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Artículo de método

Fabricación de Nanopattern gradiente térmico Nanoimprinting técnica y proyección de la respuesta de células formadoras de colonias endoteliales humanas

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DOI:

10.3791/57661

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1 de julio de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, Korea University, 2Department of Cardiology, Korea University Anam Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la fabricación de placas nanopattern gradiente vía térmica nanoimprinting y el método de proyección de las respuestas de las células progenitoras endoteliales humanas a las nanoestructuras. Usando la tecnología descrita, es posible producir un andamio que puede manipular el comportamiento de la célula por los estímulos físicos.

Resumen

Nanotopography puede encontrarse en diversas matrices extracelulares (ECMs) alrededor del cuerpo y se sabe que tienen importantes acciones reglamentarias sobre reacciones celulares. Sin embargo, es difícil determinar a la relación entre el tamaño de una nanoestructura y las respuestas de las células debido a la falta de herramientas de proyección adecuada. A continuación, os mostramos el desarrollo de placas nanopattern gradiente rentable y reproducible para la manipulación de respuestas celulares. Con óxido de aluminio anódico (AAO) como molde maestro, placas del gradiente nanopattern con nanopillars de gamas de diámetro creciente [120-200 nm (GP 120/200) 200-280 nm (GP 200/280) y 280-360 nm (GP 280/360)] fueron fabricados por un térmico impresión técnica. Estas placas nanopattern gradiente fueron diseñadas para imitar los diversos tamaños de nanotopography en el ECM y se utilizaron para las respuestas de células endoteliales humanas formadoras de colonias (hECFCs) de la pantalla. En este protocolo, se describe el procedimiento paso a paso de la fabricación de placas de gradiente nanopattern de ingeniería, técnicas de cultivo de hECFCs de sangre periférica humana y hECFCs en nanopattern las placas de cultivo celular.

Introducción

Recientemente, la respuesta de las células por la estimulación física de la topografía de la superficie ha sido destacó en el campo de la célula ingeniería1,2,3,4. Por lo tanto, más atención se ha centrado en nanoestructuras tridimensionales en el accesorio de celular superficial5. Se ha reportado que la integrina, que es el dispositivo de reconocimiento de superficie de la célula, transmite el estímulo físico por las estructuras micro-nano de ECM a través de la Mecano-transducción6. Este estímulo mecánico regula el comportamiento de la célula a través de la dirección de contacto7 e induce reorganización citoesquelética a cambiar de forma, además de adherencias focales y la rigidez de las células8.

Las células progenitoras endoteliales humanas (hEPCs) en el cuerpo cerca interactúan con el microambiente de la ECM circundante9. Esto indica que el estado físico de lo ECM actúa como un parámetro importante para la formación de complejos de adhesión célula-matriz específica en cuanto a tensión de esquileo derivado del flujo de sangre10. Se divulga que aumenta la superficie nanotopography en vitro la formación de redes extensas de tubo capilar de hEPCs11 y que un factor soluble de ECM/bio sistema combinado permite hEPCs reconocer sustratos disfuncionales y promueve de la herida curativo de12,13. Sin embargo, la relación entre ECM y hEPCs no se entiende claramente.

Aunque muchos investigadores trataron de aclarar la relación entre las respuestas celulares y señales físicas de diferentes sustratos14,15,16, estos estudios utilizaron solamente el tamaño fijo de una nanoestructura o nanopatrones con arreglos irregulares que tienen una limitación para aclarar la relación entre el tamaño del comportamiento de nanoestructura y celular. El problema es la falta de herramientas adecuadas para la detección de respuestas celulares que pueden sustituir a los enfoques existentes tediosos e iterativos para encontrar el tamaño óptimo de la nanoestructura. Por lo tanto, una técnica sencilla se requiere para la detección de las reacciones celulares en estímulos físicos sin repetición.

Aquí, describimos un método utilizado en nuestros anteriores informes17,18,19 para producir un gradiente nanopattern que aumenta gradualmente el diámetro de la nanopillars dispuesto. Además, también hemos descrito cómo cultivar y analizar el comportamiento de hECFCs en placas nanopattern gradiente para determinar el efecto de los estímulos físicos en las células. Un suave anodizado grabado gradual y método de recubrimiento de la capa anti-sticking fueron utilizados para fabricar molde AAO degradado. Mediante la adopción de un térmico impresión técnica de litografía, idénticos nanopatrones gradiente poliestireno fueron producidos de manera rentable y fácil. Utilizando el gradiente nanopatrones, es factible determinar que tamaño de nanoestructura tiene un gran efecto sobre el comportamiento de células en un sistema del experimento. Esperamos que este gradiente nanopattern será útil en la comprensión de los mecanismos de interacción entre hECFC de derivados de sangre u otras células y varios tamaños de nanoestructuras.

