Artículo de método

Un ensayo desarrolló para evaluar la activación de células neuronales endógenos en un modelo murino de lesión medular mínima

DOI:

10.3791/57727

⸱

13 de septiembre de 2018

 ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Surgery, University of Toronto, 3Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto

En este artículo

Resumen

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Aquí, demostramos el funcionamiento de un modelo de lesión mínima de la médula espinal de un ratón adulto que repuestos el nicho central canal vivienda endógeno las células madre neurales (NSC). Mostramos cómo se puede utilizar el ensayo desarrolló para cuantificar la activación y migración de NSCs definitivos y primitivo después de lesión.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células madre neurales (NSC) en la médula mamífera adultos son una población mitotically relativamente quieta de periventricular células que pueden ser estudiados en vitro usando el ensayo desarrolló. Este ensayo de formación de colonias es una poderosa herramienta para estudiar la respuesta de NSCs a factores exógenos en un plato; sin embargo, esto puede también usarse para estudiar el efecto de manipulaciones en vivo con la correcta comprensión de las fortalezas y limitaciones del ensayo. Una manipulación de interés clínico es el efecto de la lesión en la activación endógena del NSC. Modelos actuales de la lesión de la médula espinal proporcionan un reto estudiar esto ya que la severidad de modelos comunes de contusión, compresión y corte transversal de la destrucción del nicho de la NSC en el sitio de la lesión donde residen las células madre. Aquí, describimos un modelo de lesión mínima que produce daños localizados en la superficie dorsolateral superficial del nivel torácico inferior (T7/8) de la médula espinal de ratón adulto. Este modelo de lesión repuestos del canal central en el nivel de la lesión y permite el análisis de la NSC que residen en el nivel de la lesión en varios puntos del tiempo después de lesión. A continuación, os mostramos cómo puede utilizarse el ensayo desarrolló para estudiar la activación de las dos poblaciones distintas, relacionadas linealmente de NSCs que residen en la región periventricular de médula espinal - NSCs primitivos y definitivos (pNSCs y dNSCs, respectivamente). Demostramos cómo aislar y cultura estos NSC de la región periventricular a nivel de la lesión y el sitio de la lesión de materia blanca. Nuestras disecciones post quirúrgica de la médula espinal muestran mayor número de sus y neuroesferas dNSC deriva de la región periventricular de cuerdas heridas comparado con controles, hablando su activación a través de lesiones. Además, tras lesión, neuroesferas derivó dNSC pueden aislarse desde el sitio de lesión, demostrando la capacidad de NSC para migrar desde su nicho periventricular a sitios de lesión.

Introducción

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El sistema nervioso central contiene una subpoblación de células multipotentes, renueva a sí misma que tiene la capacidad para dar lugar a todas las diferentes células neuronales maduros tipos1,2,3,4. Estas células madre neurales (NSC) residen en nichos especializados en el cerebro y la médula espinal y puede ser activadas después de lesión para proliferar, migrar y diferenciarse en células nerviosas maduras. NSC y su progenie ha demostrado a migrar hacia el sitio de lesión en lesión cortical modelos5,6. En el cerebro, ha demostrado NSC para migrar desde los ventrículos laterales en el sitio de la lesión donde se diferencian en astrocitos que contribuyen a la formación de cicatriz glial7. Sin embargo, en la médula espinal, se han realizado pocos estudios para preguntar si estos mismo NSCs endógenos pueden aprovecharse para promover la recuperación después de lesión de la médula espinal. De hecho, actualmente existe un debate respecto a si la activación de la piscina de la célula de vástago en la médula espinal requiere un daño físico directo del nicho periventricular Revestimiento canal central8 o si el daño al espinal médula parénquima (dejando el tallo nicho de células intacta) es suficiente para activar endógeno NSCs9.

