Demostrar técnicas de preparación de tres tejidos diferentes para la visualización de immunohistochemical del pericitos microvasculares retina de rata, es decir, cryo-secciones, todo-montajes e hipotónica aislamiento de la red vascular.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de Immunohistochemical del pericitos microvasculares
En este artículo
Resumen
Resumen
Pericitos retinianos juegan un papel importante en muchas enfermedades del ojo. Immunohistochemical que manchaba técnicas de vasos retinianos y microvascular pericitos son fundamentales para la investigación oftalmológica. Es vital elegir un método apropiado de visualización del pericitos microvasculares. Describimos pericyte microvascular retiniana immunohistochemical que manchaba en cryo-secciones, todo-montajes e hipotónica vasculatura aislado usando los anticuerpos para el antígeno del nervio/glial 2 (NG2) y β del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRβ). Esto nos permite destacar ventajas y deficiencias de cada una de las preparaciones de tres tejido para la visualización del pericitos microvasculares retinianas. Cryo-secciones proporcionan visualización de transsectional de todas las capas retinianas pero contienen sólo unos ocasionales cortes transversales de la microvascularización. Montaje en conjunto proporciona una visión general de la vasculatura retiniana completa y visualización de la microcirculación puede ser problemática. Hipotónica aislamiento proporciona un método para visualizar la vasculatura retiniana toda por la eliminación de las células neuronales, pero esto hace que el tejido muy frágil.
Introducción
Pericitos retinianos son el foco de muchos laboratorios de investigación como estas células desempeñan un papel importante en la integridad de la vasculatura. Condiciones patológicas tales como la retinopatía diabética1, isquemia2y glaucoma3 tienen características vasculares que implican la función del pericitos. Pericitos se encuentran en los plexos capilares retinianos internos. Ramas de la arteria central de la retina que suministra la retina interna en dos capas de plexos capilares. El lecho vascular interno se encuentra entre la célula del ganglio y las capas nucleares internas. La capa más p....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
El protocolo fue optimizado y demostrado en ratas albinas machos adultos. En todos los procedimientos experimentales, los animales fueron tratados según las disposiciones de la declaración de ARVO para el uso de animales en oftálmica y la investigación de la visión. Los animales fueron sacrificados por el dióxido de carbono y la dislocación cervical posterior.
1. rata tejido retiniano preparados
-
Cryo-sección
- Hacer posterior y anterior de ~0.5 rajas de cm de en el párpado de rata con un bisturí.
- Opcional: Con un quemador de diatermia, marque el ojo en el ángulo interno para orientar los ojos de u....
- Hacer posterior y anterior de ~0.5 rajas de cm de en el párpado de rata con un bisturí.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Los protocolos exitosos proporcionan tres diferentes preparaciones de retinales para la visualización de pericitos microvasculares. Cada uno de estos métodos utiliza la PDGFRβ y NG2 immunoreactivity co-localización y la posición única del pericitos alrededor del foridentification del endotelio capilar.
Con secciones de crio, las capas neuronales pueden ser identificadas por la densidad fluorescente de núcleos etiquetados de DAPI.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Presentamos tres técnicas retiniana que pueden ser aplicadas en el estudio del pericitos retinianos microvasculares. A continuación, ofrecemos una comparación entre cada uno de los métodos y resaltar los pasos críticos en los protocolos.
Con el seccionamiento de cryo, la retina se corta en secciones sagitales y por lo tanto, es posible obtener numerosas muestras de la misma retina. Las secciones números resultantes de este método lo hacen una opción ideal para la especificidad de anticuerpos y.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
La investigación fue financiada por la Fundación Lundbeck, Dinamarca.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Geletina de piel porcina | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albúmina de clara de huevo de gallina | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Desoxirribonucleasa (ADNasa) I de páncreas bovino | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Disuelto en 0,15 M NaCl |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Suero de burro normal | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lote 129348 | |
| Conejo anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Ratón anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Conejo IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluoresceína (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Disuelto en DMSO |
| Medio de montaje anti-decoloración | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Medio de montaje anti-decoloración con DAPI | Vector Laboratorios | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II portaobjetos de 4 pocillos | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
Referencias
- Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. Diabetic retinopathy: Breaking the barrier. Pathophysiology. , (2017).
- Cai, W., et al. Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke. Translational Stroke Research. , (2016).
- Trost, A., et al. ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
