Artículo de método

Vigilancia de todo el genoma de errores de transcripción en organismos eucariotas

DOI:

10.3791/57731

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13 de septiembre de 2018

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1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo ofrece a los investigadores una nueva herramienta para controlar la fidelidad de la transcripción en organismos modelo múltiples.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transcripción exacta es necesaria para la expresión fiel de la información genética. Sorprendentemente sin embargo, poco se sabe sobre los mecanismos que controlan la fidelidad de la transcripción. Para llenar este vacío en los conocimientos científicos, hemos optimizado recientemente el análisis de secuenciación del círculo para detectar errores de transcripción en el transcriptoma de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastery Caenorhabditis de elegans de. Este protocolo proporcionará a los investigadores una poderosa nueva herramienta para el paisaje de errores de transcripción en las células eucariotas por lo que los mecanismos que controlan la fidelidad de la transcripción pueden ser aclados en detalle sin precedentes.

Introducción

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El genoma proporciona un preciso plan biológico de la vida. Para implementar correctamente este anteproyecto, es importante que el genoma se transcribe con gran precisión. Sin embargo, la transcripción es poco probable que sea libre de errores. Por ejemplo, ARN Polimerasas durante mucho tiempo se han sabido para ser propenso en vitro1,2, y fue demostrado recientemente que cometen errores en vivo 3,5,6, así particularmente cuando se enfrenta con ADN daños7,8,9,10. Tomados en conjunto, estas observaciones indican que errores de transcripción se producen continuamente en todas las células vivas, sugiriendo que podría ser una fuente potente de proteínas mutadas.

Este proceso, llamado mutagénesis transcripcional, difiere de la mutagénesis clásica de dos maneras. En primer lugar, en contraste con las mutaciones genéticas, errores de transcripción afectan las células mitotic y poste-mitotic, como no dependen de la replicación del ADN. Estudio de los mecanismos que afectan a la fidelidad de la transcripción, por lo tanto, proporcionará información valiosa sobre la carga de mutación de las células mitotic y poste-mitotic. Curiosamente, errores de transcripción recientemente han sido implicados en la promoción de la agregación de proteína11,12,13 y presumidos para contribuir a ambas de la carcinogénesis10 y el desarrollo de resistencia antibiótica en bacterias14.

En segundo lugar, en contraste con las mutaciones genéticas, errores de transcripción son transitorias en la naturaleza. Su existencia temporal es particularmente desafiante ya que hace sumamente difícil detectar errores de transcripción. Por ejemplo, mientras que varios laboratorios han ideado ensayos reportero valiosa para el estudio de mutagénesis transcripcional, estos ensayos sólo son capaces de medir los errores de transcripción en un número limitado de contextos y modelo organismos4,15. Para superar estas limitaciones, muchos investigadores han recurrido a la tecnología de la secuenciación del RNA (RNA-seq), que teóricamente permite errores de transcripción que se registrará en el transcriptoma de cualquier especie. Sin embargo, estos estudios son fácilmente confundidos por artefactos de construcción de biblioteca, tales como errores de transcripción inversa, PCR amplificación errores y lo errores de la secuencia sí mismo. Por ejemplo, reverso transcriptasas cometer un error de aproximadamente cada bases ~ 20.000, mientras que ARN Polimerasas (RNAPs) se esperan que sólo un error cada 300.000 bases5,6. Porque la tasa de error de transcripción reversa solo empequeñece la tasa de error de Polimerasas del RNA dentro de las células, es prácticamente imposible distinguir entre errores de transcripción verdadero artefactos causados por la preparación de la biblioteca en datos tradicionales de RNA-Seq ( Figura 1a).

Para resolver este problema, hemos desarrollado una versión optimizada de la secuenciación del círculo (Cirseq, o C-seq en adelante) ensayo5,16. Este ensayo permite detectar errores de transcripción y otras variantes raras en RNA en el transcriptoma5. El análisis de secuencia circular lleva este nombre porque un paso clave en este ensayo gira en torno a circularización de RNA. Una vez que los objetivos de RNA son circular, son revés transcrito de manera círculo rodante, para producir moléculas de cDNA lineal que contienen numerosas copias de la misma plantilla del RNA. Si un error estuvo presente en una de estas plantillas, este error también estaría presente en cada repetición única dentro de la molécula de cDNA. En cambio, errores introducidos por transcripción reversa y amplificación por PCR secuenciación tienden a surgir al azar y así estará presentes en sólo una o dos repeticiones. Por lo tanto, generando una secuencia de consenso para cada molécula de ADNc y distinguir errores aleatorios de los errores que se producen en todas las repeticiones, artefactos de construcción de biblioteca con eficacia pueden ser separados de los errores de transcripción verdadera (Figura 1b).