Un número de modelos de lesión (SCI) de la médula espinal se ha utilizado para estudiar la fisiopatología de la lesión aguda y crónica. Estos modelos también se han utilizado para probar terapias potenciales para tratar SCI neuroprotección, inmunomodulación y desarrollo celular trasplante y reemplazo estrategias10,11,13. Los modelos actuales incluyen lesiones compresión o contusión, causantes de déficit funcional a gran escala, así como lesiones extensas y cavitaciones en el cable14,15. Las cicatrices gliales resultantes pueden abarcar varios segmentos espinales junto con la mayoría de la anchura, la circunferencia de la médula espinal16. Así, mientras que estos modelos son clínicamente relevantes, pueden permitirse desafíos significativos para estudiar la respuesta de NSCs endógenas después de lesión. Hay modelos químicos de lesiones que se pueden adaptar para hacer que las formas más leves de lesión que puede evitar el canal central17. Sin embargo, este tipo de lesiones se centran en la desmielinización asociada a SCI y no modelos clínicamente relevantes para el daño físico o mecánico asociado con LME traumáticas.

Para hacer frente a las limitaciones de los modelos actuales de la lesión, hemos adaptado un aguja pista SCI modelo mínimo, desarrollado originalmente en el rata9, para la aplicación de un modelo de ratón adulto. Nuestro modelo de lesión adaptado puede crear una lesión consistente de la región dorsolateral de la médula espinal de ratón y el canal central en el nivel de lesión (es) de repuesto. La ventaja de este modelo es que permite el estudio de la cinética de la NSC después de lesiones y su potencial migración radial en el sitio de la lesión. El uso de un modelo de ratón también permite el uso de ratones transgénicos que permiten seguimiento de linaje de NSCs endógenos y su progenie después de lesión. Las propiedades de NSCs adicional pueden ser evaluadas utilizando una forma modificada de la prueba en vitro desarrolló que se introduce en el presente Protocolo.

El ensayo desarrolló es un en vitro formando Colonia ensayo que permite el aislamiento de NSCs en presencia de mitógenos. En densidades de galjanoplastia clonal, NSCs individuales proliferan para dar lugar a colonias esféricas libres de células que se componen de una pequeña subpoblación de NSCs y una gran mayoría de progenitores18,19. En nuestro protocolo, demostramos el aislamiento de dos NSCs distintos, relacionados linealmente desde la región periventricular de la médula espinal, bajo las condiciones iniciales y siguiendo nuestro modelo mínimo de SCI. Definitivo neural nestin expresa células (dNSCs) y la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP) y se cultivan en presencia de factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento fibroblástico (FGF) y heparina (juntos llamada EFH)20. Estos dNSCs son raras en la médula espinal de ingenua, dando lugar a muy pocos neuroesferas en vitro. Sin embargo, nos demuestran que dNSCs se activan después de SCI mínimo, ampliar el número de neuroesferas aisladas de la región periventricular del21. Primitivo las células madre neurales (pNSCs) son de dNSCs en el linaje de células madre neurales. pNSCs son excesivamente raros, expresados bajos niveles de los marcadores de pluripotencia Oct4 y leucemia (LiF) factor inhibitorio de la respuesta22. pNSCs no forman neuroesferas cuando están aisladas de la médula espinal de ratón adulto debido a la presencia de la proteína básica de mielina (MBP) en cultivos primarios; sin embargo, neuroesferas pueden ser aislado de ratones deficientes de MBP y su número es mayor que sigue lesión, similar a dNSCs21. Finalmente, mostramos que neuroesferas derivadas de dNSC pueden ser aislado desde el sitio de la lesión en el temprano épocas después de SCI mínimo. Estos resultados demuestran que nuestro modelo de la lesión y análisis pueden determinar las características de activación de periventricular NSC como su capacidad para proliferar y migrar en respuesta a la lesión.

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Protocolo

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Este protocolo fue aprobado por el Comité de cuidado del Animal en la Universidad de Toronto y está de acuerdo con la "Guía para el cuidado y uso de animales de experimentación" (2nd edición, Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal, 2017).

1. cirugía de lesiones de médula espinal mínima

Nota: Antes de la cirugía Asegúrese de que todos los materiales y los instrumentos quirúrgicos se esterilizan mediante métodos apropiados (figura 1A).

