Aquí, presentamos un protocolo para la etapa y diseccionar desarrollar tejido olfativo de especies de Drosophila . El tejido disecado más adelante puede ser utilizado para análisis moleculares como RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa) o RNA, secuenciación (RNAseq), así como análisis en vivo como inmunohistoquímica o en situ hibridación.
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Artículo de método
Preparación de desarrollar tejido olfatorio periférico para Molecular y el análisis de Immunohistochemical en Drosophila
En este artículo
Resumen
Resumen
El sistema olfativo de la Drosophila es un sistema ampliamente utilizado en Neurobiología del desarrollo, neurociencia de sistemas, así como Neurofisiología, comportamiento y evolución conductual. Tejidos olfativos de Drosophila casa las neuronas receptoras olfatorias (ORNs) que detectan señales químicas volátiles además de hidro y termo-sensorial neuronas. En este protocolo, se describe la disección de desarrollar tejido olfatorio periférico de la especie Drosophila adulta. En primer lugar describimos cómo la etapa y edad de las larvas de Drosophila , seguidas por la disección del disco antenal de primeras etapas pupas, seguidas de la disección de las antenas de adultos y etapas de pupal mediados. También mostramos los métodos donde se pueden utilizar preparados en técnicas moleculares, como la extracción de RNA para qRT-PCR, RNAseq o inmunohistoquímica. Estos métodos pueden aplicarse también a otras especies de Drosophila después de tiempos de desarrollo pupal específicos se determinan, y etapas respectivas se calculan para el envejecimiento adecuado.
Introducción
El sistema olfativo de la Drosophila es un sistema ampliamente utilizado en Neurobiología del desarrollo, neurociencia de sistemas, así como Neurofisiología, estudios de comportamiento y evolución conductual1,2,3, 4. Las neuronas receptoras olfatorias (ORNs) que detectan señales químicas volátiles además de hidro y termo-sensorial neuronas1,5,6la casa tejidos olfativos de Drosophila . El objetivo general de este manuscrito es demostrar cómo la etapa y diseccionar el desarrollo pupal y adulto tejido olfativo en especies de Drosophila . El fundamento de esta técnica es generar muestras de diferentes etapas de pupal para análisis moleculares y del desarrollo del sistema olfativo periférico, tales como RNAseq y RT-PCR cuantitativa, además en vivo tejido etiquetado técnicas . Esta técnica puede ser especialmente útil para identificar la dinámica de perfiles transcripcionales en el sistema olfatorio adulto en desarrollo de no -melanogaster Drosophila especie, que no tiene todos los reactivos transgénicos para tipo celular específico etiquetado y análisis. En este manuscrito, demostramos cómo diseccionar discos antenales y antenas de especies de Drosophila pupas y adulto. En primer lugar, mostramos cómo identificar Drosophila 0 h de formación del pupario (APF y prepupas y pupas blanco) para la puesta en escena del desarrollo y el envejecimiento propios de cada especie. A continuación, te mostramos cómo diseccionar discos antenales y el tercer segmento antenal; en concreto, cómo disociar del disco ojo y segundo segmento antenal para la pureza del tejido necesaria para RNAseq o RT-PCR. Las etapas en D. melanogaster se describe en este protocolo aproximadamente corresponden al disco antenal previamente modelado (prepupas), la selección de precursores de la antenal de disco (8 h APF), el inicio de la diferenciación terminal de ORNs (40 h APF), y antena de adultos. Finalmente, damos ejemplos de una RT-PCR cuantitativa de antenas adulto aislados utilizando el método y para en vivo inmunohistoquímica. Este método puede utilizarse para generar muestras para un análisis de ARN/ADN y de inmunohistoquímica en el desarrollo de tejidos periféricos olfativos de diferentes especies de Drosophila .
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Protocolo
El siguiente protocolo es consistente con los lineamientos de ética establecidos por el Comité de ética de investigación de Universidad de Duke.
1. tejido preparación y puesta en escena del desarrollo de Drosophila melanogaster Pupa
- En primer lugar, identificar cuántas moscas será necesarios para la disección. De RT-PCR y RNAseq, recoger 100-200 discos antenales y antenas de individuos que son necesarios en prepupal, 8 h APF, 40 h de la APF y adulto. Para immunohistochemistry, diseccionar a individual de 10-20.