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Protocolo

Este estudio fue aprobado por la Junta de revisión institucional en el Hospital de Anam de la Universidad de Corea (IRB no. ED170495). Todos los procedimientos se llevaron a cabo con arreglo a la declaración de Helsinki y sus enmiendas posteriores.

1. preparación del sustrato de aluminio (Al) por electropulido

PRECAUCIÓN: Solución de electropulido es corrosivo y tóxico. Use equipo de protección personal como guantes de nitrilo, gafas protectoras y bata de laboratorio. Realizar este paso en una campana de humos.

  1. Preparar la solución de electropulido mezclando ethyl alcohol (C2H5OH, 99.9%) y ácido perclórico (HClO4, 60%) en un vaso de precipitado de doble chaqueta de 1 L (C2H5OH:HClO4 = 4:1).
  2. Conectar el vaso de doble chaqueta con un circulador y ajustar la temperatura a 7 ° C. Poner el vaso de doble camisa en un agitador magnético. Deje la solución bajo agitación durante al menos 30 minutos hasta que la temperatura baja a 7 ° C.
  3. Sumerja la placa Al alta pureza (99.999%, de 20 × 50 × 1 mm3) y contraelectrodo de carbono en la solución de electropulido con pinzas y el alambre de cobre. Ajustar la posición de la placa de Al y el contraelectrodo de carbono frente a frente.
    Nota: Es necesario instalar los clips con cuidado para no tocar la solución. En contacto con la solución, las impurezas que sale de los sujetadores pueden contaminar la placa Al.
  4. La placa Al conectar el terminal positivo y el electrodo de carbono del contador a la terminal negativa, de una corriente directa (DC) fuente de alimentación.
  5. Apague el agitador magnético y aplique un voltaje de 20 V. mantener este estado durante 4 minutos.
  6. Encender el agitador magnético y permitir que la corriente fluya por otro min 6.
    Nota: La condición estática quita la mayor parte de las impurezas y la rugosidad de la placa de Al, y la condición dinámica mejora la calidad final del electropulido.
  7. Apague la fuente de alimentación y separar manualmente la placa del clip. Lave rigurosamente la placa con agua desionizada para eliminar toda la solución restante.
  8. Secar la placa Al nitrógeno y tienda bajo gas inerte. Llevar a cabo este proceso de secado al final de todos los experimentos en el paso 1 y 2.
    Nota: Al inyectar aire comprimido, asegúrese de flujo de aire de la parte Brillante hacia el lado opuesto. En caso contrario, las impurezas pueden escapar de la parte no pulida y contaminar la placa Al.

2. fabricación del molde de la AAO degradado con electrolito de ácido fosfórico

PRECAUCIÓN: Alcohol metílico y sus vapores son tóxicos oculares. Continua exposición al cromo puede conducir a intoxicación con cromo grave. Realizar este paso en una campana de humos.