  1. Construir un arco de apoyo torácico 4 – 5 cuadrados de Gasa y cinta adhesiva juntos en el medio para obtener un rollo fijo de Gasa.
  2. Colocar el ratón en la cámara de inducción e iniciar la anestesia con isoflurano de 5%. Confirmar la ausencia de un reflejo de pellizco del dedo del pie antes de proceder, así como durante todo el procedimiento. Como la cirugía puede tomar más de 30 minutos para completar, optimizar la exposición mínima del isoflurano (5 min al 5%) y el tiempo restante en 2 – 3%.
  3. Transferir el ratón a un cono de nariz conectado a la máquina anestésica a dosis de mantenimiento de 2 – 3% isoflurano. Utilice cortar el pelo para quitar piel del dorso del animal desde la mitad de la espalda hasta el cuello y oídos para exponer un área amplia rectangular de piel para cirugía.
  4. Transferir el ratón a un instrumento estereotáxicas colocando su nariz en el cono de nariz adjunto y estabilizar el cráneo con barras de oído. Mantener isoflurano al 5% durante la colocación de las barras de oído e inferior a 2 – 3% una vez que el ratón está asegurado en el dispositivo estereotáxicas.
  5. Administrar medicamentos analgésicos preoperatorios por vía intraperitoneal: Meloxicam (2.0 mg/kg). Aplicar lubricación ocular en los ojos de ratón abierto para evitar la desecación corneal bajo anestesia.
  6. Coloque el arco de soporte torácico por debajo del abdomen del ratón al mismo tiempo enderezando el cuerpo del ratón y la columna tirando ligeramente de la base de la cola. Use cinta de etiquetado del laboratorio para asegurar la cola y las extremidades extendidas en una posición de estrella. Una vez seguro, empuje el arco de soporte torácico rostral, desde el abdomen hacia el tórax superior de ratón, con el fin de apuntalar la espina dorsal torácica (figura 1B).
  7. Desinfección del área de piel de piel recortada preparado en el paso 1.3 con etanol al 70%, seguido de povidona-yodo para preparar un campo quirúrgico estéril. Repetir dos veces. Aplique un paño quirúrgico estéril para mantener un campo estéril amplio.
  8. Usando una hoja de bisturí #10, haga una incisión vertical paralela al eje longitudinal del animal desde el punto medio de ambos omóplatos a la curvatura de la espina dorsal torácica. Retrae la piel para exponer el tejido suave y el contorno de la columna vertebral (figura 1).
  9. Identifique el borde inferior de la almohadilla grasa supraescapular (esto delimita el nivel vertebral de T4/5). Con la misma cuchilla #10, con cuidado pero con fuerza, corte a lo largo de ambos lados del hueso vertebral T5-T8/9 para separar los tendones del músculo de la parte posterior de la columna.
  10. Introduzca los dientes de los retractores en los sitios de incisión a cada lado de la columna vertebral. Ajustar la exposición mediante la expansión de los retractores para elevar suficientemente la espina dorsal sin poner demasiada tensión en las capas de músculo retraído (figura 1).
