Aquí, demostramos el funcionamiento de un modelo de lesión mínima de la médula espinal de un ratón adulto que repuestos el nicho central canal vivienda endógeno las células madre neurales (NSC). Mostramos cómo se puede utilizar el ensayo desarrolló para cuantificar la activación y migración de NSCs definitivos y primitivo después de lesión.
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Artículo de método
Un ensayo desarrolló para evaluar la activación de células neuronales endógenos en un modelo murino de lesión medular mínima
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células madre neurales (NSC) en la médula mamífera adultos son una población mitotically relativamente quieta de periventricular células que pueden ser estudiados en vitro usando el ensayo desarrolló. Este ensayo de formación de colonias es una poderosa herramienta para estudiar la respuesta de NSCs a factores exógenos en un plato; sin embargo, esto puede también usarse para estudiar el efecto de manipulaciones en vivo con la correcta comprensión de las fortalezas y limitaciones del ensayo. Una manipulación de interés clínico es el efecto de la lesión en la activación endógena del NSC. Modelos actuales de la lesión de la médula espinal proporcionan un reto estudiar esto ya que la severidad de modelos comunes de contusión, compresión y corte transversal de la destrucción del nicho de la NSC en el sitio de la lesión donde residen las células madre. Aquí, describimos un modelo de lesión mínima que produce daños localizados en la superficie dorsolateral superficial del nivel torácico inferior (T7/8) de la médula espinal de ratón adulto. Este modelo de lesión repuestos del canal central en el nivel de la lesión y permite el análisis de la NSC que residen en el nivel de la lesión en varios puntos del tiempo después de lesión. A continuación, os mostramos cómo puede utilizarse el ensayo desarrolló para estudiar la activación de las dos poblaciones distintas, relacionadas linealmente de NSCs que residen en la región periventricular de médula espinal - NSCs primitivos y definitivos (pNSCs y dNSCs, respectivamente). Demostramos cómo aislar y cultura estos NSC de la región periventricular a nivel de la lesión y el sitio de la lesión de materia blanca. Nuestras disecciones post quirúrgica de la médula espinal muestran mayor número de sus y neuroesferas dNSC deriva de la región periventricular de cuerdas heridas comparado con controles, hablando su activación a través de lesiones. Además, tras lesión, neuroesferas derivó dNSC pueden aislarse desde el sitio de lesión, demostrando la capacidad de NSC para migrar desde su nicho periventricular a sitios de lesión.
Introducción
El sistema nervioso central contiene una subpoblación de células multipotentes, renueva a sí misma que tiene la capacidad para dar lugar a todas las diferentes células neuronales maduros tipos1,2,3,4. Estas células madre neurales (NSC) residen en nichos especializados en el cerebro y la médula espinal y puede ser activadas después de lesión para proliferar, migrar y diferenciarse en células nerviosas maduras. NSC y su progenie ha demostrado a migrar hacia el sitio de lesión en lesión cortical modelos5,
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Protocolo
Este protocolo fue aprobado por el Comité de cuidado del Animal en la Universidad de Toronto y está de acuerdo con la "Guía para el cuidado y uso de animales de experimentación" (2nd edición, Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal, 2017).
1. cirugía de lesiones de médula espinal mínima
Nota: Antes de la cirugía Asegúrese de que todos los materiales y los instrumentos quirúrgicos se esterilizan mediante métodos apropiados (figura 1A).
- Construir un arco de apoyo torácico 4 – 5 cuadrados de Gasa y cinta adhesiva juntos en el medio para obtener un rollo fijo de G....
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Resultados
Después de la cirugía, los ratones deben experimentar un mínimo déficit motor que puede incluir la cola y posible paresia de extremidades para un máximo de 24 h. Después de este tiempo, los ratones no deben experimentar extremidades parálisis o paresia y cambios mínimos en la marcha.
La figura 3 muestra resultados representativos del ensayo desarrolló 5 días tras la lesión de la médula espinal mínim.......
