Preparación de desarrollar tejido olfatorio periférico para Molecular y el análisis de Immunohistochemical en Drosophila

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la etapa y diseccionar desarrollar tejido olfativo de especies de Drosophila . El tejido disecado más adelante puede ser utilizado para análisis moleculares como RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa) o RNA, secuenciación (RNAseq), así como análisis en vivo como inmunohistoquímica o en situ hibridación.

Abstract

El sistema olfativo de la Drosophila es un sistema ampliamente utilizado en Neurobiología del desarrollo, neurociencia de sistemas, así como Neurofisiología, comportamiento y evolución conductual. Tejidos olfativos de Drosophila casa las neuronas receptoras olfatorias (ORNs) que detectan señales químicas volátiles además de hidro y termo-sensorial neuronas. En este protocolo, se describe la disección de desarrollar tejido olfatorio periférico de la especie Drosophila adulta. En primer lugar describimos cómo la etapa y edad de las larvas de Drosophila , seguidas por la disección del disco antenal de primeras etapas pupas, seguidas de la disección de las antenas de adultos y etapas de pupal mediados. También mostramos los métodos donde se pueden utilizar preparados en técnicas moleculares, como la extracción de RNA para qRT-PCR, RNAseq o inmunohistoquímica. Estos métodos pueden aplicarse también a otras especies de Drosophila después de tiempos de desarrollo pupal específicos se determinan, y etapas respectivas se calculan para el envejecimiento adecuado.

Introduction

El sistema olfativo de la Drosophila es un sistema ampliamente utilizado en Neurobiología del desarrollo, neurociencia de sistemas, así como Neurofisiología, estudios de comportamiento y evolución conductual^{1,2,3, 4}. Las neuronas receptoras olfatorias (ORNs) que detectan señales químicas volátiles además de hidro y termo-sensorial neuronas^1,5,6la casa tejidos olfativos de Drosophila . El objetivo general de este manuscrito es demo....

Protocol

El siguiente protocolo es consistente con los lineamientos de ética establecidos por el Comité de ética de investigación de Universidad de Duke.

1. tejido preparación y puesta en escena del desarrollo de Drosophila melanogaster Pupa

1. En primer lugar, identificar cuántas moscas será necesarios para la disección. De RT-PCR y RNAseq, recoger 100-200 discos antenales y antenas de individuos que son necesarios en prepupal, 8 h APF, 40 h de la APF y adulto. Para immunohistochemistry, diseccionar a individual de 10-20.
2. Limpiar todos los materiales, incluyendo pastillas de disección y pinzas, el uso de toallitas con el 7....

Results

El desarrollo diseca el tejido olfatorio puede utilizarse para la extracción de RNA seguida por RT-PCR para evaluar expresión génica o puede tomarse a través de protocolos de inmunohistoquímica para determinar su patrón de expresión y la localización subcelular de los genes de interés. En esta sección, presentamos resultados representativos de cada protocolo. La figura 1 es el representante RT-PCR cuantitativa que muestra la transcripción de genes olfativos d.......

Discussion

Este protocolo es un recurso útil para los laboratorios interesados en identificar los programas genéticos y transcripcionales de funcionamiento en el desarrollo de tejido olfativo de la Drosophila , así como un análisis comparativo de estos programas a través de Drosophila especies. Es especialmente útil si se necesitan sistemas nivel transcripcionales perfiles de diferentes etapas de desarrollo como una cartilla para futuros estudios. El protocolo descrito aquí muestra cómo la etapa y aislar a desarro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Solución salina tamponada con fosfato	Gibco	70011-044	Diluido a 1X en agua libre de RNasa
CO2	gas	CD R200
Dos pinzas afiladas (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Trizol	Invitrogen	15596-026	Soluciones de aislamiento de ARN
Microscopio
Cubo pequeño con hielo
Micropipetas y puntas P20 y
Tubos de			Compre sin nucleasa para obtener mejores resultados
Tubos de PCR de 0,2 ml Polvo
de paraformaldehído	Polysciences	380
10% Triton X-100	Teknova	T1105	Diluir a 0.2% v/v en 1X PBS
2" placas
Papel de filtro de 55 mm	Whatman	1001-055	Mojar con agua y colocar en una placa de Petri para mantener húmedas las pupas
Incubadora
H2O			Compre sin nucleasa o trate con DEPC
Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona	Dow Corning		para ser utilizado para hacer almohadillas de disección a partir de cubiertas de placas Terizaki.
MicroWell Mini Bandejas con tapas	Nunc	438733	Las tapas se pueden utilizar para hacer almohadillas de disección de silicona
Anticuerpo anti-GFP de conejo	MBL international corpor PM005	anticuerpo primario
RAT CD2	AbD seroTec	MCA154RHDL	anticuerpo primario
ADL195 (anti lamina, ratón)	Dev studies hydoma ban	ADL195-s	anticuerpo primario
Alexa Fluor® 488 cabra anti-conejo IgG (H+L)	invitrogen	A11008	Anticuerpo
secundario Cy3 cabra anti-ratón IgG	ImmunoResearch	115-166-003	Anticuerpo secundario
Triton X-100, detergente de grado proteico, solución al 10%, detergente	648463		CALBIOCHEM
Rotador de laboratorio	Rotador termocientífico
Agua libre de nucleasas	Growcells.com	NUPW-0125
Limpiadores de pañuelos ligeros	VWR	82003-822	Para la limpieza de consumibles de disección
Superscript II	invitrogen	18064014	transcriptasa inversa
QIAtrituradora (50)	Extracción de ARN	QIAGEN	79654
Oligo(dT)12-18 Primer	RT	life technologies	18418012
Kit de limpieza RNeasy MinElute (50)	Extracción de ARN	QIAGEN	74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)	qPCR	Roche	04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER	qPCR	Roche	06402712001
LIGHTCYCLER 480 - PLACA MULTIPOCILLO 96	qPCR	Roche	04729692001
NEBNext Mezcla maestra de PCR 2X de alta fidelidad	qPCR	NEB	M0541S