- Limpiar todos los materiales, incluyendo pastillas de disección y pinzas, el uso de toallitas con el 70% EtOH. Si el material disecado es utilizado para las extracciones de RNA, limpiar todo con Neutralizadores de RNasa y hacer todas las soluciones utilizando ya sea libre de nucleasas o dietil pirocarbonato (DEPC) agua tratada.
Nota: Este protocolo usa cojines de disección del silicón en vez del vidrio para las disecciones. Almohadillas de silicona son amigables a ultra finas pinzas y promoción disecciones rápidas y de alta calidad. - Recoger la pupa a la 0 h etapa prepupal/APF.
- Para asegurar la puesta en escena más preciso, controlar las larvas en intervalos de 1 h 30min.
Nota: Es probable que se pupan errante larvas de tercer estadio en una botella medianamente concurrida dentro de unas horas. - Una vez que las larvas se convierten inmóviles y están rodeadas por un muy ligero (casi blanco) color envoltura pupal, transferirlos a un pequeño 2 - placa de Petri con un papel de filtro humedecido.
- Continuar durante 1-2 h, ocasionalmente monitoreo, identificación y transferencia de prepupas.
Nota: Alternativamente, claro una botella de pupas de todos y permitir que las larvas para 2 h. Pupas de todos recogieron después de 2 h en un rango APF 0 - 2 h.
- Para asegurar la puesta en escena más preciso, controlar las larvas en intervalos de 1 h 30min.
- Inmediatamente hacia al paso 3.1 disecar el disco prepupal antenal para la etapa APF 0 h. Si la prepupa tiene que envejecer, reunirlas en un plato, cubrir el plato y una película de parafina en los bordes para inhibir la sequedad y la placa de Petri a 25 ° C.
Nota: Las pupas pueden ahora ser de años a la eclosión. - Para pupas recolectadas en una gama de 2 h, edad prepupas por 2 h menos de la edad deseada para asegurarse de que las pupas no excedente.
- Uso de fórceps ultra fina (Dumont 55) como el tejido es muy pequeño y frágil.
2. tejido preparación y puesta en escena del desarrollo de la Pupa de otras especies de Drosophila
- Para determinar la longitud del desarrollo pupal en otras especies de Drosophila , colocar las muestras a la temperatura óptima, registrar las fechas cuando se observan prepupas, ordenarlos en un vial nuevo y anote el número de días de prepupa a la edad adulta.
- Registro de la relación de tiempo para el desarrollo pupal para especies no -melanogaster y melanogaster. La relación entre el tiempo de desarrollo por el número de horas utilizado para escenificando melanogaster para obtener el número de horas a la edad de las especies no -melanogaster se multiplican.
3. disección del disco antenal pupas de D. melanogaster
Nota: Todos los tiempos de envejecimiento y protocolos de disección se describen para melanogaster del Drosophila. Para todas las otras especies, una modificación del Protocolo de crianza basado en puntos de tiempo específicos de desarrollo será necesaria, como se describe anteriormente.
- Para disecciones de pupa disco antenal recopilar 50-100 0 - h 2 o 6-8 h pupas vieja con una espátula y colocarlas sobre una almohadilla de disección.
- Pipetear 150 μL de solución de aislamiento de RNA en una Rnasa gratis microcentrífuga de 1,5 mL con una pipeta de 200 μL del tubo y coloque el tubo en hielo.
- Diseccionar las pupas en 150-200 μL de PBS 1 x (tampón fosfato salino, libre de nucleasas). Coloque varias gotas de PBS (150-200 μL por gota) sobre la almohadilla de la disección.
- En la plataforma de la disección, coloque 0 - h 2 o 6-8 h de pupas (una pupa por gota) para ser disecado en uno de 1 x gotas de PBS. Use pinzas en una mano para estabilizar el cuerpo.
- El 0 - 2 h de pupas, usando pinzas en la otra mano, sostenga a la parte más anterior (los ganchos de la boca) de la prepupa y tire de ella para exponer el cerebro y los discos imaginales Unidos a la anterior envoltura pupal.
- Para las pupas APF de 8 h, primero suavemente Retire la envoltura pupal del casco más anterior de la pupa, exponiendo la cabeza dentro del saco de membrana que rodea el cuerpo.