  1. Anodización primaria
    1. Para preparar 1 L de ácido fosfórico del electrólito, cargar 590 mL de agua desionizada en un frasco de vidrio.
    2. Añadir 400 mL de alcohol metílico (CH3OH, 99%) y 10 mL de ácido fosfórico (H3PO4, 85%) en la botella de vidrio. Mezcle la solución bien agitando manualmente o con agitación magnética.
    3. Vierta 500 mL de electrólito en un vaso de precipitados de 1 L doble. Sumerja el pulido Al plato y carbono contador electrodo en la solución con pinzas y el alambre de cobre.
    4. Vierta el electrólito adicional para localizar el límite de 2-3 mm sobre la superficie de la solución de electropulido.
      Nota: Si la anodización se lleva a cabo con el límite de contacto con la solución de electropulido, la placa Al tiende a quemar durante la anodización.
    5. Instalar un eje vertical sobre un pedestal en forma de U. Coloque un agitador arriba y el impulsor con abrazaderas metálicas. Posición de la hélice del ventilador cerca del extremo inferior de ambos electrodos. Ajustar la velocidad de rotación del agitador arriba entre 200 y 300 rpm.
    6. Conectar el vaso de doble chaqueta con un circulador y ajustar la temperatura a-10 ° C. Salir del sistema para al menos 1 h bajo agitación hasta que la temperatura baja a-10 ° C.
      Nota: No use agua como refrigerante. Porque el agua se congela a bajas temperaturas, la circulación no funcionará normalmente. Se recomienda utilizar una mezcla de agua y alcohol etílico en una proporción de 1:1 como el refrigerante.
    7. Aplique un voltaje de 195 V bajo agitación por 16 h.
      Nota: Si la corriente eleva más de 50 mA dentro de 2 o 3 h después de aplicar el voltaje, la probabilidad de que se produzca ardor es muy alta. Inmediatamente, detener el proceso y vuelva a colocar la placa con una nueva. Si este problema se produce repetidamente, compruebe que no hay ninguna anormalidad en el control de temperatura del circulador. Si no hay ninguna anormalidad, cambiar el electrolito.
    8. Detenga la fuente de alimentación y separar manualmente la placa del clip. Lave la placa Al anodizado con agua desionizada para eliminar toda la solución restante.
  2. Grabado de alúmina
    1. Preparar el ácido crómico aguafuerte solución disolviendo 9,0 g de óxido de cromo (CrO3) y 20,3 mL de ácido fosfórico (H3PO4, 85%) en 500 mL de agua desionizada.
    2. Vierta la solución de la aguafuerte en el vaso de doble chaqueta de 1 L. Ajustar la temperatura a 65 ° C.
    3. Sumerja la placa anodizada de en la solución de la aguafuerte para al menos 10 h bajo agitación. Selle la parte superior del vaso con papel de aluminio.
    4. Enjuagar la placa Al grabado varias veces con agua desionizada.
  3. Anodización secundaria
    1. Establecer las mismas condiciones experimentales como paso 2.1.1 a 2.1.7.
    2. Cargue la placa Al grabado al ánodo del sistema y aplicar una tensión de 195 V para 6 h. A continuación, apague la fuente de alimentación y separar manualmente la placa del clip. Inmediatamente Lave la placa Al anodizado con agua desionizada.
      Nota: Cuando se retrasa el tiempo de lavado, el tamaño del poro del AAO aumenta sin querer debido al ácido fosfórico residual.
  4. Ensanchamiento del gradiente poro
    1. Preparar una solución de ampliación de poro disolviendo 5,765 g de ácido fosfórico en 500 mL de agua desionizada. Verter la solución en un vaso de precipitados de 1 L doble.
    2. Conectar el vaso de doble chaqueta con circulador y ajustar la temperatura a 30 ° C. Lugar una etapa móvil lineal verticalmente al lado de la taza. Coloque una abrazadera a la parte móvil de la etapa lineal.
    3. Ajuste la parte móvil de la etapa lineal a la posición inicial. Conecte la pinza al soporte y cargar la placa Al anodizado.
    4. Manipular manualmente la posición de la placa Al modo que la placa Al llegará justo por encima de la superficie de la solución.
      Nota: En este paso, la placa Al no debe tocar la solución. El poro ampliación proceso empieza tan pronto como la placa Al llega a la solución.
    5. Poco a poco, sumerja la placa en la solución a una velocidad de 4,86 μm/s 120 min hacer un molde AAO de 35 mm con un tamaño de gradiente de 120 nm a 200 nm (GP 120/200). Poner en marcha un cronometro en el momento de que la placa Al toque la superficie de la solución.
    6. Para hacer los moldes de GP 200/280 y 280/360 GP, sumerja el área entera del molde de la GP 120/200 en el poro ampliación solución para 2 o 4 h, respectivamente.
    7. Enjuagar la placa Al gradiente varias veces con agua desionizada.

3. deposición de capa anti-que se pega en AAO gradiente molde con uno mismo-montado monocapa

Nota: Realice los pasos 3.2.1 a 3.3.3 en una caja de guantes. Conecte una bomba de vacío y el inyector de gas de nitrógeno seco a la guantera. Colocar todas las muestras, reactivos y aparatos en la guantera antes del proceso de deshumidificación. Repetir el ciclo de inyección de gas nitrógeno y evacuación más de tres veces para eliminar adecuadamente la humedad de la guantera. Dejar que el nitrógeno seco atraviesa el experimento.

