determina y llevó a cabo constante para todas las imágenes y los usuarios. Donde la variabilidad de la imagen es grande, el usuario puede elegir en su lugar un brillo que variará entre imágenes. Alternativamente, si las imágenes son brillantes y el contraste es alto, entonces aumentando brillo puede omitirse y umbral puede estandarizarse usando un filtro de umbral de especialidad (por ej., Huang) en lugar de la predeterminada más variable. Una vez optimizado, los parámetros deben seguirse para reducir al mínimo la influencia de usuario adicional.

Un ejemplo de la variabilidad de usuario se presenta en la figura 5. Fueron aumentados los valores de datos de usuario 1 y usuario 2 y por lo tanto se incrementaría la variabilidad si usuario 1 y usuario 2 contribuyeron a la recolección de datos. Un ejemplo de las diferencias en el usuario 1 y usuario 2 imágenes binarias y esqueletizadas destacan por círculos de colores (figura 5). En este caso, ambos usuarios fueron brevemente capacitados estudiantes con experiencia limitada en la microglia. Regular supervisión y tutoría de un experto junto con protocolo mayor formación² microglia pueden reducir la variabilidad inter-usuario. Aunque no evaluado aquí, análisis fractal es menos sujeto a variabilidad inter-usuario porque las células binarias son manualmente e individualmente aisladas de una fotomicrografía, en lugar de confiar únicamente en el umbral para determinar formas de microglia. Sin embargo, todos los métodos poseen cierta variabilidad entre los usuarios. Por lo tanto, un único usuario (idealmente, entrenado por algo de experiencia en las células de la microglia) deben completar la recolección de datos para un conjunto de datos completo.

Modificaciones adicionales pueden hacer fácilmente en el presente Protocolo y dependerán de la calidad de imagen y los esfuerzos realizados para reducir el ruido y asegurar conectividad de proceso. Por ejemplo, si el contraste es adecuado, máscara de desenfoque no es necesaria y puede omitirse. Es prudente optimizar y completar el protocolo para un conjunto específico de imágenes, casos experimentales y controles, antes de recoger datos de un conjunto. Por último, plugins adicionales puede utilizarse en lugar de otros para aclarar y enfocar imágenes que no fueron descritos en el presente Protocolo como dilatar o afilar.

Ventajas de este protocolo son la disponibilidad universal y su adaptabilidad. Además, evaluar la ramificación de la célula usando AnalyzeSkeleton es rápido y aplicable a una microfotografía todo. Una ventaja del enfoque de análisis múltiples de la célula es el foco de toda una región en lugar de las células. Por lo tanto, es posible evaluar rápidamente la ramificación promedio (en términos de puntos finales y la duración de proceso) de microglia todos dentro de la imagen. Análisis esquelético proporciona un análisis de varias celdas: una muestra de datos en términos de números de celular que no pueden ser igualadas por el análisis fractal debido a la inversión de tiempo necesario para aislar las células de las fotomicrografías. Una instancia donde esto podría ser más adecuado sería en investigación de morfologías de microglia en cercanías a una lesión focal. Una limitación es la representación de la imagen de todo campo para crear modelos de esqueleto de microfotografías de IHC es imperfecta en comparación con el enfoque de unicelular más desperdiciador de tiempo. Además, un análisis de la región no es adecuado a las circunstancias donde microglia morfologías muy distintas dentro del mismo campo. Por último, este método de análisis depende de recuento de células, un parámetro que puede diferir entre las condiciones experimentales.

Análisis fractal se lleva a cabo en una sola célula y por lo tanto complementa la salida de datos de ramificación promedio células resultantes del análisis del esqueleto. Aunque mucho más tiempo, esta inversión produce una amplia gama de datos morfométricos. De la célula por ejemplo, densidad, proporción de palmo, y datos de circularidad, describen el tamaño, alargamiento y la forma del contorno de la célula, respectivamente. Lagunaridad y dimensión fractal Resumen la complejidad de la célula y la heterogeneidad de la forma, respectivamente. En el manual interactivo¹⁶ se ofrece un resumen más detallado de cómo cada parámetro se calcula y cómo se pueden interpretar datos y tal detalle debe ser considerado en relación a la pregunta de investigación específica. Los resultados del protocolo descrito en herramientas sensibles para cuantificar pequeños cambios en la morfología de microglia 2D que puede ocurrir en condiciones fisiológicas y patológicas. Análisis morfométrico adicionales tales como solidez, convexidad y factor de forma^16,20 pueden ser posible si generar formas 3D.

Adaptación y desarrollo del protocolo es continua y orientados al usuario. Se ha ampliado de fluorescencia⁸ DAB/brillante-campo imágenes⁷ sino no tejido embebido en parafina. Además, puede ser utilizado en conjunción con software propietario como Imaris para análisis adicional. Este protocolo se puede aplicar a una variedad de la fisiología y no se limita a la microglía pero puede aplicarse a cualquier célula o tejido con patrones particulares o formas que se pueden identificar mediante métodos IHC. Por último, con suficiente tamaño de muestra, un análisis multivariante o cluster se puede aplicar para estratificar microglia según morfología^12,21; Esto es información significativa como morfología de la microglia es un indicador vital de las funciones de la microglia y las respuestas a su entorno. El aprecio por la diversidad morfológica de microglial es importante comprender las interacciones neurona-glia-vascular durante la salud y la enfermedad y en expansión. Crecimiento en este campo se enriquece con protocolos bien desarrollados, fácil de usar y reproducibles para cuantificar y resumir microglia morfología utilizando múltiples variables continuas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
anticuerpo primario anti-IBA1	Wako	019-19741	huésped conejo
Vectashield montaje blando	Vector Labs	H-1000
Anticuerpo secundario	Jackson ImmunorResearch	711-545-152	huésped burro
vial de vidrio de 4 mL	Wheaton UX-08923-11
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Azida de sodio (NaN3)	Sigma	S-8032
cubreobjetos de vidrio	Fisher Scientific	12-544-G