Aquí, presentamos un protocolo para la fabricación de placas nanopattern gradiente vía térmica nanoimprinting y el método de proyección de las respuestas de las células progenitoras endoteliales humanas a las nanoestructuras. Usando la tecnología descrita, es posible producir un andamio que puede manipular el comportamiento de la célula por los estímulos físicos.
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Artículo de método
Fabricación de Nanopattern gradiente térmico Nanoimprinting técnica y proyección de la respuesta de células formadoras de colonias endoteliales humanas
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Nanotopography puede encontrarse en diversas matrices extracelulares (ECMs) alrededor del cuerpo y se sabe que tienen importantes acciones reglamentarias sobre reacciones celulares. Sin embargo, es difícil determinar a la relación entre el tamaño de una nanoestructura y las respuestas de las células debido a la falta de herramientas de proyección adecuada. A continuación, os mostramos el desarrollo de placas nanopattern gradiente rentable y reproducible para la manipulación de respuestas celulares. Con óxido de aluminio anódico (AAO) como molde maestro, placas del gradiente nanopattern con nanopillars de gamas de diámetro creciente [120-200 nm (GP 120/200) 200-280 nm (GP 200/280) y 280-360 nm (GP 280/360)] fueron fabricados por un térmico impresión técnica. Estas placas nanopattern gradiente fueron diseñadas para imitar los diversos tamaños de nanotopography en el ECM y se utilizaron para las respuestas de células endoteliales humanas formadoras de colonias (hECFCs) de la pantalla. En este protocolo, se describe el procedimiento paso a paso de la fabricación de placas de gradiente nanopattern de ingeniería, técnicas de cultivo de hECFCs de sangre periférica humana y hECFCs en nanopattern las placas de cultivo celular.
Introducción
Recientemente, la respuesta de las células por la estimulación física de la topografía de la superficie ha sido destacó en el campo de la célula ingeniería1,2,3,4. Por lo tanto, más atención se ha centrado en nanoestructuras tridimensionales en el accesorio de celular superficial5. Se ha reportado que la integrina, que es el dispositivo de reconocimiento de superficie de la célula, transmite el estímulo físico por las estructuras micro-nano de ECM a través de la Mecano-transducción6. Este estím....
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Protocolo
Este estudio fue aprobado por la Junta de revisión institucional en el Hospital de Anam de la Universidad de Corea (IRB no. ED170495). Todos los procedimientos se llevaron a cabo con arreglo a la declaración de Helsinki y sus enmiendas posteriores.
1. preparación del sustrato de aluminio (Al) por electropulido
PRECAUCIÓN: Solución de electropulido es corrosivo y tóxico. Use equipo de protección personal como guantes de nitrilo, gafas protectoras y bata de laboratorio. Realizar este paso en una campana de humos.
- Preparar la solución de electropulido mezclando ethyl alcohol (C2....
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Resultados
La figura 1 muestra imágenes de SEM de los moldes fabricados de AAO gradiente según su tipo y posición. La figura 2 muestra imágenes de SEM de placas gradiente nanopattern con nanopillars regular-redondeadas y figura 3 cuantificación datos del diámetro del nanopillar. La tabla 1 enumera las características de la nanopillars fabricado.
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Discusión
Fabricación de un AAO a menudo adolece de defectos tales como grietas, formas irregulares de los poros y la quema. La razón principal de estos defectos se llama un desglose electrolítico, que es fuertemente afectado por la naturaleza de los sustratos de metal está anodizado y la resistividad del electrólito21. Puesto que la resistividad del electrolito varía dependiendo de su temperatura, eliminar calor continuamente de electrodos es el punto crítico para mantener la temperatura localización del e.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de educación, ciencia y tecnología (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] y Bio y desarrollo de tecnología médica Programa de la NRF financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y planeación de futuro [NRF-2017M3A9C6029563].