  1. Modificación del oxhidrilo del molde de la AAO con tratamiento de piraña
    1. Vierta 140 mL de ácido sulfúrico (H2SO4, 95%) en un vaso de precipitados de politetrafluoroetileno (PTFE). Añadir 60 mL de peróxido de hidrógeno gota a gota (H2O2, 30%). Dejar durante 30 minutos hasta que la solución se ha enfriado.
      PRECAUCIÓN: Sea extremadamente cuidadoso cuando solución piraña. Desde el momento de la adición de peróxido de hidrógeno, la solución se hierve vigorosamente y genera altas temperaturas. Realizar el experimento en una campana de humos.
    2. Sumerja el molde de la AAO en la solución durante 30 s utilizando un no-metálico pinzas.
    3. Enjuague el molde AAO varias veces con agua desionizada. Sumerja el molde en agua desionizada durante 30 min y ponerla en alcohol metílico durante otros 30 minutos.
      PRECAUCIÓN: Cuando se deshaga la solución Piraña, diluir la solución con una cantidad abundante de agua.
    4. Secar completamente el molde AAO bajo vacío durante 3 horas.
  2. Preparación de solución madre de 20 × HDFS
    Nota: HDFS es una abreviatura de (heptadecafluoro-1,1,2,2, - tetrahydrodecyl) dimethylchloro-silano
    1. Llene un tercio de una botella de 1 L n-hexano con tamices moleculares. Sello de la botella con la película de parafina y guárdelo bajo nitrógeno seco durante 24 horas.
    2. Filtro de 200 mL de n-hexano con una jeringa de vidrio y filtro de PTFE de la jeringuilla de 0,2 μm.
    3. Vierta los 80 mL de n-hexano filtrada en una botella de vidrio de 100 mL. Añadir 2 mL de HDFS.
  3. Deposición de capa monomolecular uno mismo-montado
    1. Carga 57 mL de n-hexano filtrado en un vaso de precipitados de 100 mL. Sumerja el molde de la AAO en el solvente.
    2. Añadir 3 mL de solución madre de HDFS a n-hexano para hacer solución de HDFS 2,9 mM. Esperar 10 minutos para la reacción proceder.
    3. Transferir el molde AAO a fresco n-hexano. Cierre y selle todas las botellas de reactivo. Cierre la válvula de nitrógeno, luego saque las muestras de la guantera.
      Nota: HDFS es extremadamente sensible a la humedad. Conservar todos los reactivos que contienen HDFS en un desecador.
    4. Sumerja el molde de la AAO en 60 mL de methoxynonafluorobutane (C10H6F18O2, 99%). Limpie ultrasónicamente el molde de la AAO en un vaso de precipitados de 10 s por eliminar físicamente una vez adsorbidas moléculas HDFS. Repita el procedimiento de limpieza 10 veces.
      Nota: Exponer el molde AAO a ultrasonidos durante mucho tiempo sin intervalos dañan la capa de óxido.
    5. Secar completamente el molde de la AAO en vacío durante 24 horas.
      Nota: Una capa anti-que se pega con éxito depositada es super repelente al agua y estable durante meses si se almacena en un desecador. El protocolo puede hacer una pausa aquí.

4. fabricación de placas de Nanopattern gradiente de impresión térmica

Nota: Realice los pasos 4.2 a 4.7 en una sala limpia.

  1. Cortar una lámina de poliestireno espesor de 1.1 mm a un tamaño de 2,9 mm de ancho por 3,7 mm de largo con un cortador de circuito impreso (PWB).
  2. Cortar el molde de la AAO 35 mm desde la parte inferior con una pinza. Marque el nombre de la muestra y fecha de fabricación en la parte posterior.
  3. Limpiar un 8.0" oblea con una pequeña dosis de alcohol etílico. Poner las hojas de poliestireno en la oblea, luego Monte el molde de la AAO.
  4. Puso la película de fondo en el cajón de un imprinter termal. Fije la película superior a la Junta.
  5. Poner la oblea en la película de fondo. Coloque la Junta en la oblea. Asegúrese de que no hay polvo en la oblea.
  6. Cierre el cajón del imprinter termal. Aplicar 165 ° C de calor y 620.52 kPa de presión de 100 s.
  7. Enfriar la muestra a temperatura ambiente. Gire con cuidado la lámina de poliestireno para soltar el molde de la AAO.

5. esterilización e hidrofílico modificación del gradiente Nanopattern placas

  1. Coloque las placas de nanopattern en un plato cuadrado. Vierta 100 mL de alcohol etílico al 70% y exponer a la luz ultravioleta durante 30 minutos.
  2. Secar las placas de nanopattern con nitrógeno. Transferir las placas de nanopattern a un generador de plasma de oxígeno.
  3. Evacuar la cámara hasta llegar a 1.33 PA. A continuación, inyectar oxígeno a una velocidad de 30 cm3/min aplica una potencia de frecuencia de radio de 60 w. de mantener el plasma de oxígeno para 90 s.
    Nota: Se recomienda utilizar placas de nanopattern tratados con plasma dentro de 14 días.
  4. Coloque la placa de nanopattern en la parte inferior de una placa de cultivo celular con una gota de tolueno.
  5. Sellar las muestras en una bolsa y esterilizar con el esterilizador del plasma de baja temperatura.