Nota: El cuerpo, en esta etapa, se ve como una degeneración de la larva. - Retire el cabezal en el empalme del cuello.
Nota: Esto asegura que los discos antenales no se pierden, que en esta etapa están conectados principalmente a los lóbulos ópticos del cerebro. - Transferir el tejido con el cerebro y los discos imaginales a otra 1 x gota de PBS con pinzas o una pipeta de 20 μl.
- Identificar el disco antenal ojo conectado con el cerebro en los lóbulos ópticos. Con unas pinzas, desconecte el disco ojo antenal de cerebro y de la envoltura pupal. Transferirlo a un nuevo 1 x gota de PBS con pinzas o una pipeta de 20 μl.
Nota: El disco ojo antenal prepupal es un tejido plano. Sin embargo, por las pupas de 8 h, los discos de ojo se rotan ahuecando los discos antenales, que se encuentra anterior del cerebro central. - Con unas pinzas, cortar el tejido en el sitio de conexión entre el ojo y el disco antenal. Utilice una pipeta de 20 μl para transferir suavemente el tejido disecado en el reactivo de solución de aislamiento de RNA. Minimizar la cantidad de líquido transferido transfiriendo una cantidad tan pequeña como sea posible.
- Repita hasta que todos los pupas han sido disecados.
4. disección de D. melanogaster mediados-pupa y adulto de antenas
Nota: Por 40 h de la APF, la mayoría de la metamorfosis es completa, y las estructuras adultas se están convirtiendo en aparente, pero son blanco y anodino. En este momento del desarrollo, la antena adultos ha tomado su forma final pero sigue siendo transparente y la mayoría de los receptores olfativos, excepto unos pocos, no ha empezado la expresión.
- Para disecciones antenales pupas, recoger prepupas de 50-100 como se describe en el paso 1 y edad por 40 h a 25 ° C.
- Pipetear 150 μL de solución de aislamiento de RNA en una microcentrífuga de 1,5 mL libre de Rnasa utilizando una pipeta de 200 μL del tubo y coloque el tubo en hielo.
- En la plataforma de la disección, coloque la pupa para ser disecado en uno de 1 x gotas de PBS. Use pinzas en una mano para estabilizar el cuerpo. Con pinzas en la otra mano, suavemente Retire la envoltura pupal del casco más anterior de la pupa, exponiendo la cabeza dentro del saco de membrana que rodea el cuerpo.
- Con unas pinzas, con cuidado corte la cabeza del resto del cuerpo pupa sosteniendo el cuerpo con un sistema de pinzas y estafando a la cabeza en el cuello con otro conjunto de pinzas. Transferir suavemente la cabeza en la otra 1 x gota de PBS con unas pinzas. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para limpiar el contenido de la cabeza (el cerebro, etc.) para obtener una membrana transparente que rodea la cabeza de Drosophila en vías de desarrollo.
Nota: En el 40-50 h APF, las antenas están conectadas a la parte más anterior de la membrana. Acontecerán aparentes para la disección cuando se borra el contenido de la cabeza con el pipeteo. - Con unas pinzas, desconecte las antenas pupas de la membrana. Desconecte el segmento 2nd de la antena de 3rd con unas pinzas cortar por la articulación segmentaria, como sólo el segmento de 3rd albergará las neuronas receptoras olfatorias.
- Utilice una pipeta de 20 μl para transferir suavemente el tejido disecado en el reactivo de solución de aislamiento de RNA. Minimizar la cantidad de líquido transferido transfiriendo una cantidad tan pequeña como sea posible. Repita hasta que todos los pupas han sido disecados.
- Para adultos disecciones antenales, recoger a aproximadamente 50 adultos y edad para una eclosión después de la semana.
Nota: La expresión de genes olfativos del receptor y otros genes máximo una semana después de la eclosión. Los adultos son mayores durante una semana para genes biológicamente relevantes con las transcripciones de baja abundancia a elevarse por encima del umbral de detección. - Para las extracciones de RNA, diseccionar moscas mientras que todavía están vivos en un cojín de CO2 . Tratar la CO2 almohadilla con inhibidores de la Rnasa. Para la proyección de imagen confocal, diseccionar las moscas en un pad de disección 1 x PBS o PBS + 0,2% Tritón.
