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Retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de Immunohistochemical del pericitos microvasculares

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DOI:

10.3791/57733

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7 de octubre de 2018

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1Department of Clinical Experimental Research, Glostrup Research Institute, 2Department of Clinical Sciences, Division of Experimental Vascular Research, Lund University

En este artículo

Resumen

Demostrar técnicas de preparación de tres tejidos diferentes para la visualización de immunohistochemical del pericitos microvasculares retina de rata, es decir, cryo-secciones, todo-montajes e hipotónica aislamiento de la red vascular.

Resumen

Pericitos retinianos juegan un papel importante en muchas enfermedades del ojo. Immunohistochemical que manchaba técnicas de vasos retinianos y microvascular pericitos son fundamentales para la investigación oftalmológica. Es vital elegir un método apropiado de visualización del pericitos microvasculares. Describimos pericyte microvascular retiniana immunohistochemical que manchaba en cryo-secciones, todo-montajes e hipotónica vasculatura aislado usando los anticuerpos para el antígeno del nervio/glial 2 (NG2) y β del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRβ). Esto nos permite destacar ventajas y deficiencias de cada una de las preparaciones de tres tejido para la visualización del pericitos microvasculares retinianas. Cryo-secciones proporcionan visualización de transsectional de todas las capas retinianas pero contienen sólo unos ocasionales cortes transversales de la microvascularización. Montaje en conjunto proporciona una visión general de la vasculatura retiniana completa y visualización de la microcirculación puede ser problemática. Hipotónica aislamiento proporciona un método para visualizar la vasculatura retiniana toda por la eliminación de las células neuronales, pero esto hace que el tejido muy frágil.

Introducción

Pericitos retinianos son el foco de muchos laboratorios de investigación como estas células desempeñan un papel importante en la integridad de la vasculatura. Condiciones patológicas tales como la retinopatía diabética1, isquemia2y glaucoma3 tienen características vasculares que implican la función del pericitos. Pericitos se encuentran en los plexos capilares retinianos internos. Ramas de la arteria central de la retina que suministra la retina interna en dos capas de plexos capilares. El lecho vascular interno se encuentra entre la célula del ganglio y las capas nucleares internas. La capa más profunda es más densa y compleja y se localiza entre las capas nucleares interna y externa4,5. Además, algunas partes de la retina contienen también una tercera cadena denominada los capilares parapapillary radial. Estos son largos, tubos capilares rectos que se encuentran entre las fibras nerviosas y raramente los anastomose con uno con el otro o los otros dos plexos6. Dentro de la pared capilar, pericitos están incrustadas en la membrana del sótano y la línea del lado abluminal de células endoteliales vasculares.

Hasta la fecha, no existe ningún marcador biológico único de estos pericitos que puede distinguir de otras células vasculares. Β del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRβ) y el antígeno del nervio/glial 2 (NG2) son marcadores utilizados que presentan en pericitos pero también otras células vasculares. Identificación del pericitos se complica aún más por la existencia de pericyte subconjuntos que varían en morfología y proteína expresión7. Actualmente, la mejor identificación se basa en una combinación de marcadores de proteínas y la característica de la pericyte en la pared vascular. Aquí demostramos tres técnicas de preparación de tejidos diferentes para la coloración immunohistochemical PDGFRβ/NG2 del pericitos microvasculares retina de rata, es decir, cryo-secciones, todo-montajes y aislamiento hipotónica de la red vascular.

Con secciones de cryo, la retina y la esclerótica se cortan a través del nervio óptico. Esto permite la visualización de todas las estructuras de capas de neuronas. Las diez distintas capas de la retina son evidentes como intercambio de estructuras nucleares y axonal/dendríticas que pueden visualizarse con tinciones como hematoxilina/eosina o fluorescente nuclear 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. Las necesidades metabólicas difieren entre las capas9 y ofrece un método para determinar el grueso o total ausencia de una capa específica (por ejemplo, la pérdida de células ganglionares de la retina es una de las características de la isquemia retiniana10, 11). La vasculatura es evidente como transversal atraviesa la retina, lo que es posible estudiar por separado los plexos capilares dentro de las respectivas capas retinianas12,13.

Más tradicionalmente, se realizan las investigaciones de la red de la vasculatura retiniana en retina de monturas de todo. Con esta preparación de tejido, la retina se corta y aplanada como una estructura en forma de flor. El método es una técnica de preparación de tejido relativamente rápido que se puede destacar la vasculatura retiniana de arquitectura general y por lo tanto se aplica a menudo en la investigación de neovascularización de la retina murina. Visualización exitosa de la microvascularización en retinas todo montado también se divulga en el ratón neonatal en desarrollo y14,de retina de rata15,de17,de16,18, 19. estos estudios revelan una actividad pericytic más definida con áreas libre de capilares más grandes en el adulto frente a los los neonatal retina14.