  11. Bajo el microscopio quirúrgico, limpiar cuidadosamente el músculo residual y otros tejidos blandos que cubren la espina dorsal para exponer el hueso vertebral (Figura 1E). Identificar las vértebras que se eliminará por abrochar la Apófisis espinosa de las vértebras con pinzas dentadas y moviéndolo ligeramente hasta y hacia abajo.
    Nota: Esto debe permitir la identificación de las articulaciones intervertebrales y exponer las pequeñas aberturas (agujeros intervertebrales) por debajo de las vértebras de interés.
  12. Inserte la cabeza de una de las Tijeras romas curvas en cada lado del agujero intervertebral expuesto, caudal a la lámina vertebral a ser suprimido y cortar las articulaciones intervertebrales conectadas bilateralmente.
  13. Levante la lámina y corte el adjunto superior de la lámina para aislar y retirar el hueso.
    Nota: Esto lo expondrá el saco dural intacto que contiene la médula espinal (Figura 1F). Puede haber excesivo sangrado que puede ser controlado colocando precortadas gasa 1 x 1 cm en las zonas afectadas y lavar con PBS estéril.
  14. Con la vena de la línea media dorsal que sirve como referencia, inserte un eje doblado de 45° de una punta de aguja 30 G (con aguja bisel hacia arriba) en la superficie dorsolateral de la médula espinal (aproximadamente 1 mm de profundidad) en el lateral de 0,5 mm aproximadamente a ambos lados de la línea media.
  15. Mover la aguja ~ 2 mm de caudal a rostral (paralelo a la línea media) para que toda la longitud del bisel de la aguja se inserta en el cable. Sacar la aguja por retroceso por el camino de entrada (figura 1).
    Nota: No debe ser sangrado pero la hinchazón del tejido espinal puede verse en este paso.
  16. Para cerrar la herida, retirar el separador y la sutura de los músculos de la espalda a ambos lados de la lesión en la línea media usando una sutura absorbible de 6-0. Utilizar una sutura de seda estéril de 4-0 para cerrar posteriormente la piel sobrepuesta.
  17. Aplique un ungüento antibiótico en la parte superior de la piel suturada superficial para prevenir la infección postoperatoria con la punta de un hisopo de algodón. Administrar analgésico postoperatorio de 0.1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea junto con fluidos (1 mL de solución de Ringer entibiada).
  18. Apagar el vaporizador de isoflurano y el oxígeno. Quitar el mouse del dispositivo estereotáxicas y en una jaula limpia con ninguna cama.
  19. Coloque el ratón en la jaula de unos 30 cm de una lámpara de calor para la recuperación de anestesia y monitor de comportamiento después de despertar. El ratón debe despertarse dentro de 5 a 10 minutos y tienen la función de extremidades con posible paresia o debilidad de la cola al despertar.
  20. Monitorear el comportamiento del ratón durante los próximos días y proporcionar el cuidado postoperatorio y analgésicos (por ejemplo, puré, lactato solución líquido subcutáneo, 0,1 mg/kg buprenorfina de Ringer 2 veces al día por vía subcutánea de 2-3 días y control de peso adecuado ) de acuerdo a las regulaciones locales Animalario y sobre una base individual como recuperación puede variar.