Si se utiliza correctamente, puede utilizarse el ensayo C-seq para detectar con precisión la tasa de base sustituciones, inserciones y eliminaciones en el ARN en el transcriptoma de cualquier especie (por ejemplo, véase travesía y Ochman17). Por ejemplo, hemos utilizado el ensayo C-seq para proporcionar mediciones de todo el genoma de la tasa de error de transcripción en Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastery Caenorhabditis elegans con una única resolución base5 (inéditas observaciones). Originalmente utilizado para exactamente la secuencia de las poblaciones de virus de ARN, esta versión optimizada del ensayo C-seq ha racionalizado para reducir al mínimo las agresiones durante la preparación de la biblioteca que contribuyen a los artefactos de construcción de biblioteca. Además, mediante el uso de un número de kits disponibles en el mercado, el rendimiento de la prueba se mejora, así como su facilidad de uso. Si se usa correctamente, este análisis pueden detectar con precisión miles de errores de transcripción por repetición, de tal modo grandemente mejorando en anteriores estudios6. En general, este método proporciona una poderosa herramienta para el estudio de mutagénesis transcripcional y permitirá al usuario obtener nuevos conocimientos sobre los mecanismos que controlan la fidelidad de la transcripción en una amplia gama de organismos.

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Protocolo

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1. preparación

  1. RNasas son omnipresentes; por lo tanto, limpie el área de trabajo bien por aspersión abajo con un reactivo de descontaminación (por ejemplo, ARNasa lejos) y etanol al 70%. Aerosol hacia abajo cualquier pipetas, plumas o gradillas para eliminar posibles fuentes de contaminación de Rnasa.
  2. Para evitar más RNasas contaminen las muestras, usar una bata o camiseta de manga larga durante la experimentación. Evite el contacto entre los guantes y el interior de cualquier tubo que se utilizará, sobre todo cuando de recuperar de una caja o bolsa.
  3. Antes de la transcripción inversa, cambiar guantes con frecuencia.
    Nota: Para obtener resultados óptimos, no hacer una pausa en el experimento antes de la transcripción inversa.

