Microscopía de luz de hoja para la visualización tridimensional de las células inmunes humanas

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar células inmunes embebidas en una matriz de colágeno (3D) tridimensional mediante microscopía de luz de hoja. Este protocolo también explica cómo realizar el seguimiento de la migración celular en 3D. Este protocolo puede ser empleada para otros tipos de suspensión de células en la matriz 3D.

Abstract

In vivo, la activación, proliferación y función de las células inmunes todos se producen en un entorno tridimensional (3D), por ejemplo en los ganglios linfáticos o tejidos. Hasta la fecha, la mayoría en vitro sistemas se basan en dos dimensiones (2D) las superficies, como las placas de cultivo celular o cubreobjetos. A óptimo imitan las condiciones fisiológicas en vitro, utilizamos una matriz de colágeno 3D simple. Colágeno es uno de los principales componentes de la matriz extracelular (ECM) y ha sido ampliamente utilizado para constituir matrices de 3D. Para la proyección de imagen 3D, la tecnología de microscopia de luz hoja recientemente desarrollado (también conocida como microscopía de iluminación solo plano) se presenta con alta velocidad, la profundidad de penetración grande, blanqueo bajo y fotocitotoxicidad. Además, microscopia de la hoja de luz es particularmente ventajosa para medición a largo plazo. Aquí se describe un protocolo optimizado cómo configurar y manejar las células inmunes humanas, por ejemplo primario humano los linfocitos T citotóxicos (CTL) y las células natural killer (NK) en la matriz de colágeno 3D para uso con la microscopia de luz-hoja para la proyección de imagen de células vivas y muestras fijadas. Se presentan el procedimiento de adquisición de imágenes y análisis de la migración de la célula. Especial atención se da a resaltar pasos críticos y los factores para preparación de muestras y análisis de datos. Este protocolo puede ser empleada para otros tipos de suspensión de células en una matriz de colágeno 3D y no se limita a las células inmunes.

Introduction

Más conocimiento acerca de la migración las células viene de 2D^1,2,3, los experimentos que se realizan normalmente en una superficie de vidrio o plástico de una cultura/proyección de imagen de plato. Sin embargo, una situación fisiológica requiere, en la mayoría de los casos, un microambiente 3D, en el que la matriz extracelular (ECM) juega un papel decisivo. ECM no sólo proporciona lo esencial de la estructura en 3D para mantener la morfología de la célula adecuada sino también ofrece señales de supervivencia o las señales direccionales para un óptimo funcionamiento de mucha....

Protocol

Investigación realizada para este estudio con el material humano (cámaras sistema reducción de leucocitos de donantes de sangre humana) está autorizado por el Comité de ética local (declaración de 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) y sigue las pautas correspondientes.

1. preparación de solución de colágeno neutralizado (500 μl)

1. Transfiera 400 μL de solución stock de colágeno refrigerado (10,4 mg/mL) a un tubo de 1,5 mL estéril debajo de la campana de la cultura de célula. Lentamente, añada 50 μl de frío 10 x PBS (pH 7.0-7.3) a 400 μL de solución stock de colágeno refrigerados. Mezcle la solución por mosaico suavemente el....

Results

Formación saliente durante la migración de la célula de T es un proceso altamente dinámico, que es dependiente de actina. Para visualizar la formación saliente del CTL humana primaria, nos transfectadas transitoriamente una proteína mEGFP fundido para etiquetar el citoesqueleto de actina en CTL como se describe antes del¹¹. Un día después de la transfección, las células fueron embebidas en la matriz de colágeno. Pilas de imágenes fueron adquiridas cada 40 s con un .......

Discussion

Mayoría en vitro ensayos se llevan a cabo sobre una superficie 2D, por ejemplo en las placas de cultivo celular, platos de Petri o en cubreobjetos, mientras que en vivo las células, especialmente las células inmunes, sobre todo un microambiente 3D la experiencia. Emergentes de la evidencia muestran que los patrones de migración de células inmunes diferencian entre 2D y 3D escenarios¹⁷. Por otra parte, los perfiles de expresión de las células tumorales también son diferentes en 2D.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibricol, solución de colágeno bovino	Advanced Biomatrix	#5133-20ML Matriz de	colágeno
0,5 M Solución de NaOH	Merck		1091381000 para neutralizar la solución de Fibricol
Agarosa de fusión ultra baja Affymetrix		32821-10GM Preparación de	c[Col]
Dynabeads Kit de células T CD8 humanas intactas	Thermo Fisher	11348D	Aislamiento de linfocitos T CD8+ humanos primarios de PBMC
Dynabeads Activador T humano CD3/CD28 para la expansión y activación de linfocitos T	Thermo Fisher	11132D	Activación de poblaciones de CTL
Interleucina-2 recombinante humana	Thermo Fisher	PHC0023	Estimulación de CTL
P3 cultivado Kit de solución primaria	Lonza	V4XP-30XX	Transfección
α-PFN1 anticuerpo, conejo, IgG	Abcam	ab124904	IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Thermo Fisher	A22284	IF
CellMask Orange Tinción de membrana plasmática	Thermo Fisher	C10045	Etiqueta de células fluorescentes
Tween 20	Sigma	P1379-250mL	IF
Triton X-100	Eurobio	018774	IF
DPBS Solución salina tamponada con fosfato Dulbecco	Thermo Fisher	14190250	IF
Albúmina sérica bovina	Sigma	A9418-100G	IF
Cabra y alfa; Conejo 568, IgG, conejo	Thermo Fisher	A-11011	IF
Lightsheet Z.1 (Microscopía de lámina ligera)	Zeiss	N.A.
Campana de cultivo celular	Thermo Fisher	HeraSafe KS
cultivo celular HERACell 150i	Thermo Fisher	N.A.
Centrífugas 5418 y 5452	Eppendorf	N.A.
Pippettes	Eppendorf	3123000039, 3123000020, 3123000063
Puntas de pipeta	VWR	89079-444, 89079-436, 89079-452
Tubos de 15 mL	Sarstedt	62.554.002
Capilares 50 y micro; L	VWR (Marca)	613-3373	Zeiss Preparación de muestras LSFM
Émbolo para capilares	VWR (Marca)	BRND701934	"Sellos con punta de teflón" Preparación de muestras LSFM
MColorPhast Puntas de pH	Merck	1095430001	para probar el pH de las jeringas neutralizadas Fibricol
BD Plastipak 1mL BD	Z230723	ALDRICH	Preparación alternativa de muestras
Plastilina (Hasbro Play-Doh A5417EU7)	Play-Doh	N.A.
Convertidor de archivos Imaris	Bitplane	disponible en http://www.bitplane.com	Convertir archivos de imagen a formato de archivo Imaris
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)	Bitplane	disponible en http://www.bitplane.com	Análisis de datos de imágenes 3D y 4D