2. desarrolló análisis disección

Nota: Siga los procedimientos adecuado cultivo estériles para tejidos a lo largo.

  1. Preparación de la solución enzimática
    1. Agregar 32 mL de Earle equilibrada solución de sal (EBSS) a la botella de cristal que contienen albúmina espermidina inhibidor y suavemente vortex hasta que se disuelva.
    2. Añadir 5 mL de EBSS a un frasco de vidrio de papaína de las porciones y colocar en un baño de agua de 37 ° C para disolver. La solución se convertirá en claro (solución 1).
    3. Tomar 500 μl de EBSS y añadir a la ADNasa las porciones de vidrio frasco para obtener una concentración de 1 mg/mL (solución 2). Mezclar muy suavemente inclinando el frasco y hacia atrás y añadir 250 μl de esta mezcla a solución 1.
      Nota: Todas las soluciones hechas (solución 1 y 2) son suficientes para el procesamiento de dos piezas del tejido. Si procesamiento de piezas de tejido, acogen con más preparación de la solución.
  2. Disección y preparación de tejido
    1. Lugar una toallita de laboratorio empapado de isoflurano en la jaula del ratón y permita que 2-3 min para vapores anestesiar completamente el ratón. Siguiente, quitar el ratón de la jaula y confirmar la ausencia de un reflejo del pellizco del dedo del pie.
    2. Realizar la dislocación cervical con un objeto contundente de metal (es decir, jaula del metal tarjeta) a la eutanasia del animal. Rocíe generosamente el eutanasia animal desde su cuello a media espalda con etanol al 70%.
    3. En la base del cráneo, use tijeras para cortar la cabeza y tire en una bolsa bio. Haga una incisión de línea media en la piel a lo largo de toda la longitud de la espalda para exponer el músculo y el hueso vertebral contorno (figura 2A).
    4. Levante el aspecto intermedio de cada escápula (es decir., omóplato, identificado por que cubría la almohadilla de grasa) y usar tijeras para cortar tejido blando (entre los omóplatos y vértebras). Se separa totalmente al exponer la columna vertebral subyacente.
    5. Siguiendo la curvatura de la columna vertebral, inserte el mismo par de tijeras en la abertura torácica superior y aislar la columna vertebral por recortar adjunto las costillas, músculos y órganos internos (figura 2B).
    6. Introducir tijeras en el caudal del agujero vertebral/apertura y cortar las articulaciones intervertebrales a cada lado de la lámina (superficie dorsal). Prestar especial atención a no dañar la médula intacta. Continúe este proceso hasta el nivel deseado o longitud del cable se expone.
    7. Con cuidado corte el spinal nerve(s) que se extiende lateralmente desde el cable antes de transferir el tejido de la médula espinal en una placa Petri con regular líquido cefalorraquídeo artificial. Mantener la muestra en hielo (figura 2).
    8. Bajo un microscopio de disección, cortar el tejido de la médula espinal para incluir ~ 2 mm rostral y caudal al sitio de lesión. Usar dos pares de pinzas para separar suavemente el cable en 2 mitades longitudinalmente a lo largo de las fisuras dorsales y ventrales (figura 2').
    9. Con microscissors, corte el lesionado dorsolateral de la materia blanca. Coloque la pieza en un tubo cónico de 15 mL.
    10. Una mitad de la médula espinal hacia abajo con pinzas, tease y quitar la materia blanca con otro par de Pinzas finas a lo largo de la extensión rostrocaudal de la médula espinal para aislar la región periventricular deseada. Repita para la otra mitad de la médula espinal.
    11. Coloque pedazos de tejido periventricular en un tubos cónicos de 15 mL separadas. Utilizar microscissors y pique suavemente el tejido contra las paredes de los tubos cónicos.
      Nota: Modificaciones de la disociación del tejido son de papaína disociación sistema protocolo23 y preparación de tejido previamente descritos procedimientos24.
