Evaluar el papel de la función mitocondrial en la fatiga relacionada con el cáncer

Resumen

Nuestro objetivo era desarrollar un protocolo práctico para evaluar la disfunción mitocondrial asociada a fatiga en pacientes con cáncer. Este innovador protocolo está optimizado para uso clínico que implica flebotomía estándar y procedimientos básicos de laboratorio.

Resumen

La fatiga es común y debilitante condición que afecta a la mayoría de los pacientes cáncer. Hasta la fecha, restos de fatiga mal caracterizados con ningún diagnóstico prueba para medir objetivamente la severidad de esta condición. Aquí describimos un método optimizado para la evaluación de la función mitocondrial de PBMCs recogidos de pacientes fatigados. Usando un sistema compacto de flujo extracelular y secuencial inyección de inhibidores respiratorios, examinamos estado funcional mitocondrial PBMC midiendo el básica respiración mitocondrial, capacidad respiratoria y fenotipo de energía, que describe la vía preferida de energía para responder al estrés. PBMCs frescos están disponibles en el ajuste clínico mediante flebotomía estándar. El ensayo completo que se describe en este protocolo se puede completar en menos de 4 horas sin la participación de técnicas bioquímicas complejas. Además, se describe un método de normalización que es necesario para obtener datos reproducibles. Los métodos de procedimiento y normalización simple presentados permiten para recolección de muestras repetidas del mismo paciente y generación de datos reproducibles que pueden compararse entre puntos de tiempo para evaluar los efectos potenciales del tratamiento.

Introducción

La fatiga es una condición frecuente y angustiante que tiene un impacto negativo en la calidad de vida de pacientes de cáncer¹. Hasta la fecha, fatiga del cáncer sigue siendo mal definida y se basa sólo en información subjetiva de pacientes². Por lo tanto, hay una necesidad urgente de identificar una prueba de laboratorio de diagnóstico fácilmente adaptable para caracterizar objetivamente la fatiga en el ajuste clínico^3,4.

Se han propuesto múltiples mecanismos subyacentes, incluyendo la disfunción de las mitocondrias, que causan fatiga⁵. Las mitocondrias son los orgánulos de potencia, ofreciendo el 95% de las necesidades de energía celular por fosforilación oxidativa y juegan un papel importante en la señalización de calcio, apoptosis, señalización inmune y regulación de otros de eventos de señalización intracelular⁶ . Por consiguiente, alteración bioenergética mitocondrial y defectos en la producción de energía pueden contribuir a la fatiga. Apoyando esta hipótesis, estudios anteriores han observado mutaciones en el ADN mitocondrial en pacientes con síndrome de fatiga crónica⁷. Aunque no está claro si el origen fisiopatológico de la fatiga se encuentra dentro del sistema nervioso central o periférico tejidos, como músculos esqueléticos^8,9, no existe ningún método directo para valorar con precisión disfunción mitocondrial se relaciona con fatiga en células vivas, respiran.

Utilizando células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) para el estudio de la función mitocondrial ofrece varias ventajas. En primer lugar, PBMCs están disponibles en el ajuste clínico mediante flebotomía estándar y pueden ser aislados rápidamente utilizando técnicas de laboratorio básicas. En segundo lugar, la recogida de sangre es menos invasiva que recoger otros tejidos tales como una biopsia del músculo. Así, recogieron muestras de sangre pueden ser del mismo paciente repetidamente en el tiempo, que facilita la evaluación longitudinal de los efectos del tratamiento. Curiosamente, la función mitocondrial en PBMCs parece correlacionarse bien con estado mitocondrial renal en un modelo animal¹⁰. Además, las mitocondrias de la célula inmune se han utilizado como un proxy para la detección de cambios sistémicos en enfermedad diferentes condiciones^11,12. Las mitocondrias en las células inmunes circulantes son particularmente sensibles a los cambios en las funciones inmunológicas e inmune señalización moléculas como citoquinas^13,14,15. Por ejemplo, se ha observado que PBMCs de pacientes con enfermedades inflamatorias reumáticas agudas exhiben alta base oxígeno consumo¹⁴. En contraste, el consumo de oxígeno se redujo en PBMCs aisladas de pacientes con condiciones inflamatorias sistémicas incluyendo sepsis¹⁶. En condiciones inflamatorias, radicales libres producidos por las mitocondrias disfuncionales pueden contribuir al elevado estrés oxidativo y la inflamación prolongada¹⁷. El papel central de las mitocondrias en la producción de energía, así como en el estrés oxidativo sugiere la posible utilidad del uso de la función mitocondrial como un proxy para el estudio de la fatiga en pacientes de cáncer ¹³.