2. célula y cultura Animal y colección

  1. Colección y el crecimiento de saccharomyces cerevisiae
    1. Si se desea una biblioteca C-seq de la levadura, primero inocular una sola Colonia de S. cerevisiae en 3 mL de medio Extracto de levadura que contiene, adenina, peptona y dextrosa (YAPD) e incubar durante una noche a 30 ° C en un tambor rodante.
    2. En la mañana, volver a sembrar la cultura en 50 mL de medio YAPD a una densidad óptica (OD) de 0.1 y crecen las células hasta llegar a un OD de 0,5 – 0,7 (~ 7 x 106 células/mL).
    3. Recoger la cultura entera 50 mL (aproximadamente 350 x 106 células) en un tubo cónico de 50 mL y centrifugar las células abajo por 3 min a x 2.100 g. Cuidadosamente retire el medio YAPD y lavar el precipitado una vez con PBS 1 x.
    4. Entonces, Resuspender el precipitado en 480 μl de tampón de lisis, 48 μl de SDS 10% y 480 μl de fenol: cloroformo: isoamílico alcohol (25:24:1), pH 6,8. Vórtice de la muestra a velocidad máxima durante 5 s y la transferencia a un tapón de rosca de 1.5 mL tubo con 750 μl de granos del zirconia helada (suministrado con el kit). Proceda al paso 3 de este protocolo para la lisis celular y extracción de RNA total.
      Nota: Todos los reactivos necesarios para paso 2.1.4 se proporcionan en el kit de extracción de RNA la levadura recomendada. Estos reactivos funcionan igual para levaduras, gusanos y moscas para que después de la colección de la levadura (paso 2.1), gusanos (paso 2.2) o moscas (paso 2.3), un enfoque unificado permite generar bibliotecas de C-seq (pasos 3 – 10).
  2. Cultura de Caenorhabditis elegans y colección
    1. Si se desea una biblioteca C-seq de gusanos, depositar 30 lombrices adultas sobre una placa fresca de agar manchado con OP50 bacterias.
      Nota: Las placas de cinco son suficientes para 1 repetición.
    2. Cultura los gusanos durante 4 días y recoger los gusanos lavando suavemente las placas con 5 mL de medio M9 y los gusanos en un tubo cónico de 50 mL solo de la piscina.
    3. Girar los gusanos abajo a 100 x g durante 2 min crear una pelotilla. Desacelerar la centrifugadora a la menor velocidad posible, para no perturbar el sedimento.
    4. Suavemente mueva los gusanos en un tubo de 1,5 mL, lavar dos veces en 1,5 mL de medio M9 y centrifugar el tubo a 100 x g durante 1 min eliminar las bacterias y generar una limpieza 100 pellets μl de gusanos.
    5. Resuspender los gusanos en 480 μl de tampón de lisis, 48 μl de SDS 10% y 480 μl de fenol: cloroformo: isoamílico alcohol. Vórtice de la muestra a la máxima velocidad para 5 s y la transferencia a un tapón de rosca de 1.5 mL tubo conteniendo 750 μl de granos zirconia helada. Proceda al paso 3 de este protocolo para la lisis de los gusanos y la extracción de RNA total.
  3. Recolección y cultivo de drosophila melanogaster
    1. Si se desea una biblioteca C-seq de moscas, moscas de 20 – 25 en viales que contienen dextrosa o un medio basado en melaza de la cultura. Alícuota las moscas sobre los 3 frascos, para que cada frasco contiene aproximadamente 8 moscas.
    2. Para recoger las moscas, coloque el frasco en un cubo de hielo hasta que las moscas son sedadas. Entonces, les recogen con un cepillo en un tubo de 1,5 mL. No recoja las moscas por el tratamiento de CO2 .
    3. Deje que las moscas calientes a la temperatura ambiente (RT) y añadir rápidamente una mezcla premade de 500 μl de tampón de lisis 50 μl de SDS 10% y 500 μl de fenol: cloroformo: isoamílico alcohol al tubo. Utilice un micropestle para moler encima de las moscas con aproximadamente 15 golpes, acompañados por una firma de torsión movimiento cuando la mano alcanza la parte inferior del tubo.
    4. Vierta la mezcla de las moscas y medios de lisis en un tapón de rosca de 1.5 mL del tubo que contiene 750 μl de granos de zirconia helada y de vortex a máxima velocidad por 5 s. proceder al paso 3 de este protocolo para la lisis de las moscas y la extracción de RNA total.

3 purificación del ARN total

Nota: en este punto, todos los tres protocolos convergen, y un enfoque único y unificado permite generar bibliotecas de C-seq.

  1. Enrosque firmemente el tapón y conectar el tubo en un Vortex con un adaptador o cinta adhesiva. Vórtice el tubo a máxima velocidad por 10 min a lyse las muestras. Luego, centrifugar la muestra a 16.100 x g durante 5 min separar los solventes orgánicos de la fase acuosa.
  2. Cuidadosamente retire 400 – 500 μl de la fase acuosa sin alterar la interfase blanca, turbia y añadir a un tubo cónico de 15 mL 1,9 ml de tampón de Unión. Mezclar bien todo con un vórtex.
  3. Añadir 1,25 mL de etanol al 100% y mezclar la muestra con un vórtex. Transferencia de 700 μl de la muestra a un cartucho de filtro montado en un tubo de colección y girar la muestra a 14.500 x g por 30 s. repetición hasta que todos los de la muestra se pasa a través del cartucho.
    Nota: en este punto, la muestra puede resultar ligeramente opaca. Si muchas células, gusanos o moscas fueron sometidas a lisis, precipitados pueden aparecer que pueden obstruir el filtro.
  4. Lave el filtro una vez con 700 μl de solución de lavado 1 y dos veces con 500 μl de solución de lavado 2 o 3. Girar las muestras a 14.500 x g durante 2 min eliminar cualquier exceso etanol para finalizar los lavados.
  5. Transferir el cartucho del filtro a un tubo de 1,5 mL delfín y añadir μl de solución de elución precalentado (65 ° C) de 108.
    Nota: No exponga nunca las muestras de RNA a temperaturas superiores a 65 ° C antes de una transcripción inversa, ya que hacerlo provocará citosina a eventos uracilo desaminación son imposibles de distinguir de los errores de transcripción.
  6. Degradar la contaminación del ADN en el ARN aislado (vea los pasos 2.1-3.4) mediante la adición de 11 μl de 10 x DNasa buffer, 2 μl de inhibidor de la Rnasa y 4 μL de DNasa I (8 U) e incubar a 37 ° C durante 30 minutos.
  7. Después de la digestión, Añadir 11 μl de reactivo de inactivación de DNasa. Vórtice la mezcla y déjela reposar a temperatura ambiente 5 minutos. Luego, centrifugar la muestra a 15.000 x g durante 3 min para el reactivo de inactivación de la pelotilla y cobrar 110 μl del sobrenadante sin perturbar el pellet. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 1,5 mL.
    Nota: El reactivo de inactivación de DNasa puede ser difícil de pipetear correctamente, así que visualmente la punta de la pipeta después de cada pipeteo acción. Si el reactivo de inactivación se vuelve demasiado viscoso para pipeta, añadir 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) igual a 1/5 del volumen restante.
  8. (Control de calidad) Medir la concentración del ARN total usando un espectrofotómetro. Luego reposar 1 μl de RNA total y diluir a una concentración de 10 ng/μl de agua libre de nucleasa de (NF). Ejecutar el RNA en un instrumento de análisis de nucleótido apropiado con un cinta de ARN de alta sensibilidad para asegurar que el RNA no se degrada y tiene un valor de eRIN de al menos 8.5 o más alto (figura 2B).