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido perclórico 60% | Daejung Chemicals & Metales | 6512-4100 | |
| Alcohol etílico, absoluto 99.9% | Daejung Chemicals & Metales | 4118-4100 | |
| Ácido fosfórico 85% | Daejung Chemicals & Metales | 6532-4400 | |
| Alcohol metílico 99.5% | Daejung Chemicals & Metales | 5558-4400 | |
| Óxido de cromo (VI) | Daejung Chemicals & Metales | 2558-4400 | |
| Ácido sulfúrico 95% | Daejung Chemicals & Metales | 7781-4100 | |
| Peróxido de hidrógeno 30% | Daejung Chemicals & Metales | 4104-4400 | |
| n-hexano 95% | Daejung Productos químicos & Metales | 4081-4400 | |
| Tolueno 99.5% | Daejung Productos Químicos & Metales | 8541-4400 | |
| (heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahidrodecilo)dimetilclorosilano | Gelest | SIH5840.4 | Sensible a la humedad |
| Metoxinonafluorobutano 99% | Sigma aldrich | 464309 | |
| solución de colágeno | Stemcell | #4902 | |
| Gelatina | Sigma aldrich | G1890 | Solución |
| de recubrimiento de proteínasFicoll-Paque | GE Heathcare | 17-1440-03 | Solución de polisacárido hidrófilo |
| EGM-2MV | Lonza | CC-3202 | Medio de expansión de células endoteliales |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Solución salina tamponada con fosfato | Gibco | 10010031 | |
| Suero fetal bovino | Gibco | 12483-020 | |
| Paraformaldehído | Sigma aldrich | P6148 | |
| Glutaraldehído | Sigma aldrich | G5882-100ML | |
| Tetróxido de osmio | Sigma aldrich | 201030-1G | |
| Hexametildisilazano | Sigma aldrich | 440191 | |
| Triton X-100 | Sigma aldrich | X100-100ML | Etoxilato de octilfenol |
| Suero de cabra | Gibco | 26050-088 | |
| anticuerpo primario de vinculina humana | Sigma aldrich | V9131 | |
| Sonda de actina F | Sondas moleculares | A12379 | Faloidina conjugada con fluorescencia |
| Alexa Fluor 488 anti-ratón conjugado Anticuerpo IgG | Sondas moleculares | A11001 | Anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol | Sigma aldrich | D9542 | |
| Medio de montaje | DAKO | S3023 | |
| Anticuerpo primario vWF humano | DAKO | A0082 | |
| Anti-humano Anticuerpo primario CD144 | BD Biociencias | #555661 | |
| Eponate 12&comercio; Kit de incrustación, con BDMA | Ted Pella | 18012 | Resina epoxi |
| Acetato de uranilo, 25g | Ted Pella | 19481 | |
| Citrato de plomo, Trihidrato, 10g | Ted Pella | 19312 | |
| Placa de aluminio ultra puro | Goodfellow | 26050-088 | |
| Lámina de poliestireno | Goodfellow | ST313120 | |
| oblea de silicio de 8,0" | Siltron | 29-01024-03 | Pulido por una cara, 725 y micro; |
| Desecador de vacío de m de espesor, 4,4 L | Kartell | KA.230 | |
| Bomba de vacío | Aspirador | V3. VOP100 | |
| Fuente de alimentación | Unicorntech | UDP-3003 | |
| Agitador magnético | Daihan scientific | SL. | |
| Agitador | Daihan scientific | HT120DX | |
| Circulador | Daihan scientific | WCR-P12 | |
| Platina móvil lineal | Zaber | A-LSQ300A-E01-KT07 | |
| Soporte angular, 90 grados | Zaber | AB90M | Accesorio de la platina móvil lineal |
| Pinza PMP, 145 mm | Vitlab | 67995 | Pinza no metálica |
| Vaso de precipitados de PTFE, 250 mL | Cowie | CW007.25 | |
| Limpiador ultrasónico | Branson | B2510MTH | |
| Cortador de PCB | Hozan Tool Industrial | K-110 | |
| Dispositivo de nanoimpresión | Nanonex | NX-2000 | |
| Generador de plasma de oxígeno | Femto Science | CUTE | |
| Esterilizador de baja temperatura | Lowtem | Crystal 50 | |
| CO2 Incubadora | Panasonic | MCO-18AC | |
| Confoal | Carl Zeiss | LSM700 | |
| Microscopio electrónico de barrido | JEOL | JSM6701 | |
| Microscopio electrónico de transmisión | Hitachi | H-7500 |
Referencias
- Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
- Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W.
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Reimpresiones y permisos
