Artículo de método

Lo verbal-inducida fluorescentes pegilado Virus-como partículas por disulfuro de Dibromomaleimide química

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DOI:

10.3791/57712

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27 de mayo de 2018

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1Department of Chemistry & Biochemistry, University of Texas at Dallas, 2Undergraduate Biology, University of Texas at Dallas, 3Undergraduate Healthcare Studies, University of Texas at Dallas, 4Departments of Chemistry & Biochemistry and Biomedical Engineering, University of Texas at Dallas

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un procedimiento para fluorescencia funcionalizar los disulfuros de Qβ VLP con dibromomaleimide. Describimos Qβ expresión y purificación, la síntesis de moléculas de dibromomaleimide funcionalizados y la reacción de Conjugación entre dibromomaleimide y Qβ. La partícula conjugada fluorescente amarillo resultante puede utilizarse como una sonda de fluorescencia dentro de las células.

Resumen

La reciente subida de partículas similares a virus (VLPs) en biomédica y la investigación de materiales puede ser atribuido a su facilidad de biodegradabilidad, tamaño discreto, programación genética y biosíntesis. Mientras que son altamente susceptibles a reacciones bioconjugation por adición de ligandos sintéticos en su superficie, la gama en metodologías bioconjugation en estos cápsida nacido acuosa es relativamente limitada. Para facilitar la dirección de investigación de biomateriales funcionales, deben considerarse reacciones bioconjugation no tradicionales. La reacción que se describe en este protocolo utiliza dibromomaleimides para introducir nuevas funcionalidades en el solvente a base de disulfuro expuesta de una VLP al bacteriófago Qβ. Además, el producto final es fluorescente, que tiene la ventaja de generar una sonda rastreables en vitro usando un conjunto de filtros comercialmente disponibles.

Introducción

Utilizando nanopartículas de cápsida viral ha surgido como un campo interesante, que pretende ampliar el alcance de las aplicaciones en investigación biomédica1,2,3. Por vía recombinante expresadas virus-como partículas (VLPs) son estructuralmente derivadas de virus, pero tienen el material genético viral original haciendo que no infecciosas proteináceas nanopartículas. Como las características superficiales están genéticamente programadas y cada cápside se expresa idénticamente a los antes y después de él, es posible conocer la ubicación y el número de cadenas laterales reactivas de los aminoácidos con precisión atomística. En muchos casos, las superficies exteriores e interiores poseen muchos tipos de residuos de solvente aminoácidos expuesta, que factible pueden ser funcionalizados a través bioconjugation reacciones - reacciones que forman enlaces covalentes entre una biomolécula y sintéticos molécula de4,5.

Reacciones bioconjugation ayudan biomoléculas de interés tienen funcionalidades más diversas de una manera relativamente sencilla. Moléculas de interés, como drogas terapéuticas6, etiquetas fluorescentes7 y polímeros8,9 pueden ser previamente sintetizadas y caracterizadas antes de que se colocan en la superficie de VLPs. Una VLP particularmente común en biomédica y la investigación de biomateriales ha sido la VLP basado en bacteriófago Qβ, que, como expresa por vía recombinante, es un 28 nm cápside viral icosaédrica10. Los sitios más comunes de la reacción en Qβ son lisinas por un amplio margen, aunque recientemente hemos comunicado verbal exitosa11 de dibromomaleimide compuestos a los disulfuros reducidos que los poros de Qβ vía una reacción Haddleton-Baker. La reacción procede con buen rendimiento y, lo que es igualmente importante, sin perder la estabilidad térmica de las partículas. Al mismo tiempo, esta reacción genera fluorescencia inducida por la verbal, que puede utilizarse para rastrear la captación de estas partículas en las células. En este trabajo demostramos la conjugación de polietilenglicol (PEG) en la superficie de Qβ a través de la reacción Haddleton-Baker, que se traduce en un fluoróforo amarillo brillante. Estas partículas pueden rastrearse como se toman las células. El Protocolo adjunto ayudarán a los investigadores generar pegilado fluorescente nuevas nanopartículas proteínico basadas en Qβ, aunque sus principios son aplicables a uno de los muchos otros VLPs que contienen solvente disulfuros expuestas.