Otra forma de visualizar es la microvasculatura retiniana después aislamiento hipotónica. Esta técnica de preparación de tejido resulta en vasos sanguíneos retinianos y capilares liberados de las células neuronales. Este tipo de proyección de imagen de dos dimensiones de la red vascular retiniana aislada es generalmente realizada después de la digestión de tripsina retina20 y utilizado para evaluar las anormalidades vasculares de la retinopatía diabética como pericyte pérdida capilar degeneración20,21,22. El método de aislamiento hipotónica ofrece las investigaciones de gen vascular retiniana y proteínas reguladoras respuestas como lo ha hecho con la RT-PCR y western blot23,24,25. Aquí proporcionamos un protocolo para el flotador libre de la coloración de immunohistochemical de la vasculatura retiniana aislada hipotónica como alternativa a la digestión de la tripsina para examinar del pericitos microvasculares.

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Protocolo

El protocolo fue optimizado y demostrado en ratas albinas machos adultos. En todos los procedimientos experimentales, los animales fueron tratados según las disposiciones de la declaración de ARVO para el uso de animales en oftálmica y la investigación de la visión. Los animales fueron sacrificados por el dióxido de carbono y la dislocación cervical posterior.

1. rata tejido retiniano preparados

  1. Cryo-sección
    1. Hacer posterior y anterior de ~0.5 rajas de cm de en el párpado de rata con un bisturí.
      1. Opcional: Con un quemador de diatermia, marque el ojo en el ángulo interno para orientar los ojos de una manera uniforme durante la incrustación y permitir criostato vertical Seccionando a través del nervio óptico.
    2. El ojo del gancho agarrador con el fórceps e incline cuidadosamente a un lado para exponer el tejido circundante. Enuclear el ojo haciendo cortes con las tijeras de disección en el tejido conjuntivo y muscular.
      PRECAUCIÓN: No tire el ojo demasiado ya que una presión excesiva sobre el nervio óptico puede causar desprendimiento de retina.
    3. Poner los ojos brevemente en formaldehído al 4% en tampón fosfato salino (PBS) se estabilice antes de hacer un agujero inicial en el limbus córneo aplicando ligera presión con la punta de un bisturí.
    4. Bajo el microscopio, corte a lo largo del limbo corneal con tijeras de disección para retirar la córnea y retirar la lente con el fórceps antes de sumergirse en formaldehído al 4% en PBS durante 2 – 4 h.
    5. Enjuague secuencialmente en tampón de fosfato de Sörensen con 10% de sacarosa y 25% de sacarosa.
    6. Incrustar en medio de Yazulla con 3% gelatina de porcino piel y 30% albúmina de clara de huevo de pollo.
      Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí con almacenamiento de tejido a-20 ° C.
  2. Montaje en conjunto
    1. Hacer posterior y anterior de ~0.5 cm cortes en el párpado de rata con un bisturí.
    2. El ojo del gancho agarrador con el fórceps e incline cuidadosamente a un lado para exponer el tejido circundante. Enuclear el ojo haciendo cortes con las tijeras de disección en el tejido conjuntivo y muscular.
      PRECAUCIÓN: No tire el ojo demasiado ya que una presión excesiva sobre el nervio óptico puede causar desprendimiento de retina.