6. cultivo de hECFCs

Nota: Llevar a cabo todos los procedimientos de centrifugación a 4 ° C a menos que se indique lo contrario.

  1. Antes de aislar de la sangre periférica células mononucleares (PBMCs), incubar una placa de colágeno cubierto 12-bien cultivo a 37 ° C por 1 h.
  2. Lave la placa de cultivo de 12 pozos con 1 × tamponada de fosfato estéril salino (PBS).
  3. Recoger 50 mL de sangre humana mediante un tubo de inhibidor de la heparina.
  4. Poner 6 mL de solución de polisacárido hidrofílico en un tubo de 15 mL y añadir 8 mL de sangre a la solución de polisacárido hidrofílico.
    Nota: Lentamente pipetee la sangre en la solución de polisacárido hidrofílico.
  5. Centrifugar el tubo a 1020 x g por 20 min para que sedimenten las células.
  6. La capa opaca de la célula de la cosecha y traslado a un nuevo tubo de 15 mL.
  7. Agregar 10% de suero bovino fetal (FBS)-contenía PBS y centrifugar el tubo a 1020 x g durante 10 minutos para que sedimenten las células.
  8. Quite el sobrenadante y añadir tampón de lisis de glóbulos rojos. Mantener en hielo durante 5 minutos.
  9. Agregar 10% FBS contenía PBS y centrifugar el tubo a 1020 x g durante 5 minutos para que sedimenten las células.
  10. Quite el sobrenadante y añadir 10% FBS contenía PBS. Centrifugar el tubo a 1020 x g durante 5 minutos para que sedimenten las células.
  11. Quite el sobrenadante y agregar 1 mL de células endoteliales expansión suplementado con 10% FBS. 8,0 x 106 células por pozo para cada plato cubierto de colágeno de la semilla.
  12. Cambiar el medio de cultivo cada día durante 1 semana. A continuación, cambiar el medio de cultivo cada 2 días.
    Nota: hECFCs se puede encontrar después de 10-14 día de la cultura. hECFCs Mostrar típica empedradas-como morfología y forma una colonia que se observan en microscopía de contraste de fase. Tinción de inmunofluorescencia de cadherin endotelial vascular (CD144) y factor de von Willebrand (vWF) se puede realizar también para la caracterización de la hECFCs después de la expansión celular.
  13. Para cultivar el hECFCs, usar células endoteliales expansión suplementado con 5% FBS y penicilina/estreptavidina a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO2. Reemplazar el medio una vez al día.
  14. Después de la inducción hECFC, crecen las células al paso 7 para experimentos adicionales.

7. siembra de células y de la cultura en las placas de Nanopattern gradiente

Nota: Paso 7 describe la cultura de hECFCs en la placa del gradiente nanopattern, pero también se pueden utilizar otras fuentes de células.

  1. Capa la gradiente nanopattern placas con 1 mL de solución de recubrimiento de proteína de 0.1% en PBS por 10 min a temperatura ambiente.
    Nota: La capa de proteína 0,1% no cubre las características de nanopillar.
  2. Hacer una suspensión de hECFCs de la placa de cultivo por un método estándar de separación de células mediante tripsina.
  3. Diluir la suspensión de células para lograr la confluencia deseada. La hECFCs en las placas de nanopattern gradiente y plano control (por ejemplo, 1,0 × 104 células/cm2) de la semilla.
    Nota: Cuando hECFCs se siembran en 1,0 × 104 células/cm2 en las placas de nanopattern gradiente, la confluencia de células generalmente alcanza a 70-80% después de 2 días.
  4. Las células en las placas planas o gradiente nanopattern de la cultura durante 2 días en la incubadora.

