Aquí, presentamos un procedimiento para fluorescencia funcionalizar los disulfuros de Qβ VLP con dibromomaleimide. Describimos Qβ expresión y purificación, la síntesis de moléculas de dibromomaleimide funcionalizados y la reacción de Conjugación entre dibromomaleimide y Qβ. La partícula conjugada fluorescente amarillo resultante puede utilizarse como una sonda de fluorescencia dentro de las células.
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Artículo de método
Lo verbal-inducida fluorescentes pegilado Virus-como partículas por disulfuro de Dibromomaleimide química
En este artículo
Resumen
Resumen
La reciente subida de partículas similares a virus (VLPs) en biomédica y la investigación de materiales puede ser atribuido a su facilidad de biodegradabilidad, tamaño discreto, programación genética y biosíntesis. Mientras que son altamente susceptibles a reacciones bioconjugation por adición de ligandos sintéticos en su superficie, la gama en metodologías bioconjugation en estos cápsida nacido acuosa es relativamente limitada. Para facilitar la dirección de investigación de biomateriales funcionales, deben considerarse reacciones bioconjugation no tradicionales. La reacción que se describe en este protocolo utiliza dibromomaleimides para introducir nuevas funcionalidades en el solvente a base de disulfuro expuesta de una VLP al bacteriófago Qβ. Además, el producto final es fluorescente, que tiene la ventaja de generar una sonda rastreables en vitro usando un conjunto de filtros comercialmente disponibles.
Introducción
Utilizando nanopartículas de cápsida viral ha surgido como un campo interesante, que pretende ampliar el alcance de las aplicaciones en investigación biomédica1,2,3. Por vía recombinante expresadas virus-como partículas (VLPs) son estructuralmente derivadas de virus, pero tienen el material genético viral original haciendo que no infecciosas proteináceas nanopartículas. Como las características superficiales están genéticamente programadas y cada cápside se expresa idénticamente a los antes y después de él, es posible conocer la ubicación y el número de cadenas laterales reac....
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Protocolo
1. preparación
- Hacer agar caldo (LB) de lisogenia y verter placas12.
-
Transformar BL21(DE3) con un plásmido pET28 que contiene la secuencia de la proteína de wtQβ capa.
- Descongelar las células competentes de e. coli BL21(DE3) en un baño de hielo. Depositar 50 μL de las células en un tubo de microcentrífuga.
- Añadir 2 μL del plásmido en un tubo y mueva suavemente el tubo. Luego incubar en hielo durante 30 minutos.
- Choque térmico las células para 45 s en un baño de agua a exactamente a 42 ° C. Coloque el tubo en el baño de hielo inmediatamente después del choque de calor....
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Resultados
Los derivados de dibromomaleimide se pueden sintetizar mediante la reacción de condensación entre el anhídrido dibromomaleimide y aminas primarias15. Como alternativa, un método sintético suave16 usando N-Metoxicarbonil activado 3,4-dibromomaleimide fue explotada aquí reaccionando con metoxipolietilen glicol (PEG) al rendimiento DB-PEG (figura 1). NMR fue utilizada para identificar la estructura compuesta (
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Discusión
En comparación con purificación de proteínas más pequeñas, un único paso en la purificación de bacteriófago Qβ es la centrifugación del gradiente de sacarosa. Después del paso de extracción de cloroformo/n-butanol, Qβ más se purifica mediante gradientes de sacarosa 5-40%. Durante la centrifugación, las partículas se separan en base a sus tamaños. Las partículas más grandes viajan a la región de densidad más alta, mientras que las partículas más pequeñas permanecen en la región de más baja densidad. Qβ viaja hasta el terc.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
J.J.G. reconoce la Fundación de ciencia nacional (DMR-1654405) y cáncer prevención Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) por su apoyo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Caldo LB (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Triptona, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Extracto de levadura, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Sulfato de magnesio anhidro | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Cloruro de sodio (cristalino/ACS certificado) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Cloruro de potasio | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga Sistema de purificación de agua PURELAB Flex 3 | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Fosfato de potasio monobásico | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Fosfato de potasio dibásico anhidro | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sacarosa | Fisher Scientific | ||
| Etanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Sulfato de amonio | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Cloroformo | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, cucharón oscilante, aluminio | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Juego | |
| tipo 70 Ti Rotor, ángulo fijo, Titanio, 8 x 39 mL,Beckman | Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Ensayo de proteínas | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Clorhidrato de | Investigación Productos Internacionales | T60050-1000.0 | |
| Tetrametiletilendiamina | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfina | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimida 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Politilenglicol Alfa | Aesar | 41561-22 | |
| Fosfato de sodio | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrilamida/bis-Acrilamida | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Dodecil sulfato de sodio | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Persulfato de amonio | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 microscopio de barrido láser confocal | Olympus | FV3000 | |
| Revólver Labnet Rotador Ajustable | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| Botella de alto rendimiento Sorvall de 1000 mL, PC, con tapa de aluminio | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Frascos de centrífuga Nalgene con tapas, copolímero de polipropileno | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Tubos de fondo redondo; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| Matraces Erlenmeyer de boca estrecha de 2 L con borde de alta resistencia | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Unidades de filtro centrífugo | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizador Procesador de materiales | Microfluídica | M-110P | |
| Nalgene Policarbonato de alta velocidad Tubos de centrífuga de fondo redondo | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Botella, con Conjunto de Tapón, Policarbonato | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cilindro, Graduado - Polipropileno 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| Serie 533LS-E Esterilizadores de Vapor | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Placa de Cultivo Celular, Tratada, PS, 96 Pocillos, con Tapa | LabSource | D36-313-CS | |
| Tubo de centrífuga cónico Falcon de 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Tubo de microcentífugo: 1,5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Agitador orbital VWR Os-500 | Productos VWR Scientifc 14005-830 | ||
| Sistemas de fundición a mano Tetra | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polipropileno, 250 ml | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Espectrofluorómetro NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Aguja larga | Hamilton | 7693 | |
| Jeringas Exel International 5 a 6 cc Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | ||
| Intel Pesaje PM-100 Laboratorio Clásico Balanza de laboratorio de alta precisión | Tecnología de ponderación inteligente | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Tubo de centrífuga cónico | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4– 15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 pocillos, 50 y micro; l | Bio-Rad | 456-1084 |
Referencias
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M.
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Reimpresiones y permisos