4. el mRNA enriquecimiento

  1. Realizar el enriquecimiento de mRNA con un miniprep de mRNA kit (véase Tabla de materiales). Añadir 140 μl de agua NF a la muestra para un volumen total de 250 μl. Luego, Añadir 250 μl de 2 x de tampón de Unión, homogeneizar la muestra con un vórtex y agregar 15 μl de oligo (dT) granos.
  2. Mezcle la muestra mediante pipeteo arriba y abajo e incubar a 65 ° C por 2 min. Luego, coloque la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos. Por último, centrifugar la muestra a 16.100 x g durante 2 minutos para que sedimenten los complejos de grano: mRNA.
  3. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 500 μl de solución de lavado. Transferir la solución a una columna de vuelta y vuelta durante 1 min a x 15.000 g. Deseche el flujo a través y lavar la muestra con un adicional de 500 μl de solución de lavado. Luego, girar la muestra por 2 min a 15.000 x g para eliminar cualquier exceso etanol de los filtros de vuelta.
  4. Transferir el filtro spin a un tubo de delfín y resuspender el precipitado en la columna con 80 μl de solución de elución precalentado (65 ° C). Incubar la muestra durante 1,5 minutos a 65 ° C y eluir girando durante 1 min a 15.000 x g.
  5. Medir la concentración de RNA purificado con un espectrofotómetro o herramienta similar que permite la cuantificación de la concentración de RNA y de calidad.

5. ARN y ARNasa III fragmentación de limpieza

Nota: (Importante) para preparar las moléculas de ARN circular adecuadas para la generación de bibliotecas de C-seq, el ARN debe fragmentarse a aproximadamente 60 – 80 bases de longitud. Mientras que los métodos anteriores han utilizado una fragmentación química al fragmento de RNA, fragmentación químico con metales pesados presenta daños a las muestras de RNA que pueden ser malinterpretadas como errores de transcripción en el análisis final. Para evitar este problema, dependen en su lugar una fragmentación usando ARNasa III para generar pequeños fragmentos. Una ventaja adicional de este enfoque enzimática es que crea extremos compatibles requeridos para la ligadura, obviando la necesidad de una reparación final después de la fragmentación química.

  1. Configurar la reacción de la fragmentación del RNA con 1 μg de ARN purificado, 10 μl de tampón de reacción, 5 μl de ARNasa III y suficiente NF agua para llevar el volumen hasta 100 μl (véase Tabla de materiales). Agregue la enzima último y pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo por lo menos 10 veces para mezclar. Incubar la muestra a 37 ° C durante 25 minutos, que tiende a producir fragmentos de ARN de aproximadamente 60-80 bases en longitud.
  2. Una vez finalizada la incubación de 25 minutos, limpiar la reacción inmediatamente con un oligo limpieza y concentrador kit (véase Tabla de materiales) para evitar cualquier digestión adicional. Añadir 200 μL de tampón de oligo-enlace a la muestra, mezclar completamente por Vortex y añadir 800 μl de etanol al 100%. Mezclar la muestra con un vórtex y transferir a una columna de giro proporcionado en un tubo de recogida.
  3. Centrifugar la muestra a 10.000 x g durante 30 s y lavado con 750 μl de tampón de lavado para quitar ARNasa III. Centrifugar la muestra a 10.000 x g durante 30 s, deseche el flujo a través y lavar la muestra una vez más con 750 μl de tampón de lavado como se describió anteriormente. Después de la segunda a través de flujo ha sido descartado, centrifugar la columna a 15.000 x g durante 2 min eliminar cualquier exceso etanol.
  4. Transferencia a un nuevo tubo 1,5 mL de la columna y eluir la muestra en 24 μl de agua NF girando a 10.000 x g durante 1 minuto.
  5. Control de calidad: Tomar 2 μl de los fragmentos de RNA purificados y diluir 2 añadiendo 2 μl de agua NF. Ejecutar el ARN fragmentado en una cinta de pantalla para que el ARN fragmentado esté en el rango de 50 – 100 bases de longitud (figura 2 c).