    12. Añadir 2,5 mL de solución 1 nueva (paso 2.1.3) a la muestra de tejido y coloque en un eje de balancín a 37 ° C durante 30 minutos.
    13. Triturate suavemente el tejido en solución con una pipeta de 1000 μl. Centrifugue la suspensión de células nublado a 300 x g durante 5 min a TA.
    14. Preparar la solución 3 con 2,7 mL de solución de sal equilibrada de Earle, 300 μL de solución de inhibidor de la espermidina (paso 2.1.1) y 150 μL de la ADNsa I solución (paso 2.1.3).
    15. Desechar el sobrenadante del paso (paso 2.2.13) y resuspender en 1,5 mL de solución 3 del paso anterior (paso 2.2.14).
    16. La capa esta nueva suspensión celular (paso 2.2.15) sobre 5 mL de solución de inhibidor de la ovoimucoid (paso 2.1.1) en un nuevo tubo cónico de 15 mL para crear un gradiente de densidad discontinuo. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a TA.
    17. Deseche el sobrenadante y resuspender en 2 mL de medio de neurobasal. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a TA.
    18. Deseche el sobrenadante y resuspender en 1 mL de medio de neurobasal. Filtrar la suspensión utilizando un tamiz de 20 μm celular seguido por 4 mL de medio para un volumen total de 5 mL.
  3. De la galjanoplastia
    1. Preparar medios de cultivo para crecimiento desarrolló por suplir medios de neurobasal con factor de crecimiento epidérmico (20 ng/mL) factor de crecimiento del fibroblasto (20 ng/mL) / heparina (2 μg/mL) [de NSCs definitivos] o factor inhibidor de leukemina (10 ng/mL) [de NSCs primitivo]. Añadir 10 mL de cualquiera de los dos medios en un matraz de cultivo tisular de 25 mL.
    2. Utilizar un hemocitómetro y colorante azul tripán para calcular el número de células en suspensión (paso 2.2.18)25. Una vez calculado, añadir las células a frascos de cultivo de tejidos en (paso 2.3.1) a una densidad clonal de 10 células/μl y lugar matraz de cultivo de tejidos con células agregadas en la incubadora durante 24 h (37 ° C, 95% de humedad, 5% CO2).
      Nota: Un ejemplo de la técnica de conteo es la siguiente: tomar 10 μl de la suspensión de células y mezclar con 10 μl de colorante azul de Trypan. Añadir 10 μl de esta mezcla en un hemocitómetro. En un 10 X microscopio de luz, contar el número de células vivas y suma todas las celdas de contado en 4 de los cuadrantes de 4 x 4. Utilice la fórmula: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1.000] para dar el volumen de la suspensión celular a ser plateado en cada frasco de cultivo tisular de 25 mL para densidad clonal (10 células/μl).
    3. Después de 24 h, agitar el frasco y vierta el contenido en un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a TA.
    4. Deseche el sobrenadante y resuspender las células en 1 – 2 mL de medio de neurobasal fresco.
    5. Repita el paso 2.3.2 para contar el número de células en suspensión y la placa de células en densidad clonal en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos conteniendo 500 μl de sus medios respectivos mitógeno suplido (EFH para el definitivo crecimiento de NSC) y LIF para el crecimiento primitivo de NSC.
      Nota: Utilice la fórmula adaptada (5.000 / [X células/4) x 2 x 10 x 1.000) para calcular el volumen de la suspensión de células a ser plateado en cada bien conteniendo 500 μl de medio.
    6. Coloque las placas que contienen las células en la incubadora (37 ° C, 95% de humedad, 5% CO2) para crecer por 7 días.
  4. Contando
    1. Después de 7 días en cultivo, quitar las placas y ver bajo un microscopio de luz. Cuantificar neuroesferas por recuento de colonias esféricas que son > 80 μm de diámetro para las culturas dNSCs y > 50 μm de diámetro para las culturas pNSCs.
      Nota: Si lo desea, pueden ser aún más los26 neuroesferas o diferenciados. Si las células ya no son necesarios, eliminar añadiendo acelerado peróxido de hidrógeno a los pozos (aprox. 1 mL) durante 20 min para que el color del medio se vuelve amarillo. Luego deseche.