    3. Poner los ojos brevemente en formaldehído al 4% en PBS a estabilizar antes de hacer un agujero inicial en el limbus córneo aplicando ligera presión con la punta de un bisturí.
    4. Bajo el microscopio, corte a lo largo del limbo corneal con tijeras de disección para retirar la córnea y retirar la lente con el fórceps.
    5. Separar la retina del epitelio pigmentario de la retina hacia el nervio óptico con el fórceps con pequeña abertura movimientos para evitar desgarro importante.
    6. Libre de la retina en el nervio óptico con tijera de disección y hacer cuatro cortes de pocos milímetros de longitud de la periferia retiniana hacia la cabeza del nervio óptico.
    7. Difundir la retina en un portaobjetos de vidrio y permite secar durante 5 – 10 min.
    8. Fijar en formaldehído al 4% para 20-30 min por goteo de formaldehído en la retina.
      PRECAUCIÓN: No aplicar directamente sobre la retina como puede separar de la Copa.
    9. Lavar con PBS. Para obtener resultados óptimos, inmuno-tinción directamente después del enjuague.
  3. Aislamiento hipotónica
    1. Hacer posterior y anterior de ~0.5 cm cortes en el párpado de rata con un bisturí.
    2. El ojo del gancho agarrador con el fórceps e incline cuidadosamente a un lado para exponer el tejido circundante. Enuclear el ojo haciendo cortes con las tijeras de disección en el tejido conjuntivo y muscular.
      PRECAUCIÓN: No tire el ojo demasiado ya que una presión excesiva sobre el nervio óptico puede causar desprendimiento de retina.
    3. Hacer un agujero inicial en el limbus córneo aplicando ligera presión con la punta de un bisturí.
    4. Bajo el microscopio, corte a lo largo del limbo corneal con tijeras de disección para retirar la córnea y retirar la lente con el fórceps.
    5. Separar la retina del epitelio pigmentario de la retina hacia la cabeza del nervio óptico con el fórceps con pequeña abertura movimientos para evitar desgarro importante.
    6. Sin la retina en el nervio óptico con tijeras de disección, colocar la retina en 1 mL de agua desionizada en un plato 24-well y agita a 200 rpm con una órbita de vibraciones 1,5 mm por 1 h a temperatura ambiente.
      Nota: En adelante, la retina aparece que menos definida en los bordes.
    7. Añadir 200 U DNasa 1 para disociar los restos de células sometidas a lisis de la vasculatura retiniana y agite por otros 30 minutos a temperatura ambiente.
      Nota: Desechos podrían empezar a formarse en los pozos.
    8. Enjuague mínimo 3 veces en agua desionizada durante 5 min con agitación a 150 – 300 rpm para eliminar los restos de células neuronales. La retina debe ser más transparente con cada enjuague indicativo de la eliminación de los desechos celular neuronal.
      1. Para ver en la placa de 24 pocillos a ver claramente la vasculatura retiniana aislada diáfana, usar un fondo oscuro.
      2. (Opcional): Si la vasculatura no aparece libre de capas neuronales (semi transparentes) en este punto ya sea añadir más pasos de enjuague, aumentar la velocidad de agitación o utilice una pipeta para aspirar el líquido sobre la vasculatura.
        PRECAUCIÓN: Cualquiera de los pasos opcionales pueden dañar la vasculatura.
    9. Arreglo 10 minutos en 1 mL de paraformaldehído al 4% en PBS a temperatura ambiente y enjuagar 3 veces en PBS.
      Nota: El protocolo puede pausarse aquí con almacenamiento de tejidos a 4 º C.