6. ARN circularización y círculo del balanceo transcripción reversa

  1. Para circularize los fragmentos de ARN, calor-desnaturalizar 20 μl de la muestra a 65 ° C por 1 min y coloque en hielo inmediatamente durante 2 minutos. A continuación, añadir 4 μL de 10 x buffer ligasa de T4 RNA, 4 μL de 10 mM ATP, 1 μl de inhibidor de la Rnasa, 1 μl de agua NF y 8 μl de 50% polietileno glicol (PEG).
  2. Homogeneizar la muestra con un vórtex, luego añadir 2 μl de 10 U/μl de T4 RNA ligasa I. mezclar la muestra otra vez transfiriendo lo e incubar a 25 ° C por 2 h en un termociclador con la temperatura de la tapa a 30 ° C.
  3. Después de 2 h, añadir 10 μl de agua NF a la muestra y limpiar la muestra con un kit de limpieza y concentración de oligo según las especificaciones del fabricante. Eluir la muestra de 20 μl de agua NF.
  4. Revertir transcribe las moléculas de ARN circular, añadir 4 μL de 10 mM de dNTPs, 4 μL de 50 ng/μl random hexamers y 9 μl de agua NF a 9 μl de ARN. Mezclar todo bien mediante pipeteo, desnaturalizar la muestra a 65 ° C por 1 min y coloque en hielo durante 2 minutos tienda el ARN restante como respaldo.
  5. Añadir 8 μl de tampón de síntesis de la primera línea de 5 x, 2 μl de 0,1 mM DTT y 4 μL de 200 U/μl de la transcriptasa reversa y todo mezclar mediante pipeteo. Incubar la muestra a 25 ° C durante 10 min, seguido de una incubación de 20 min a 42 ° C con la tapa a 5 ° C superior a la temperatura de incubación.
    Nota: Debe usarse una transcriptasa inversa con capacidad de desplazamiento de hebra en este paso para permitir una transcripción reversa de círculo rodante.
  6. Añadir 10 μl de agua NF a la muestra y limpiar con el kit de limpieza y concentración de oligo según las recomendaciones del fabricante. Eluir la muestra 42 μl de solución de elución.
  7. Control de calidad: Diluya 2 μl de la ADNc monocatenario en 2 μl de agua NF y ejecutar este ejemplo en un instrumento de análisis de nucleótido con una cinta de ARN de alta sensibilidad. Si la transcripción inversa funcionara correctamente, una biblioteca de cDNA de moléculas, que van desde aproximadamente 60 – 1.500 bases de longitud, debe ser visible. Idealmente, la mayoría cDNA está en el rango de 500 – 1.000 bases (Figura 2d).

7. segundo Strand cDNA síntesis y reparación final

  1. Utilizar un segundo kit de síntesis de strand para generar una biblioteca de cDNA de doble hebra. Coloque las muestras en hielo y añadir 30 μl de agua NF a 38 μl de la muestra. Luego, añadir 8 μl de 10 x segundo Strand Buffer y 4 μL de la segunda enzima de la cadena y mezcle la muestra mediante pipeteo suave antes de su incubación a 16 ° C durante 2,5 horas.
  2. Limpiar las muestras con el oligo limpieza y concentración kit según las recomendaciones del fabricante para 100 reacciones μl y elución las muestras en 38 μl de agua NF.
  3. Configurar la reacción de reparación final añadiendo 20 μl de agua NF a 35,5 μl de cDNA de doble hebra, 6,5 μl de tampón de reacción de reparación final y 3 μl de mezcla de enzima de preparación final. Cuidadosamente Revise el buffer de reacción para precipitados blancos y disolver por calentamiento de mano si está presente.
  4. La mezcla de la reacción final de reparación mediante pipeteo e incubar a 20 ° C por 30 min, seguida de una segunda incubación de 30 min a 65 ° C. Ajuste la temperatura de la tapa del termociclador a 5 ° C más alta que la temperatura de incubación.