Estudios anteriores que examinan la función mitocondrial utilizan técnicas bioquímicas, medición de potencial de membrana mitocondrial o aislamiento de poblaciones celulares específicas que no pueden ser fácilmente adaptables en el ajuste clínico^{5, 14,18}. En los últimos años, el desarrollo de ensayos de flujo extracelular ha permitido a los investigadores a fácilmente y con precisión examinar los cambios en la tasa de consumo de oxígeno (OCR) en respuesta a las inyecciones automatizadas de inhibidores respiratorios^{19,20 , 21 , 22}. sin embargo, la mayoría de estos estudios está diseñada para tipos específicos de la célula y el gran formato de alto rendimiento puede no ser aplicable en un ajuste clínico. En este manuscrito, se describe un protocolo optimizado para examinar la función mitocondrial para uso clínico.

Protocolo

El presente estudio (NCT00852111) fue aprobado por la Junta de revisión institucional (IRB) de los institutos nacionales de salud (NIH), Bethesda, Maryland. Los participantes inscritos en este estudio eran eutímicos, 18 años de edad o más, que fueron diagnosticados con cáncer de próstata no metastásico con o sin previa prostatectomía y fueron programados para recibir radioterapia de haz externo (EBRT). Los participantes potenciales fueron excluidos si tenían una enfermedad progresiva que puede causar fatiga significativa, tenían enfermedad psiquiátrica dentro de los últimos cinco años, tenía sin corregir el hipotiroidismo o anemia, o tenía una segunda malignidad. También se excluyeron los individuos que usaron sedantes, esteroides o agentes antiinflamatorios no esteroides. Se obtuvieron muestras de sangre de control sano en la medicina de los NIH Departamento de transfusión de donantes sanos bajo un protocolo aprobado por el IRB (NCT00001846). Todos los participantes son reclutados en el Magnuson Clinical Research Center en el NIH. Firmado Consentimientos informados escritos se obtuvieron antes de la participación en el estudio.

1. preparación de la medición de la función mitocondrial (día 1 del experimento)

1. Cartucho Sensor del hidrato (véase Tabla de materiales; duración aproximada: 5 minutos).
   1. Retire el cartucho de Sensor de paquete. Añadir 200 μL Calibrant solución en cada pocillo de la placa de la utilidad, luego llenar cada foso con 400 μL Calibrant solución.
   2. Devuelva el Sensor de la placa a la placa de la utilidad, que ahora tiene solución Calibrant. Hidratar el cartucho en un incubador de 37 º C sin CO₂ durante la noche.
      Nota: Cartucho Sensor necesita estar hidratado para un mínimo de 4 h y un máximo de 72 h.

2. preparación de la muestra clínicos (día 2 del experimento)