2. inmunohistoquímica

  1. Tinción de cryo-secciones
    1. Corte 10 μm cryo-secciones de la retina embebido en gelatina como seccionamiento vertical a través del nervio óptico y coloque el cryo-secciones en un portaobjetos de vidrio y dejar secar (mínimo 1 h).
    2. Sumerja el portaobjetos de cristal en PBS con 0.25% Tritón X-100 (PBS-T) durante 15 minutos.
    3. Goteo 1: PDGFRβ 100 y 1: 500 NG2 anticuerpos primarios diluidos en PBS-T + 1% de BSA en la sección de crio e incubar en cámaras de incubación a 4 ° C durante la noche.
    4. Sumerja el portaobjetos de cristal 2 veces en PBS-T durante 15 min y 1: 100 Alexa Fluor 594-ligado y 1: 100 Anti-conejos FITC-ligado secundarios anticuerpos anti-ratón diluidos en PBS-T con el 3% de BSA en el cryo-secciones del goteo.
    5. Incube el portaobjetos de cristal 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
    6. Enjuagar el portaobjetos de cristal en PBS-T 2 x 15 min.
      Nota: Opcional: para dobles y triples de tinción inmunofluorescente, tinción secuencial puede realizarse repitiendo el procedimiento de 2.1.3 y 2.1.6 dos y tres veces, respectivamente.
    7. Monte las secciones manchadas de crio con antidecoloración montaje medio DAPI que contiene y un cubreobjetos.
  2. La coloración de conjunto montaje
    1. Gotee el montaje conjunto con PBS-T e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
    2. Retirar y goteo 1: PDGFRβ 100 y 1: 500 NG2 anticuerpos primarios diluidos en PBS-T + 1% de BSA e incubar en cámara húmeda a 4 ° C durante la noche.
    3. Retirar y goteo en PBS-T para enjuagar el portaobjetos de vidrio de 2 x 15 min.
    4. Retirar y gotear en el 1: 100 anti-conejo Cy2 - y 1: 100 anti-ratón Cy3-ligado anticuerpo secundario diluido en PBS-T con el 3% de BSA para incubar 1 h en cámara húmeda a temperatura ambiente en la oscuridad.
    5. Retirar y goteo en PBS-T a la aclaración de 2 x 15 min en la oscuridad.
      Nota: Opcional: para dobles y triples de tinción inmunofluorescente, tinción secuencial puede realizarse repitiendo el procedimiento de 2.2.2 a 2.2.5 dos y tres veces, respectivamente.
    6. Monte el soporte de toda manchado con antidecoloración montaje medio DAPI que contiene y un cubreobjetos.
  3. Tinción de vasculatura aislado hipotónica
    1. Bloquear la vasculatura aislada hipotónica 1 h con agitación a 100 rpm y temperatura con 500 μL/pocillo de suero de burro 10% diluido en PBS.
    2. Incubar durante una noche a temperatura ambiente y agite a 100 rpm con 600 μL/pocillo de 1 PDGFRβ: 100 y 1: 500 NG2 anticuerpos primarios diluidos en suero de burro de 10% en PBS.
    3. Enjuague la retina red 3 x en PBS durante 5 minutos e incubar en 1: 100 Alexa Fluor 594-ligado y 1: 100 Anti-conejos FITC-ligado secundarios anticuerpos anti-ratón diluidos en suero de burro de 10% en PBS agitación a 100 rpm y a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad.
    4. Lavar en PBS-T por 5 min e incubar en DAPI en PBS-T de 0,2 ng/mL durante 15 min seguido por enjuagues 3 veces, 5 minutos en PBS-T en la oscuridad.
    5. Cortar la punta de una pipeta Pasteur plástica, humedézcalo con PBS-T y usarlo para transferir la red retina a un portaobjeto de cámara 4-bien.
      Nota: El paso de la humectación es importante evitar la vasculatura retiniana que se pega en el interior de la pipeta de Pasteur.
    6. Despliegue de la vasculatura retiniana. Evite tocar la vasculatura retiniana con pinzas ya que esto puede causar la vasculatura a enredarse.
      Nota: Despliegue puede hacerse inclinando el portaobjetos de la cámara hacia adelante y hacia atrás o aspirar las gotas de líquido sobre la vasculatura retiniana.
    7. Retire el medio de los pozos. La tensión superficial del líquido se aplane la vasculatura en la parte inferior de la diapositiva.
    8. Asegurar el correcto despliegue bajo el microscopio antes de retirar el plástico de los pozos de la diapositiva de la cámara.
    9. Monte la vasculatura manchada con medio de montaje antidecoloración y un cubreobjetos.

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Resultados

Los protocolos exitosos proporcionan tres diferentes preparaciones de retinales para la visualización de pericitos microvasculares. Cada uno de estos métodos utiliza la PDGFRβ y NG2 immunoreactivity co-localización y la posición única del pericitos alrededor del foridentification del endotelio capilar.

Con secciones de crio, las capas neuronales pueden ser identificadas por la densidad fluorescente de núcleos etiquetados de DAPI...

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Discusión

Presentamos tres técnicas retiniana que pueden ser aplicadas en el estudio del pericitos retinianos microvasculares. A continuación, ofrecemos una comparación entre cada uno de los métodos y resaltar los pasos críticos en los protocolos.

Con el seccionamiento de cryo, la retina se corta en secciones sagitales y por lo tanto, es posible obtener numerosas muestras de la misma retina. Las secciones números resultantes de este método lo hacen una opción ideal para la especificidad de anticuerpos y...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

La investigación fue financiada por la Fundación Lundbeck, Dinamarca.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Geletina de piel porcinaSigma-AldrichG2625-500G
Albúmina de clara de huevo de gallinaSigma-AldrichA5253-500G
Desoxirribonucleasa (ADNasa) I de páncreas bovinoSigma-AldrichD5025-15KUDisuelto en 0,15 M NaCl
Albúmina sérica bovina (BSA)VWR0332-100G
Suero de burro normalJackson ImmunoResearch017-000-121, lote 129348
Conejo anti-PDGFRβSanta Cruzsc-4321:100
Ratón anti-NG2Abcamab500091:500
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Conejo IgGJackson ImmunoResearch711-585-1521:100
Fluoresceína (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-095-1511:100
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-225-1521:100
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-165-1501:100
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Sigma-AldrichD9542-1MGDisuelto en DMSO
Medio de montaje anti-decoloraciónVector LaboratoriesH-1000
Medio de montaje anti-decoloración con DAPIVector LaboratoriosH-1200
Nunc Lab-Tek II portaobjetos de 4 pocillosThermo Fisher Scientific154526

Referencias

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