8. observación y análisis

  1. Proyección de imagen de microscopio electrónico de barrido (SEM)
    1. Fix hECFCs cultivadas en placas de nanopattern plano o degradado con glutaraldehído al 2,5% a 4 ° C para pasar la noche.
    2. Tratar el tetraóxido de osmio 1% durante 1 h a temperatura ambiente. Muestras de lavado con PBS.
    3. Deshidratan las muestras con alcohol etílico de baja a alta concentración (50%, 70%, 80%, 90% y 100%) durante 10 minutos por cada paso.
    4. Tratar hexamethyldisilazane (HMDS) durante 15 min a temperatura ambiente. Después, lavar las muestras con HMDS fresco y dejar las muestras bajo la campana por lo menos 1 día hasta los HMDS residual se evapora completamente.
    5. Cubrir las muestras con Barnizadora a Farfulle platino durante 5 minutos y examinar las muestras con un SEM.
  2. Imagen de microscopio electrónico (MET) de transmisión
    1. Fix hECFCs cultivadas en placas de nanopattern plano o degradado con 2% paraformaldehído y 2.5% glutaraldehído en PBS a 4 ° C para pasar la noche.
    2. Realizar la fijación con tetróxido de osmio 1% y deshidratar muestras utilizando el método en 8.1.3.
    3. Incrustar las muestras en resina de epoxy. Hacer secciones de 60 nm espesor de bloques y colocar una sección en una cuadrícula TEM.
    4. Mancha de la sección con la mezcla de acetato de uranilo de 10 mg en 100 mL de alcohol de metilo y citrato de plomo de 0.1 mg en 100 mL de agua destilada. Obtener imágenes con un TEM.
  3. Tinción de fluorescencia
    1. Fix hECFCs cultivadas en placas de nanopattern plano o degradado con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 15 minutos.
    2. Permeabilizar y bloque de muestras con cabra 5% suero y 0.1% Octilfenol etoxilato de nonilfenol en PBS (SAFT) a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    3. Incubar las muestras con anticuerpo primario contra vinculina (1: 500 en SAFT) a temperatura ambiente para muestras de 2 h. Enjuague tres veces con SAFT.
    4. Incubar las muestras con fluorescencia conjugado phalloidin (1:1, 000 en SAFT), conjugado fluorescencia de anticuerpo secundario (1:1, 000 en SAFT) a temperatura ambiente para muestras de 2 h. Enjuague tres veces con SAFT.
    5. Incubar las muestras con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1,000 en SAFT) a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    6. Colocar 10 μl de medio de montaje en la superficie del gradiente nanopattern. Coloque un cubreobjetos sobre el medio de montaje.
    7. Coloque la muestra boca abajo en el escenario de la muestra y adquirir imágenes con el microscopio de fluorescencia confocal.
  4. Análisis de imagen
    1. Transferencia de imágenes capturadas de la hECFCs a un sistema de análisis de imagen.
    2. Seleccione el campo al azar de phalloidin coloración de imagen. Ajustar el umbral y crear una imagen binaria en el que las células son distintas del fondo.
    3. Dibujar contornos alrededor de las células para medir el área de la célula y perímetro y contar manualmente el número de filopodios por la célula.
    4. Seleccione el campo al azar de la vinculina manchando la imagen. Ajustar el umbral y crear una imagen binaria de áreas focales de adherencia.
      Nota: Ajuste umbral de imagen para evitar artificial sobre - o debajo - filling de áreas focales de adherencia.
    5. Contar el número de adherencia focal de cada célula.

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Resultados


La figura 1 muestra imágenes de SEM de los moldes fabricados de AAO gradiente según su tipo y posición. La figura 2 muestra imágenes de SEM de placas gradiente nanopattern con nanopillars regular-redondeadas y figura 3 cuantificación datos del diámetro del nanopillar. La tabla 1 enumera las características de la nanopillars fabricado.

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Discusión

Fabricación de un AAO a menudo adolece de defectos tales como grietas, formas irregulares de los poros y la quema. La razón principal de estos defectos se llama un desglose electrolítico, que es fuertemente afectado por la naturaleza de los sustratos de metal está anodizado y la resistividad del electrólito21. Puesto que la resistividad del electrolito varía dependiendo de su temperatura, eliminar calor continuamente de electrodos es el punto crítico para mantener la temperatura localización del e...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de educación, ciencia y tecnología (MEST) [NRF-2015R1D1A1A01060397] y Bio y desarrollo de tecnología médica Programa de la NRF financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y planeación de futuro [NRF-2017M3A9C6029563].