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Protocolo

1. preparación

  1. Hacer agar caldo (LB) de lisogenia y verter placas12.
  2. Transformar BL21(DE3) con un plásmido pET28 que contiene la secuencia de la proteína de wtQβ capa.
    1. Descongelar las células competentes de e. coli BL21(DE3) en un baño de hielo. Depositar 50 μL de las células en un tubo de microcentrífuga.
    2. Añadir 2 μL del plásmido en un tubo y mueva suavemente el tubo. Luego incubar en hielo durante 30 minutos.
    3. Choque térmico las células para 45 s en un baño de agua a exactamente a 42 ° C. Coloque el tubo en el baño de hielo inmediatamente después del choque de calor e incubar durante 5 minutos.
    4. Agregar 950 μL de medio LB que no contiene ningún antibiótico.
    5. Agitar el cultivo a 200 rpm por 60 min a 37 ° C.
    6. Placa de 100 μL de la cultura en placas de agar LB (con kanamicina) e incubar la placa durante la noche a 37 ° C. Seleccione colonias blancas cuando sea necesario.
  3. Hacer los medios caldo óptimo Super (sollozo).
    1. Autoclave 2 L había desconcertado matraces Erlenmeyer en un ciclo de superdry.
    2. En un ambiente aséptico, pesar y añadir 20,0 g de triptona, extracto de 5,0 g de levadura, 2,469 g de sulfato de magnesio anhidro, 0,584 g de cloruro de sodio y 0,186 g de cloruro de potasio a cada matraz.
    3. Llevar el volumen a 1 L con agua ultrapura en cada frasco y autoclave en el ciclo líquido.
    4. Una vez que los medios de comunicación SOB ha alcanzado temperatura ambiente después de la esterilización en autoclave, añadir 1 mL de kanamicina (100 mg/mL) a cada litro de medio y guardar a 4 ° C.
  4. Hacer el tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
    1. Hacer solución monobásico de potasio de 1 M disolviendo 68,045 g de potasio monobásico en 500 mL de agua ultrapura.
    2. Hacen 1 M potasio dibásico solución disolviendo 87,09 g de potasio dibásico en 500 mL de agua ultrapura.
    3. Añadir 38,5 mL de solución de potasio monobásico y 61,5 mL de potasio dibásico a una botella de 1 L.
    4. Ajustar pH a 7.00 si es necesario y llevar a un volumen de 1 L.
  5. Hacer 5 – 40% gradientes de sacarosa en tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
    1. En tubos de centrífuga de 50 mL, preparar soluciones con sacarosa al 5 – 40% (aumentando en incrementos de 5%) disuelto en tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
    2. Depósito de 3,3 mL de solución de sacarosa al 5% en la parte inferior de un tubo de fondo redondo policarbonato 38 mL usando una jeringa de aguja larga y repetir este proceso para los otros cinco tubos.
    3. Depositar cuidadosamente 3,3 mL de solución de sacarosa del 10% en la parte inferior del tubo y retire con cuidado la aguja para no molestar el gradiente. Repita para los otros cinco tubos.
       
  6. Seguir depositar capas de 3,3 mL de soluciones de sacarosa, aumentando de 15% a 40% en cada tubo, teniendo cuidado para no perturbar el gradiente.
  7. Cuando termine, cubrir la parte superior de los gradientes con papel de aluminio y almacenar a-80 ° C.

2. expresión de Qβ

  1. Limpie el área del Banco con lejía y etanol de 1:1.
  2. Hacer dos culturas de arrancador 3 mL en un ambiente aséptico añadiendo solo colonias de e. coli BL21(DE3) en 3 mL de medio de sollozo en un ambiente aséptico.
  3. Crecen durante la noche en un agitador a 250 rpm en una habitación de 37 ° C y 0% de humedad relativa (HR).
  4. Sembrar cultura de arrancador en medio del sollozo:
    1. Sacar ambas culturas de arrancador 3 mL de la coctelera y, en un ambiente aséptico, vierta cada cultura de arrancador en uno de los dos 2 L desconcertado matraces Erlenmeyer con 1 L de frescas SOB los medios de comunicación en cada uno.
    2. Colocar el medio inoculado en un agitador a 250 rpm en una habitación de 37 ° C y 0% rH.
  5. Crecen las bacterias en un agitador a 250 rpm en una habitación de 37 ° C y 0% rH hasta OD600 0.9 – 1.0.
  6. Añadir 1 mL de 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) usando una pipeta P1000 para inducir la expresión de la proteína.
  7. Deja los medios de comunicación en la coctelera a 250 rpm en una habitación de 37 ° C y 0% HR durante la noche.
  8. Retire los medios de comunicación de la coctelera la mañana siguiente y centrífuga usando botellas de 1000 mL en 20.621 × g durante 1 h a 4 ° C para cosechar las células.
  9. Deseche el sobrenadante y recoger el precipitado de células.
    1. Vierta el sobrenadante en un matraz con aproximadamente 5 mL de blanqueador para matar las bacterias. Se trata de residuos.
    2. Use una espátula para raspar el precipitado de células de la parte inferior de la botella de centrífuga y poner el sedimento en un tubo de centrífuga de 50 mL.