8. adaptador ligadura y selección del tamaño de bibliotecas preparadas

  1. Utilizar un módulo de preparación de biblioteca de varios pasos para la preparación final de la biblioteca (véase Tabla de materiales). En primer lugar, diluir los adaptadores para la nueva generación de la secuencia 10 veces en 10 mM Tris-HCl a una concentración final de 1,5 μm. Luego, añadir 2,5 μl de adaptador diluido y 1 μl de reforzador de la ligadura a cada muestra y mezclar con un vórtex.
  2. Agregar 15 μl de Blunt/TA ligasa Master Mix, mezclar mediante pipeteo e incubar a 20 ° C durante 15 minutos. Luego, agregar 3 μl de enzima de reactivo la supresión específica de uracilo e incubar a 37 ° C durante 15 minutos. Después de completar la ligadura, añadir 13,5 μl de agua NF a la muestra para un volumen total de 100 μl y proceder a la selección de tamaño.
    Nota: Es mejor seleccionar tamaño moléculas de cDNA que están en el rango de 600-800 bases en longitud. Si las moléculas de ARN fragmentadas eran aproximadamente 60 – 80 bases de longitud, seleccionar moléculas que son 600-800 bases en longitud se asegurará de que la mayoría de las moléculas seleccionadas contienen al menos tres repeticiones en tándem, que es ideal para el procesamiento de aguas abajo y Análisis.
  3. Para seleccionar moléculas que son 600-800 bp de longitud, Añadir 30 μl de granos magnéticos resuspendidos (véase Tabla de materiales), aclimatados a TA, cada uno de la muestra y mezclar mediante pipeteo. Transferir la muestra a un tubo de 1,5 mL e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  4. Coloque la muestra en un soporte magnético para 5 min separar el sobrenadante de los granos. Transferir el sobrenadante (que contiene las moléculas de cDNA deseada) para tubo un mL 1,5 nuevo y deshacerse de las bolas magnéticas (que están enlazadas a moléculas de cDNA grande).
  5. Añadir una nueva alícuota de 15 μl de granos magnéticos a cada muestras, homogeneizar mediante pipeteo e incube durante 5 minutos en lugar de RT. las muestras en una rejilla magnética e incubar por 5 min a TA. Entonces, retire con cuidado y deseche el sobrenadante, procurando no molestar a los granos.
    Nota: No deseche las bolas magnéticas, que ahora contienen el cDNA del objetivo deseado.
  6. Añadir 200 μL de 80% recién preparado etanol a cada una de las muestras sin perturbar las bolas magnéticas sedimentadas e incube durante 30 s. descartar el etanol y lavar las muestras con etanol al 80%. Luego, completamente quitar cualquier rastro de etanol de las muestras y deje secar al aire los granos para 5 min pero tenga cuidado de no secar demasiado las cuentas. Si los granos se secan, aparecerán grietas en las pelotillas.
  7. Para eluir las muestras de los granos, retirar los tubos del soporte magnético y agregar 19 μl de 10 mM Tris-HCl. Pipetear arriba y abajo varias veces a suspendidas las cuentas e incubar las muestras durante 5 min a TA. Si los granos se secan, para incubar > 10 minutos.
  8. Coloque las muestras en el soporte magnético e incubar por 5 min separar el sobrenadante de los granos. Cuidadosamente retire 15 μl del sobrenadante que contiene las bibliotecas de ADNc purificado, seleccionado por el tamaño de los tubos y transferirlo a un nuevo tubo 1,5 mL.