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido perclórico 60%Daejung Chemicals & Metales6512-4100
Alcohol etílico, absoluto 99.9%Daejung Chemicals & Metales4118-4100
Ácido fosfórico 85%Daejung Chemicals & Metales6532-4400
Alcohol metílico 99.5%Daejung Chemicals & Metales5558-4400
Óxido de cromo (VI)Daejung Chemicals & Metales2558-4400
Ácido sulfúrico 95%Daejung Chemicals & Metales7781-4100
Peróxido de hidrógeno 30%Daejung Chemicals & Metales4104-4400
n-hexano 95%Daejung Productos químicos & Metales4081-4400
Tolueno 99.5%Daejung Productos Químicos & Metales8541-4400
(heptadecafluoro-1,1,2,2,-tetrahidrodecilo)dimetilclorosilanoGelestSIH5840.4Sensible a la humedad
Metoxinonafluorobutano 99%Sigma aldrich464309
solución de colágenoStemcell#4902
GelatinaSigma aldrichG1890Solución
de recubrimiento de proteínasFicoll-PaqueGE Heathcare17-1440-03Solución de polisacárido hidrófilo
EGM-2MVLonzaCC-3202Medio de expansión de células endoteliales
Penicilina-EstreptomicinaGibco15140-122
Solución salina tamponada con fosfatoGibco10010031
Suero fetal bovinoGibco12483-020
ParaformaldehídoSigma aldrichP6148
GlutaraldehídoSigma aldrichG5882-100ML
Tetróxido de osmioSigma aldrich201030-1G
HexametildisilazanoSigma aldrich440191
Triton X-100Sigma aldrichX100-100MLEtoxilato de octilfenol 
Suero de cabraGibco26050-088
anticuerpo primario de vinculina humana Sigma aldrichV9131
Sonda de actina FSondas molecularesA12379Faloidina conjugada con fluorescencia
Alexa Fluor 488 anti-ratón conjugado  Anticuerpo IgGSondas molecularesA11001Anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia 
4',6-diamidino-2-fenilindol Sigma aldrichD9542
Medio de montajeDAKOS3023
Anticuerpo primario vWF humano DAKOA0082
Anti-humano  Anticuerpo primario CD144 BD Biociencias#555661
Eponate 12&comercio; Kit de incrustación, con BDMATed Pella18012Resina epoxi
Acetato de uranilo, 25gTed Pella19481
Citrato de plomo, Trihidrato, 10gTed Pella19312
Placa de aluminio ultra puroGoodfellow26050-088
Lámina de poliestirenoGoodfellowST313120
oblea de silicio de 8,0"Siltron29-01024-03Pulido por una cara, 725 y micro;
Desecador de vacío de m de espesor, 4,4 LKartellKA.230
Bomba de vacíoAspiradorV3. VOP100
Fuente de alimentaciónUnicorntechUDP-3003
Agitador magnéticoDaihan scientificSL.
AgitadorDaihan scientificHT120DX
CirculadorDaihan scientificWCR-P12
Platina móvil linealZaberA-LSQ300A-E01-KT07
Soporte angular, 90 gradosZaberAB90MAccesorio de la platina móvil lineal
Pinza PMP, 145 mmVitlab67995Pinza no metálica
Vaso de precipitados de PTFE, 250 mLCowieCW007.25
Limpiador ultrasónicoBransonB2510MTH
Cortador de PCBHozan Tool IndustrialK-110
Dispositivo de nanoimpresiónNanonexNX-2000
Generador de plasma de oxígenoFemto ScienceCUTE
Esterilizador de baja temperaturaLowtemCrystal 50
CO2 IncubadoraPanasonicMCO-18AC
ConfoalCarl ZeissLSM700
Microscopio electrónico de barridoJEOLJSM6701
Microscopio electrónico de transmisiónHitachiH-7500
SMS03022 aéreo Microscopio láser de barrido