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Discusión
Durante el procedimiento quirúrgico, existen algunos pasos críticos donde el investigador debe prestar especial atención a fin de obtener resultados óptimos y minimizar la variabilidad entre los animales. Debe tener cuidado con la anestesia inhalada (isoflurano) durante la cirugía, la anestesia se ha demostrado para tener efectos neuroprotectores con exposición prolongada27. Por consiguiente, al estudiar la capacidad regenerativa de la médula espinal después de lesión, hacer un esfuerzo para reali.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo es financiado por la Fundación de Krembil (subvención de funcionamiento CMM). WX fue el ganador del Premio student Carlton Marguerite Smith. NL recibió una beca de postgrado de Ontario.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Retractor Agrícola | Herramientas de Ciencia Fina | 17005-04 | |
| Tijeras de resorte Moria Vannas-Wolff (curvas) | Herramientas de ciencia fina | 15370-50 | Personalice al realizar el pedido para obtener puntas desafiladas |
| Pinzas de Graefe (rectas, 1 x 2 dientes) | Herramientas de ciencia fina | 11053-10 | |
| Pinzas de Graefe extrafinas (curvas, dentadas) | Herramientas de ciencia fina | 11152-10 | O cualquier otra pinza para suturar |
| Hemostáticos Hartman (rectos) | Fine Science Tools | 13002-10 | O cualquier otro apropiado para suturar |
| Bisturí Mango #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | O cualquier otro |
| cortapelos | amazon.ca https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | o cualquier otro | |
| estereotáxico apropiado instrumento | Stoeling | 51500 | o cualquier otro |
| Buprenorfina | o cualquier apropiado sancionado por mi centro de cuidado de animales | ||
| Meloxicam | o cualquier apropiado sancionado por el centro de cuidado de animales | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | o cualquier otro |
| Isoflurano | Baxter International Inc | DIN 02225875 | o cualquier otro apropiado para la anestesia |
| Q-tips Cottom Swabs amazon.ca | |||
| Gasa de Algodón | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Agujas de 30 G | Becton Dickinson | 305106 | Para Lesiones |
| Agujas de 25 G | Becton Dickinson | 305122 | Para Inyecciones de Drogas |
| Jeringas de 1 mL | Becton Dickinson | 3090659 | para inyecciones de drogas |
| Jeringas de 3 mL | Becton Dickinson | 309657 | para inyecciones de líquidos |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | para sutura cutánea |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | para sutura muscular |
| Pomada Polysporin amazon.ca | 102051 | ||
| Vaporizador de isoflurano | VetEquip | 901806 | |
| tubos cónicos de 15 mL | ThermoFisher | Cualquier | |
| placa de Petri | ThermoFisher | cualquier | |
| Trypan Blue | apropiado ThermoFisher | Cualquier | |
| hemotómetro | ThermoFisher | Cualquier | |
| centrífuga | apropiadaThermoFisher | Cualquier | |
| herramienta de disección estándar | Herramientas | ||
| Microscopio de disección | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscopio de conteo | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medio | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicilina- Estreptomicina | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamina | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucosa | Sigma | G6152 | 1 M, 9,01 g en 100 mL dH2O |
| 1 M Glucosa | |||
| 7,5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155 mM, 1,30 g en 100 mL dH2O |
| 155 mM NaHCO3 | |||
| 1 M HEPES | Sigma | H3375 | 23,83 g en 100 mL dH2 |
| O Apo-Transferrin | R& D Sistemas | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulina | Sigma | I5500 | |
| Selenio | Sigma | S9133 | |
| Progesterona | Sigma | P6149 | |
| Sistema de Disociación de Papaína | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial de papaína se puede utilizar para 2 muestras |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituido con 1mL Hormone Mix y alícuota en viales de 20uL para ser almacenado en el congelador |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituido con 0.5 mL Hormone Mix y alícuota en 20 μ L viales para almacenar en el congelador |
| Heparina | Sigma | H3149 | |
| Factor inhibidor de la leucemia | en casa | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocitómetro | |||
| 24 pocillos Placas | NUNC | ||
| 2 M NaCl | Sigma | S5886 | 11,69 g en 100 mL dH2O |
| 1 M KCL | Sigma | P5405 | 7,46 g en 100 mL dH2O |
| 1 M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20,33 g en 100 mL dH2O |
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1,59 g en 100 mL dH2O |
Referencias
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H.
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Reimpresiones y permisos