- En primer lugar, poner los adultos a dormir en el cojín de la estación CO2 en el ámbito de la disección. En la plataforma de estación de CO2 , con unas pinzas en una mano para estabilizar el cuerpo, usar pinzas en la otra mano para suavemente tire/pellizcar hacia fuera el tercer segmento antenal de la segunda.
- Transferencia de las antenas en una solución de aislamiento de RNA, con unas pinzas para colocar las antenas directamente en el líquido. Repita hasta que todos los adultos han sido disecados.
Nota: Asegúrese de que las antenas estén sumergidas en la solución de aislamiento de RNA. Las antenas pueden atascarse en el lado del tubo. Esto causará una mayor degradación del RNA, reducción de la cantidad y calidad de RNA. - Directamente procede a la extracción de RNA o coloque el tubo a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo.
5. RNA aislado de los tejidos disecados
- Retire todas las muestras desde el almacenaje de-80 ° C y descongelar el hielo.
- Girar brevemente (5-6 s, ~ 6.000 x g) cada muestra para recoger el material en la parte inferior del tubo.
- Moler cada muestra usando un mortero plástico esterilizado y un motor eléctrico de 10 s en el hielo.
- Repita los pasos del 5,2 y 5,3 4.
- Realizar la extracción de RNA utilizando kits disponibles en el mercado y siguiendo los protocolos del fabricante para un rendimiento óptimo.
- Realizar qRT-PCR utilizando reactivos comercialmente disponibles y cartillas específicas contra los genes de interés y siguiendo los protocolos del fabricante.
- Llevar a cabo todas las reacciones de polimerización en cadena usando las siguientes condiciones: desnaturalización de 95 ° C durante 10 min seguida por 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, 55 ° C por 30 s y 60 ° C para 30 s.
Nota: Pares de cartilla para inmersión y dpr los genes aparecen en la tabla 1, y cebadores para los genes de receptores olfativos figuran en CE de Hueston et al. 8.
- Llevar a cabo todas las reacciones de polimerización en cadena usando las siguientes condiciones: desnaturalización de 95 ° C durante 10 min seguida por 40 ciclos de 95 ° C por 15 s, 55 ° C por 30 s y 60 ° C para 30 s.
6. fijación de la pupas discos antenales y antenas para inmunohistoquímica
Nota: Fije los tejidos en lotes de 10-20 personas para garantizar que los tejidos se fijan para la misma cantidad de tiempo. Minimizar la cantidad de tiempo que las muestras permanecen en PBT (PBS con detergente) antes de transferir a un fijador para maximizar la integridad de los tejidos.
- Recoge la disecada discos antenales antenas pupas en un tubo PCR de 200 μL que contiene 200 μL de 0.2% PBT en el hielo para mantener la integridad del tejido y para evitar que la muestra se adhiera a la pared de 200 μL PCR tubos o que dará lugar a una fijación incompleta.
Nota: Discos antenales y antenas pupas pueden ser difíciles de ver ya que son muy translúcidos. Es recomendable usar un alcance de disección de todos los pasos de lavado para evitar cualquier pérdida de tejido. Alternativamente, placas de Terasaki de 96 pocillos pueden ser utilizado para la fijación y tinción para rastrear mejor el tejido. - Fijar el disco antenal disecada y muestras antenales de pupas en aproximadamente 200 μL de 4% PFA (paraformaldehído) durante 30 min a temperatura ambiente. Para este y posteriores pasos, mantenga los tubos con las muestras en un nutator mezclar correctamente las muestras en la solución. Progreso paso 6.7.
- Para la antena adultos, disecar la cabeza primero y fijar en aproximadamente 200 μL de 4% PFA (paraformaldehído) por 1 h a temperatura ambiente.
- Lavar 3 x con 200 μL de 0.2% PBT durante 10 minutos. Mantener las muestras en el nutator durante la incubación.
- Volver al microscopio de disección para una disección más fina del segundo segmento antenal de las cabezas fijas. Usar pinzas para estabilizar la cabeza, suavemente tire/pellizcar hacia fuera el tercer segmento antenal de la segunda.
- Transferencia de los segmentos antenales tercer disecados en aproximadamente 200 μL de 4% PFA (paraformaldehído) y fijarlos durante 30 min a temperatura ambiente.
- Lavar 3 x con 200 μL de 0.2% PBT durante 10 minutos. Mantener las muestras en el nutator durante la incubación.