Referencias

  1. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nature materials. 13 (6), 558-569 (2014).
  2. Qian, W., Gong, L., Cui, X., Zhang, Z., Bajpai, A., Liu, C., Castillo, A., Teo, J. C., Chen, W. Nanotopographic Regulation of Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (48), 41794-41806 (2017).
  3. Naganuma, T. The relationship between cell adhesion force activation on nano/micro-topographical surfaces and temporal dependence of cell morphology. Nanoscale. 9 (35), 13171-13186 (2017).
  4. Han, J., Lin, K. H., Chew, L. Y. Study on the regulation of focal adesions and cortical actin by matrix nanotopography in 3D environment. Journal of Physics: Condensed Matter. 29 (45), 455101(2017).
  5. Liu, X., Wang, S. Three-dimensional nano-biointerface as a new platform for guiding cell fate. Chemical Society Reviews. 43 (8), 2385-2401 (2014).
  6. Turner, L. A., Dalby, M. J. Nanotopography-potential relevance in the stem cell niche. Biomaterials science. 2 (11), 1574-1594 (2014).
  7. Driscoll, M. K., Sun, X., Guven, C., Fourkas, J. T., Losert, W. Cellular contact guidance through dynamic sensing of nanotopography. ACS nano. 8 (4), 3546-3555 (2014).
  8. Yim, E. K., Darling, E. M., Kulangara, K., Guilak, F., Leong, K. W. Nanotopography-induced changes in focal adhesions, cytoskeletal organization, and mechanical properties of human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (6), 1299-1306 (2010).
  9. Davis, G. E., Senger, D. R. Endothelial extracellular matrix. Circulation research. 97 (11), 1093-1107 (2005).
  10. Nakayama, K. H., Surya, V. N., Gole, M., Walker, T. W., Yang, W., Lai, E. S., Ostrowski, M. A., Fuller, G. G., Dunn, A. R., Huang, N. F. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano letters. 16 (1), 410-419 (2015).
  11. Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. Enhancement of in vitro capillary tube formation by substrate nanotopography. Advanced materials. 20 (1), 99-103 (2008).
  12. Katz, B. Z., Zamir, E., Bershadsky, A., Kam, Z., Yamada, K. M., Geiger, B. Physical state of the extracellular matrix regulates the structure and molecular composition of cell-matrix adhesions. Molecular biology of the cell. 11 (3), 1047-1060 (2000).
  13. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  14. Tajima, S., Chu, J., Li, S., Komvopoulos, K. Differential regulation of endothelial cell adhesion, spreading, and cytoskeleton on low-density polyethylene by nanotopography and surface chemistry modification induced by argon plasma treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 84 (3), 828-836 (2008).
  15. Mohiuddin, M., Pan, H. A., Hung, Y. C., Huang, G. S. Control of growth and inflammatory response of macrophages and foam cells with nanotopography. Nanoscale research letters. 7 (1), 394(2012).
  16. Kyle, D. J., Oikonomou, A., Hill, E., Bayat, A. Development and functional evaluation of biomimetic silicone surfaces with hierarchical micro/nano-topographical features demonstrates favourable in vitro foreign body response of breast-derived fibroblasts. Biomaterials. 52, 88-102 (2015).
  17. Seo, H. R., Joo, H. J., Kim, D. H., Cui, L. H., Choi, S. C., Kim, J. H., Cho, S. W., Lee, K. B., Lim, D. S. Nanopillar Surface Topology Promotes Cardiomyocyte Differentiation through Cofilin-Mediated Cytoskeleton Rearrangement. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (20), 16803-16812 (2017).
  18. Hwang, J. H., Lee, D. H., Byun, M. R., Kim, A. R., Kim, K. M., Park, J. I., Oh, H. T., Hwang, E. S., Lee, K. B., Hong, J. H. Nanotopological plate stimulates osteogenic differentiation through TAZ activation. Scientific Reports. 7 (1), 3632(2017).
  19. Bae, D., Moon, S. H., Park, B. G., Park, S. J., Jung, T., Kim, J. S., Lee, K. B., Chung, H. M. Nanotopographical control for maintaining undifferentiated human embryonic stem cell colonies in feeder free conditions. Biomaterials. 35 (3), 916-928 (2014).
  20. Cui, L. H., Joo, H. J., Kim, D. H., Seo, H. R., Kim, J. S., Choi, S. C., Huang, L. H., Na, J. E., Lim, I. R., Kim, J. H. Manipulation of the response of human endothelial colony-forming cells by focal adhesion assembly using gradient nanopattern plates. Acta biomaterialia. 65, 272-282 (2017).
  21. Lee, W., Park, S. J. Porous anodic aluminum oxide: anodization and templated synthesis of functional nanostructures. Chemical reviews. 114 (15), 7487-7556 (2014).
  22. Masuda, H., Fukuda, K. Ordered metal nanohole arrays made by a two-step replication of honeycomb structures of anodic alumina. science. 268 (5216), 1466(1995).
  23. Masuda, H., Satoh, M. Fabrication of gold nanodot array using anodic porous alumina as an evaporation mask. Japanese Journal of Applied Physics. 35 (1B), L126(1996).
  24. Zaraska, L., Sulka, G. D., Jaskuła, M. The effect of n-alcohols on porous anodic alumina formed by self-organized two-step anodizing of aluminum in phosphoric acid. Surface and Coatings Technology. 204 (11), 1729-1737 (2010).
  25. Yang, K. Y., Kim, J. W., Byeon, K. J., Lee, H. Selective deposition of the silver nano-particles using patterned the hydrophobic self-assembled monolayer patterns and zero-residual nano-imprint lithography. Microelectronic engineering. 84 (5), 1552-1555 (2007).
  26. Park, B. G., Lee, W., Kim, J. S., Lee, K. B. Superhydrophobic fabrication of anodic aluminum oxide with durable and pitch-controlled nanostructure. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 370 (1), 15-19 (2010).

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