1. Medir la fatiga mediante el artículo 13 funcional evaluación de enfermedad la terapia crónica - fatiga (FACIT-F)^2,23,24 al inicio (antes de la iniciación de la EBRT), punto medio y completar EBRT y 1 año post-TRHE.
   1. Utilice un 0 - 4 escala de respuesta de cada elemento, donde 0 representa "nada" y 4 indica que el demandado refiere a la instrucción correspondiente "mucho." Puntaje total debe estar comprendida desde 16-53, con puntuaciones más bajas que reflejan la intensidad alta fatiga.
   2. Definir la fatiga como una puntuación de FACIT-F inferior a 43, con una puntuación de FACIT-F de ≥43 indicando ausencia de o no significativo clínicamente fatiga².
      Nota: Una puntuación de FACIT-F 43 mejor divide puntuaciones de fatiga de pacientes con cáncer y la población general².
   3. Incluyen los siguientes 13 artículos en la escala de fatiga de FACIT: 1) me siento fatigado; 2) me siento débil todo más; 3) me siento apático ("lavado hacia fuera"); 4) me siento cansado; 5) tengo problemas para iniciar cosas porque estoy cansado; 6) tengo problemas para terminar las cosas porque estoy cansado; 7) tengo energía; 8) soy capaz de hacer mis actividades habituales; 9) es necesario dormir durante el día; 10) estoy demasiado cansado para comer; 11) necesito ayuda para hacer mis actividades habituales; 12) me siento frustrado por estar demasiado cansado para hacer las cosas que quiero hacer; y 13) tengo que limitar mi actividad social porque estoy cansado.
2. Aislar PBMC de muestras de sangre recién recogidas (duración aproximada: 1 h).
   1. Recoger 8 mL de sangre en un tubo de preparación de células mononucleares (véase Tabla de materiales).
      Nota: Las muestras de sangre deben procesarse dentro de las 2 h de colección. La calidad de PBMCs puede verse comprometida si las muestras de sangre se procesan más de 2 h después de la recogida de muestras.
   2. Centrifugue a 1.750 x g durante 30 min a temperatura ambiente (18-25 ° C). Transferir la capa turbia en un tubo cónico de 15 mL. Añadir hasta 15 mL de PBS e invertir 5 veces.
   3. Centrifugar a 300 x g durante 15 minutos a 4 ° C. Cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante sin pellets inquietante. Resuspender el pellet agregando a 10 mL de PBS e invierta 5 veces.
   4. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Descarte el líquido sobrenadante y Resuspenda las células en 1 mL de PBS. Transferir las PBMCs de un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   5. Centrifugue a 610 x g durante 10 minutos. Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en completo RPMI-1640 (RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, 10 mM penicilina/estreptomicina).
3. Capa de placas de células para que las células no adherentes (duración aproximada: 30 min).
   1. Preparar la solución adhesiva de células y tejidos (véase Tabla de materiales) diluyendo la solución madre en bicarbonato de sodio, 0.1 M pH 8.0. La solución de trabajo deben de 3.5 μg/cm² de superficie.
      Nota: Esta solución contiene proteínas polifenólicos extraídas de lo marino mejillón, Mytilus edulis. Estas proteínas son componentes clave del pegamento secretada por el mejillón para anclarse a las superficies. Nos encontramos con que Cell-Tak funciona mejor con PBMCs.
   2. Añadir 100 μL de la solución de pegamento diluida en cada pocillo e incubar durante al menos 20 min a temperatura ambiente. Lavar tres veces con agua desionizada y aire seco.

3. medición de la función mitocondrial

1. Preparación de medios de ensayo (duración aproximada: 10 minutos).
   Nota: Los medios de ensayo deben ser recién preparados en el día del experimento.
   1. Añadir L-glutamina piruvato y glucosa a la base de los medios de comunicación (los mismo componentes como el medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM), sin bicarbonato de sodio, glucosa, glutamina o piruvato de sodio) para hacer los medios de ensayo. Calentar el medio a 37 ° C, luego ajustar el pH a 7,4.
      Nota: Las concentraciones de L-glutamina, piruvato y glucosa son generalmente las mismas concentraciones en medios de crecimiento normal, pero pueden ser ajustadas en base a lo análisis.
2. Preparar la prueba de estrés de Mito PBMCs (duración aproximada: 2 h).
   1. Placa suficiente PBMCs del paso 2 en cada pozo para llegar a 80-90% de confluencia. En nuestra experiencia, 1,5 x 10⁵ células/pozo produjo los resultados más consistentes.
      Nota: Pozos A y H son los pozos de fondo y sólo deben contener los medios de análisis sin las células. En pozos B a G, se recomienda al menos 3-6 pocillos por muestra del paciente de la galjanoplastia para explicar afloramientos.
   2. Girar las placas de abajo a 200 x g durante 2 minutos permitir que las células se adhieran al fondo de los pozos. Lavar las células una vez con los medios de ensayo. Este paso quita suero y bicarbonato de sodio desde el medio de crecimiento.
      Nota: En nuestra experiencia, el paso de lavado quita típicamente 20-30% de las células.
   3. Añadir 180 medios de ensayo μL en cada pocillo, incluyendo pozos de fondo A y H. Incubar en una incubadora de 37 ° C no CO₂ durante 45-60 minutos.
3. Realizar la prueba de estrés de Mito
   1. Reconstituir los fármacos en el Kit de estrés de Mito con los medios de ensayo como sigue:
      1. Oligomycin: Agregar medios de ensayo μL 252 en el frasco para generar una solución de reserva a 50 μM.
      2. FCCP: Añadir 288 μL del medio de ensayo en el frasco para generar una solución de reserva a 50 μM.
      3. Antimycin A / rotenona: 216 añadir μL de medios de ensayo en el vial para generar una solución stock a 25 μM.
   2. Drogas de vórtice reconstituido durante aproximadamente 1 minuto. Diluir en soluciones de trabajo.
      Nota: Las concentraciones de las soluciones de trabajo deben ser graduadas y predeterminadas antes del experimento según el tipo de célula. Para PBMCs, encontramos que 1 μM de Oligomycin, 1 μM FCCP y 0.5 μM antimycin A / rotenona funcionan mejor.
   3. Pipetear las drogas en cada puerto en el cartucho de sensor secuencialmente:
      1. Puerto A: Pipeta de 20 μL de 10 μM Oligomycin, para una concentración final en cada pozo de 1 μM.
      2. Puerto B: pipeta 22 μL de 10 μM FCCP, para una concentración final en cada pozo de 1 μM.
      3. Puerto C: Pipeta 25 μL de 5 μM antimycin A / rotenona para una concentración final en cada pozo de 0.5 μM.
4. Seleccione "Test de estrés de Mito" en un instrumento de flujo extracelular. Siga sistema de instrumento e inserte el cartucho de sensor. El instrumento realizará automáticamente la calibración del sensor. Inserte la placa de la célula después de calibración del sensor y el instrumento terminará el resto del ensayo. Dinámica de oxígeno se mide a 530 nm (excitación) / 650nm (emisión), y concentración de protón se mide a 470 nm (excitación) / 530 nm (emisión).