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Resultados

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Después de la cirugía, los ratones deben experimentar un mínimo déficit motor que puede incluir la cola y posible paresia de extremidades para un máximo de 24 h. Después de este tiempo, los ratones no deben experimentar extremidades parálisis o paresia y cambios mínimos en la marcha.

La figura 3 muestra resultados representativos del ensayo desarrolló 5 días tras la lesión de la médula espinal mínim...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Durante el procedimiento quirúrgico, existen algunos pasos críticos donde el investigador debe prestar especial atención a fin de obtener resultados óptimos y minimizar la variabilidad entre los animales. Debe tener cuidado con la anestesia inhalada (isoflurano) durante la cirugía, la anestesia se ha demostrado para tener efectos neuroprotectores con exposición prolongada27. Por consiguiente, al estudiar la capacidad regenerativa de la médula espinal después de lesión, hacer un esfuerzo para reali...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo es financiado por la Fundación de Krembil (subvención de funcionamiento CMM). WX fue el ganador del Premio student Carlton Marguerite Smith. NL recibió una beca de postgrado de Ontario.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Retractor AgrícolaHerramientas de Ciencia Fina17005-04
Tijeras de resorte Moria Vannas-Wolff (curvas)Herramientas de ciencia fina15370-50Personalice al realizar el pedido para obtener puntas desafiladas
Pinzas de Graefe (rectas, 1 x 2 dientes)Herramientas de ciencia fina11053-10
Pinzas de Graefe extrafinas (curvas, dentadas)Herramientas de ciencia fina11152-10O cualquier otra pinza para suturar
Hemostáticos Hartman (rectos)Fine Science Tools13002-10O cualquier otro apropiado para suturar
Bisturí Mango #3Fine Science Tools10003-12O cualquier otro
cortapelosamazon.ca https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BAo cualquier otro
estereotáxico apropiado instrumentoStoeling51500o cualquier otro
Buprenorfinao cualquier apropiado sancionado por mi centro de cuidado de animales
Meloxicamo cualquier apropiado sancionado por el centro de cuidado de animales
Tears Naturale P.M.Alconhttps://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXEo cualquier otro
IsofluranoBaxter International IncDIN 02225875o cualquier otro apropiado para la anestesia
Q-tips Cottom Swabs amazon.ca
Gasa de AlgodónFisher Scientific13-761-52
Agujas de 30 GBecton Dickinson305106Para Lesiones
Agujas de 25 GBecton Dickinson305122Para Inyecciones de Drogas
Jeringas de 1 mLBecton Dickinson3090659para inyecciones de drogas
Jeringas de 3 mLBecton Dickinson309657para inyecciones de líquidos
4-0 Sutureuoftmedstore.com2297-VS881para sutura cutánea
6-0 Sutureuoftmedstore.comVS889para sutura muscular
Pomada Polysporin amazon.ca102051
Vaporizador de isofluranoVetEquip901806
tubos cónicos de 15 mLThermoFisherCualquier
placa de PetriThermoFishercualquier
Trypan Blueapropiado ThermoFisherCualquier
hemotómetroThermoFisherCualquier
centrífugaapropiadaThermoFisherCualquier
herramienta de disección estándarHerramientas
Microscopio de disecciónZeissStemi 2000
Microscopio de conteoOlympusCKX41
Neural Basal-A MedioInvitrogen10888-022
B27Invitrogen17404-044
Penicilina- EstreptomicinaGibco15070
L- GlutaminaGibco25030
DMEMInvitrogen12100046
F12Invitrogen12700075
30% GlucosaSigmaG61521 M, 9,01 g en 100 mL dH2O
1 M Glucosa
7,5% NaHCO3SigmaS5761155 mM, 1,30 g en 100 mL dH2O
155 mM NaHCO3
1 M HEPESSigmaH337523,83 g en 100 mL dH2
O Apo-TransferrinR& D Sistemas3188-AT
Putrescine SigmaP7505
InsulinaSigmaI5500
SelenioSigmaS9133
ProgesteronaSigmaP6149
Sistema de Disociación de Papaína Worthington Biochemical CorporationPDS1 vial de papaína se puede utilizar para 2 muestras
Epidermal Growth FactorInvitrogenPMG8041Powder reconstituido con 1mL Hormone Mix y alícuota en viales de 20uL para ser almacenado en el congelador
Fibroblast Growth FactorInvitrogenPHG0226Powder reconstituido con 0.5 mL Hormone Mix y alícuota en 20 μ L viales para almacenar en el congelador
HeparinaSigmaH3149
Factor inhibidor de la leucemiaen casa
Trypan Blue
Hemocitómetro
24 pocillos PlacasNUNC
2 M NaClSigmaS588611,69 g en 100 mL dH2O
1 M KCLSigmaP54057,46 g en 100 mL dH2O
1 M MgCl2SigmaM239320,33 g en 100 mL dH2O
108 mM CaCl2Sigma C79021,59 g en 100 mL dH2O
apropiado apropiado https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS apropiada apropiada de ciencia fina de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
  2. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
  3. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287 (5457), 1433-1438 (2000).
  4. Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
  5. Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
  6. Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
  7. Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
  8. Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports - UK. 7, (2017).
  9. Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
  10. Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
  11. Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
  12. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
  13. Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
  14. Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
  15. Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
  16. Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
  17. Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
  18. Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
  19. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
  20. Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
  21. Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
  22. Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
  23. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html (2018).
  24. Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
  25. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  26. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
  27. Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
  28. Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
  29. Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).

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