9. PCR amplificación y purificación Final del grano

  1. Añadir 5 μl de cebador universal y 5 μl de una cartilla de índice único (véase tabla de materiales) a cada uno purificado biblioteca del cDNA y homogeneizar mediante pipeteo. Cuidadosamente Compruebe la mezcla principal de polimerasa para cristales y otros precipitados y calentar la mezcla principal a mano hasta que los precipitados se disuelven.
    1. Añadir 25 μl de la mezcla principal de polimerasa a la muestra, mezclar mediante pipeteo y seguir las condiciones bicicleta a continuación para la amplificación por PCR. Ejecutar la desnaturalización inicial a 98 ° C por 30 s y llevar a cabo un paso doble reacción de PCR por denaturating las muestras a 98 ° C durante 10 s y recocido/extensión de los productos PCR a 65 º C por 75 s (x 12), seguido de una extensión final a 65 º C por 5 min y una espera indefinida a 4 º C.
  2. Limpiar las librerías finales añadiendo 45 μl de granos magnéticos resuspendidos directamente a la reacción de PCR, mezclar mediante pipeteo y ellos a temperatura ambiente por 5 min transferencia incubar la muestra a un tubo de 1,5 mL y colocarlo en un soporte magnético. Incubar por 5 min, descartar el sobrenadante y lavar dos veces con etanol de 80% recién preparada para 30 s.
  3. Después del segundo lavado, completamente eliminar el etanol de la muestra y secar el sedimento de grano durante 5 minutos y eluir en 35 μl de 0,1 x TE. Resuspender los granos mediante pipeteo les e incúbelos a RT por 5 min lugar la muestra sobre el soporte magnético y después de 5 min, transferir 30 μL del sobrenadante a un nuevo tubo 1,5 mL. Almacenar las bibliotecas a-80 ° C.
  4. Control de calidad: Diluya 1 μl de la biblioteca final en 9 μl de agua NF y ejecutar el ejemplo en un dedicado instrumento de análisis de ADN con un chip de alta sensibilidad; la mayoría de los ADNc debe estar en el rango de 600-800 bp de longitud (figura 2e).
  5. Después de la elución, enviar las muestras de secuencia en una plataforma de secuenciación masivamente paralela usando lecturas de extremo apareado de bp 250, o 300 lecturas del solo-fin de bp.

10. bio-informática análisis de secuenciación datos del círculo

Nota: Analizar e interpretar datos sin procesar desde el análisis de C-seq requieren una tubería bio-informático dedicadoa. Un esquema de la tubería que se utilizó para los análisis se muestra en la figura 3. Descargar este gasoducto en https://github.com/LynchLab/MAPGD.

  1. En primer lugar, recortar la Lee y quitar adaptador secuencias llamadas base de baja calidad con cutadapt18, utilizando un umbral de puntuación de calidad de 20.
  2. Luego, identificar las repeticiones codificadas por la molécula de RNA de concatemerized utilizando un algoritmo apropiado para detectar cualquier repeticiones con un mínimo de 30 nucleótidos y un máximo de 2 uniones mal hechas entre repeticiones18. De todas las llamadas de base y puntuaciones de calidad asociado en cada posición y obtener una secuencia consenso de estas repeticiones.
    Nota: Porque la reversa de la transcripción puede comenzar en cualquier posición en la molécula de RNA circular, el inicio de una repetición no necesariamente corresponden al extremo 5′ de la molécula de ARN fragmentado (en lo sucesivo, el punto de ligadura). Por consiguiente, la secuencia de consenso no mapa continuamente contra el transcriptoma correspondiente, que exige la identificación del punto de ligadura.
  3. Para identificar el punto de ligadura, mapa concatemer de la secuencia de consenso contra el transcriptoma de referencia mediante la alineación de la ráfaga-como herramienta (BLAT)19.
    1. Concatenar dos instancias de la secuencia de consenso para asegurar que la secuencia asignada contiene al menos una ocurrencia ininterrumpida completa de la secuencia inicial del fragmento de RNA. Entonces, gire la secuencia consenso para iniciar en la posición del punto de ligadura predicha.
  4. Mapa de las secuencias consenso girada contra el genoma usando TopHat20 y las alineaciones para detectar cualquier polimorfismos de nucleótido único (SNPs) que podrían confundirse con errores de transcripción.
  5. Llamar a los errores de transcripción de las secuencias consenso girado asignados y comprobar los errores del candidato pasan cuatro pruebas adicionales.
    1. En primer lugar, asegúrese de que un error de transcripción no se superpone con un SNP (un requisito típico es que al menos 20 lecturas necesitan cubrir una determinada base y no mayor de 5% de la lectura puede apoyar una alternativa llamada base).
    2. En segundo lugar, compruebe que la secuencia de consenso se deriva de al menos 3 repeticiones en tándem, cada uno de los cuales llama el mismo par de base; y en tercer lugar, asegúrese de que la suma de las puntuaciones de calidad de esa posición debe ser más de 100.
  6. Para una cuarta y última Compruebe, gire la secuencia consenso en todas las combinaciones posibles (simular todas las posibles posiciones del punto de ligadura) y mapa cada versión contra el genoma de referencia utilizando TopHat.
    Nota: Si una de las secuencias rotadas encuentra a una combinación perfecta en el genoma, el punto correspondiente de la ligadura se considera correcta y se debería rechazar la llamada de error de transcripción.