3. purificación de Qβ

  1. Resuspender el precipitado de células con ~ 20-30 mL de tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
  2. Asegúrese de que la resuspensión no tiene trozos y lyse las células usando un procesador microfluidizer según protocolo del fabricante (véase Tabla de materiales). Lyse las células de al menos dos veces para aumentar el rendimiento de las partículas.
  3. Centrifugue el lisado en botellas de centrífuga de 250 mL a 20.621 x g durante 1 hora a 4 ° C.
  4. Descarte el precipitado y medir el volumen del sobrenadante en mL. Multiplicar ese valor por 0.265 y añadir esa cantidad de g de sulfato de amonio en el sobrenadante.
  5. Revuelva en 4 ° C durante al menos 1 h en una placa de agitación a 200 rpm a precipitar hacia fuera la proteína.
  6. Centrifugue en botellas de 250 mL a 20.621 x g durante 1 h a 4 ° C.
  7. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado con unos 10 mL de tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).
  8. Añadir volúmenes iguales de cloroformo 1:1 / n-butanol a la muestra cruda y mezclar con un vórtex durante unos segundos.
  9. Centrifugar en tubos de 38 mL en 20.621 × g durante 30 minutos a 4 ° C.
  10. Recuperar la capa acuosa superior utilizando una pipeta Pasteur. Tenga cuidado no para tomar el gel como capa que se ha formado entre la capa acuosa y orgánica.
  11. Descongelar seis 5 – 40% gradientes de sacarosa hecha de antemano y cargar unos 2 mL del extracto en cada uno.
  12. Ultracentrífuga 99.582 x g durante 16 horas a 4 ° C con la desaceleración libre.
  13. Brillar una luz de diodo (LED) en cada tubo de emisión de luz y una banda azul debe ser visible. Recuperar estas partículas con una jeringa de aguja larga.
  14. Ultrapellet las partículas a 370.541 x g durante 2,5 h a 4 ° C.
  15. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado transparente de partículas purificadas con tampón de fosfato de potasio de 0.1 M (pH 7,00).

4. cuantificación y confirmación del producto

  1. Utilice análisis de Bradford para cuantificar el producto13.
  2. Reducir la marcha y no reducir sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE) para confirmar el producto14.
    Nota: Reducción de SDS-PAGE se utiliza para confirmar el peso molecular de la proteína de la capa; no reducción de SDS-PAGE es confirmar la estructura de orden superior.

5. conjugar los compuestos DB en Qβ

  1. Reducir disulfuros en Qβ.
    1. Disolver 0,0020 g de tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) en 1 mL de agua ultrapura para hacer una solución stock de 100 x.
      Nota: Preparar TCEP fresco antes de la reducción.
    2. Añadir 200 μL de Qβ (5 mg/mL) en un tubo de microcentrífuga.
    3. Siga añadiendo 20 μl de solución stock de 100 x TCEP.
    4. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
  2. Volver a puente disulfuro reducido utilizando polietilenglicol dibromomaleimide (DB-PEG).
    1. Se disuelven 0,0017 g de dibromomaleimide-polietilenglicol (PEG-DB) en 100 μl de DMF.
    2. Añadir 680 μl de solución de fosfato de sodio 10 mM (pH 5.00).
    3. Añadir reducido Qβ en la solución de DB-PEG y observar el proceso de mezcla bajo una lámpara de UV 365 nm. La fluorescencia amarillo brillante puede ser visualizada inmediatamente con 365 nanómetro portátil UV lámpara con mezcla.
    4. Que la reacción proceda durante la noche a temperatura ambiente (RT) en un asador estilo rotisserie.
  3. Purificar la mezcla de reacción por filtro centrífugo (COMW = 10 kDa) tres veces utilizando 1 x PBS a 3.283 x g por 20 min a 4 ° C.
  4. Supervisar la conjugación por no reducción de SDS-PAGE y electroforesis del gel de agarosa al nativo.
    Nota: VLPs ejecutan como partículas intactas en gel de agarosa nativa, y son separados en base a su carga, tamaño y forma.