- Almacenar las muestras a 4 ° C o continuar directamente con todo Monte immunohistochemistry.
Nota: La eficacia de la coloración puede cambiar cuando se utiliza el anticuerpo. Este método debe ser apropiados para menos etiquetas de proteína abundante o más anticuerpos. Sin embargo, a veces, podría requerir una optimización del Protocolo (la identidad o cantidad del fijador o el tiempo de fijación).
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Resultados
El desarrollo diseca el tejido olfatorio puede utilizarse para la extracción de RNA seguida por RT-PCR para evaluar expresión génica o puede tomarse a través de protocolos de inmunohistoquímica para determinar su patrón de expresión y la localización subcelular de los genes de interés. En esta sección, presentamos resultados representativos de cada protocolo. La figura 1 es el representante RT-PCR cuantitativa que muestra la transcripción de genes olfativos d...
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Discusión
Este protocolo es un recurso útil para los laboratorios interesados en identificar los programas genéticos y transcripcionales de funcionamiento en el desarrollo de tejido olfativo de la Drosophila , así como un análisis comparativo de estos programas a través de Drosophila especies. Es especialmente útil si se necesitan sistemas nivel transcripcionales perfiles de diferentes etapas de desarrollo como una cartilla para futuros estudios. El protocolo descrito aquí muestra cómo la etapa y aislar a desarro...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por una beca de la National Science Foundation a Pelin C. Volkan (DEB-1457690).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10X Solución salina tamponada con fosfato | Gibco | 70011-044 | Diluido a 1X en agua libre de RNasa |
| CO2 | gas | CD R200 | |
| Dos pinzas afiladas (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | Soluciones de aislamiento de ARN |
| Microscopio | |||
| Cubo pequeño con hielo | |||
| Micropipetas y puntas P20 y | |||
| Tubos de | Compre sin nucleasa para obtener mejores resultados | ||
| Tubos de PCR de 0,2 ml Polvo | |||
| de paraformaldehído | Polysciences | 380 | |
| 10% Triton X-100 | Teknova | T1105 | Diluir a 0.2% v/v en 1X PBS |
| 2" placas | |||
| Papel de filtro de 55 mm | Whatman | 1001-055 | Mojar con agua y colocar en una placa de Petri para mantener húmedas las pupas |
| Incubadora | |||
| H2O | Compre sin nucleasa o trate con DEPC | ||
| Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona | Dow Corning | para ser utilizado para hacer almohadillas de disección a partir de cubiertas de placas Terizaki. | |
| MicroWell Mini Bandejas con tapas | Nunc | 438733 | Las tapas se pueden utilizar para hacer almohadillas de disección de silicona |
| Anticuerpo anti-GFP de conejo | MBL international corpor PM005 | anticuerpo primario | |
| RAT CD2 | AbD seroTec | MCA154RHDL | anticuerpo primario |
| ADL195 (anti lamina, ratón) | Dev studies hydoma ban | ADL195-s | anticuerpo primario |
| Alexa Fluor® 488 cabra anti-conejo IgG (H+L) | invitrogen | A11008 | Anticuerpo |
| secundario Cy3 cabra anti-ratón IgG | ImmunoResearch | 115-166-003 | Anticuerpo secundario |
| Triton X-100, detergente de grado proteico, solución al 10%, detergente | 648463 | CALBIOCHEM | |
| Rotador de laboratorio | Rotador termocientífico | ||
| Agua libre de nucleasas | Growcells.com | NUPW-0125 | |
| Limpiadores de pañuelos ligeros | VWR | 82003-822 | Para la limpieza de consumibles de disección |
| Superscript II | invitrogen | 18064014 | transcriptasa inversa |
| QIAtrituradora (50) | Extracción de ARN | QIAGEN | 79654 |
| Oligo(dT)12-18 Primer | RT | life technologies | 18418012 |
| Kit de limpieza RNeasy MinElute (50) | Extracción de ARN | QIAGEN | 74204 |
| FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN) | qPCR | Roche | 04913850001 |
| FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER | qPCR | Roche | 06402712001 |
| LIGHTCYCLER 480 - PLACA MULTIPOCILLO 96 | qPCR | Roche | 04729692001 |
| NEBNext Mezcla maestra de PCR 2X de alta fidelidad | qPCR | NEB | M0541S |
Referencias
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