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Resultados

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Como todos los enfoques de secuenciación masivamente paralela, cada experimento C-seq produce un conjunto de datos grandes, difíciles de manejar. Para los usuarios de primera vez, puede ser difícil de manejar estos conjuntos de datos; por lo tanto, se recomienda que todos los usuarios en contacto con un bio-informático experimentado antes de la experimentación. En promedio, la expectativa es que los usuarios generen aproximadamente 55 – 70 Giga bases (Gbases) por ejecutar en más plataform...

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Discusión

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Aquí, describimos un protocolo optimizado para la elaboración de bibliotecas de C-seq para la detección de errores de transcripción en Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastery Caenorhabditis elegans. Este protocolo tiene numerosas ventajas sobre los protocolos existentes, así como técnicas alternativas.

En los últimos 15 años, numerosos reportero han desarrollado sistemas que dependen de luciferase7,8

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Esta publicación fue hecha posible por el financiamiento del grant T32ES019851 (para C. Fritsch), R01AG054641 y un investigador joven AFAR conceden (a M. Vermulst).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de purificación de ARN RiboPureThermoFisherAM1926Purificación total de ARN
Kit de purificación de ARNm de GeneluteSigma-AldrichMRN70-1KTPurificación de ARNm
Agua libre de nucleasasAmbionAM9937Elución y dilución
Ambion RNasa IIIThermoFisherAM2290Fragmentación de ARN
T4 Ligasa 1 (ssRNA Ligasa)New England BiolabsM0204S CircularizaciónARN
RibolockThermoFisherEO0381Inhibidor de RNasa
SuperScript III Transcriptasa inversaThermoFisher18080044Transcripción inversa de círculo rodante
10 mM Mezcla dNTPThermoFisher 18427013Transcripción inversa de círculo rodante
Hexámeros aleatorios (50 ng/µ L)ThermoFisherN8080127Transcripción inversa de círculo rodante
Módulo de síntesis de segunda cadena NEB SíntesiscadenaE6111SNew England Biolabs
Kit de preparación de la biblioteca de ADN NEBNext Ultra para lapreparación de la biblioteca de ADNcIllumina New England BiolabsE7370S
Imprimaciones de índice NEB Next Imprimaciones
de PCR multiplex NEB E7335SOligo Limpio & ConcentradorZymo ResearchD4061Limpieza de muestras de ARN y ADN
DynaMag-2 ImánThermoFisher12321DPurificación magnética de perlas
AMPure XP PerlasBeckman CoulterA63881Purificación magnética de perlas
Eppendorf 5424 Microcentrífuga FisherScientific05-403-93
INCU-Shaker 10 LBenchmark ScientificH1010Cultivo celular
T100 TermocicladorBIO RAD1861096Condiciones de ciclo de media a alta temperatura
PTC-200 Termociclador GMI8252-30-0001 Condiciones de ciclo a baja temperatura
RNase Away MolecularBioproducts700S-11Esterilización
50 mL Tubo de centrífugaCorning430290sin nucleasa
Corning430052sin nucleasa
USA Scientific1615-5500sin nucleasas
AgilentG2991AAInstrumento de análisis de nucleótidos para el control de calidad de muestras de ARN y ADN monocatenario
Cinta de cribado de ARN de alta sensibilidadAgilent5067-5579Control de calidad de muestras de ARN y ADN monocatenario
Tampón de muestras RNA ScreenTapeAgilent5067-5577Control de calidad de muestras de ARN y ADN monocatenario
Escalera RNA ScreenTapeAgilent5067-5578Control de calidad de muestras de ARN y ADN monocatenario
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilentG2939BAControl de calidad de ADN bicatenario
Kit de ADN de alta sensibilidadAgilent5067-4626 Control decalidad para muestras de ADNc bicatenario
Baño de aguaVWR462-0244Incubación
NanoDrop 2000/2000C EspectrofotómetroThermoFisherND-2000CDeterminación de la concentración de ARN
de de segunda de Tubo de centrífuga de 15 mL Tubos Eppendorf Sistema de estación de cinta 4200

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
  3. Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
  4. Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).
  5. Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484(2017).
  6. Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
  7. Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
  8. Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
  9. Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
  10. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
  11. Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065(2015).
  12. van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
  13. van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
  14. Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
  15. Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
  16. Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
  17. Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
  18. Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  19. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
  20. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36(2013).
  21. Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
  22. Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).

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