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Resultados

Los derivados de dibromomaleimide se pueden sintetizar mediante la reacción de condensación entre el anhídrido dibromomaleimide y aminas primarias15. Como alternativa, un método sintético suave16 usando N-Metoxicarbonil activado 3,4-dibromomaleimide fue explotada aquí reaccionando con metoxipolietilen glicol (PEG) al rendimiento DB-PEG (figura 1). NMR fue utilizada para identificar la estructura compuesta (

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Discusión

En comparación con purificación de proteínas más pequeñas, un único paso en la purificación de bacteriófago Qβ es la centrifugación del gradiente de sacarosa. Después del paso de extracción de cloroformo/n-butanol, Qβ más se purifica mediante gradientes de sacarosa 5-40%. Durante la centrifugación, las partículas se separan en base a sus tamaños. Las partículas más grandes viajan a la región de densidad más alta, mientras que las partículas más pequeñas permanecen en la región de más baja densidad. Qβ viaja hasta el terc...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

J.J.G. reconoce la Fundación de ciencia nacional (DMR-1654405) y cáncer prevención Research Institute of Texas (CPRIT) (RP170752s) por su apoyo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Caldo LB (Miller) EMD Millipore1.10285.0500
Triptona, PowederResearch Products InternationalT60060-1000.0
Extracto de levadura, PowederResearch Products InternationalY20020-1000.0
Sulfato de magnesio anhidroP212121CI-06808-1KG
Cloruro de sodio (cristalino/ACS certificado)Fisher ScientificS271-10
Cloruro de potasioFisher ScientificBP366-500
Elga Sistema de purificación de agua PURELAB Flex 3Fisher Scientific4474524
Fosfato de potasio monobásicoFisher ScientificBP362-1
Fosfato de potasio dibásico anhidroFisher ScientificP288-500
SacarosaFisher Scientific
EtanolFisher ScientificBP2818500
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)Sigma AldrichI6758-1G
Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor Fisher Scientific096-041053
Sulfato de amonioP212121KW-0066-5KG
CloroformoAlfa Aesar32614-M6
1-butanolFisher ScientificA399-4
SW 28 Ti Rotor, cucharón oscilante, aluminioBeckman Coulter342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Juego
tipo 70 Ti Rotor, ángulo fijo, Titanio, 8 x 39 mL,BeckmanCoulter337922
Coomassie (Bradford) Ensayo de proteínasFisher ScientificPI23200
TRIS Clorhidrato deInvestigación Productos InternacionalesT60050-1000.0
TetrametiletilendiaminaAlfa AesarJ63734-AC
Clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfinaSigma AldrichC4706-2G
2 3-Dibromomaleimida 97%Sigma Aldrich553603-5G
Politilenglicol AlfaAesar41561-22
Fosfato de sodioFisher ScientificAC424375000
Acrilamida/bis-AcrilamidaP212121RP-A11310-500.0
Dodecil sulfato de sodioSigma AldrichL3771-100G
Persulfato de amonioFisher ScientificBP179-100
FV3000 microscopio de barrido láser confocalOlympus FV3000 
Revólver Labnet Rotador Ajustable Thomas Scientific 1190P25 
Botella de alto rendimiento Sorvall de 1000 mL, PC, con tapa de aluminio Thermo Scientific010-1459
Frascos de centrífuga Nalgene con tapas, copolímero de polipropilenoThermo Scientific3141-0250
Nunc Tubos de fondo redondo; 38 mL; PCThermo Scientific3117-0380
Matraces Erlenmeyer de boca estrecha de 2 L con borde de alta resistenciaPyrex4980-2L
Amicon Ultra-4 Unidades de filtro centrífugoMillipore SigmaUFC801024
M-110P Microfluidizador Procesador de materialesMicrofluídicaM-110P
Nalgene Policarbonato de alta velocidad Tubos de centrífuga de fondo redondoThermo Scientific3117-0380PK
Botella, con Conjunto de Tapón, PolicarbonatoBeckman Coulter41121703
Cilindro, Graduado - Polipropileno 250 mLPolyLab80005
Serie 533LS-E Esterilizadores de VaporGetinge533LS-E
TrueLine, Placa de Cultivo Celular, Tratada, PS, 96 Pocillos, con TapaLabSourceD36-313-CS
Tubo de centrífuga cónico Falcon de 15 mLFisher Scientific14-959-53A
Tubo de microcentífugo: 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
Agitador orbital VWR Os-500Productos VWR Scientifc 14005-830
Sistemas de fundición a mano TetraBio-Rad1658000FC
Polipropileno, 250 mlBeckman Coulter41121703
Espectrofluorómetro NanoDropThermo Fisher Scientific3300
Aguja larga Hamilton  7693
Jeringas Exel International 5 a 6 cc Luer LockFisher Scientific14-841-46
P1000 PipetmanGilsonF123602
P200 PipetmanGilsonF123601
P100 PipetmanGilsonF123615
P20 PipetmanGilsonF123600
P10 PipetmanGilson
Intel Pesaje PM-100 Laboratorio Clásico Balanza de laboratorio de alta precisiónTecnología de ponderación inteligenteIWT_PM100
Falcon 50 mL Tubo de centrífuga cónicoFisher Scientific14-432-22
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 pocillos, 50 y micro; lBio-Rad456-1084
S25590Bde cubosF144802

Referencias

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