4. normalización de los datos de la función mitocondrial

1. Preparar la solución de ensayo de proliferación celular (duración aproximada: 5 minutos).
   1. Añadir 48 μL de ácido nucleico mancha (x 500) y supresor de fondo 240 μL a 11,7 mL PBS (x 2). La mancha de ácido nucleico es un colorante florescente de la célula de ADN, y el supresor de fondo es un tinte de enmascaramiento que bloquea las células muertas o células con integridad de la membrana de la célula comprometida de ser manchado. La combinación del tinte de unión al ADN y el supresor de fondo asegura que se tiñen las células sólo vivas.
   2. Añadir un volumen igual de 2 x solución de trabajo (180 μL) directamente en el medio en cada pozo ha finalizado la prueba de estrés de Mito.
2. Incubar las células en presencia de solución de ensayo de proliferación celular en una incubadora de 37 ° C durante 45-60 minutos cuantificar el número de células vivas (fluorescente) en un lector de placas a 508 nm (excitación) / 527 nm (emisión) y normalizar datos OCR (duración aproximada: 10 minutos) .
   Nota: además de las células energizadas número, los usuarios pueden elegir también a normalizar sus datos con el número total de células, cantidad de ácido nucleico, las concentraciones de proteína, etcetera.

Resultados

Los Test de estrés del Mito se basa en medir la tasa de consumo de oxígeno (OCR) después de la inyección secuencial de varios inhibidores respiratorios para asignar un perfil mitocondrial completo. Mediciones de OCR después de cada inyección de la droga puede utilizarse para calcular los siguientes parámetros relacionados con la salud mitocondrial: OCR Basal se mide primero antes de cualquier inyección de la droga para evaluar el consumo de oxígeno necesario para cubrir r...

Discusión

La fatiga en pacientes con cáncer es una condición debilitante que no está bien definido o caracterizado¹. Diagnóstico de fatiga se basa enteramente en informes subjetivos y no hay estándar actual de diagnóstico o tratamiento para esta condición, en gran parte debido a la falta de entendimiento en el pathobiology². De los mecanismos propuestos que fatiga en pacientes con cáncer, deterioro de la función mitocondrial es uno de los caminos más terapéutico targetable. Por lo ta...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de preparación de células mononucleares CPT	BD Biosciences	362761	Para aislar PBMC después de la flebotomía
RPMI-1640	Corning	10-040	Para la fabricación de medios de crecimiento para PBMCs
Suero fetal bovino (FBS)	Corning	35-010-CV	Para la fabricación de medios de crecimiento para PBMCs
Penicilina/Estreptomicina	ThermoFisher	15140122	Para la fabricación de medios de crecimiento para PBMCs
Cell-Tak	Corning	354240	Solución adhesiva para células y tejidos; permite que las células de suspensión se adhieran a la superficie
Caballito de mar XF Solución de calibrador	Agilent	103059-000	Para cartuchos hidratantes
XFp Fluxpak (miniplacas y cartuchos de sensores)	Agilent	103022-100	Contiene miniplacas de cultivo celular XFp y cartuchos de sensores
Medios base XF	Agilent	103335-100	Para la fabricación de medios de ensayo XF
Solución de D-(+)-glucosa de cultivo celular al 45%	Corning	25-037-CI	Para la fabricación de XF medios de ensayo
Solución de piruvato de sodio	Corning	25-000-CI	Para la fabricación de medios de ensayo XF
Solución de L-glutamina	ThermoFisher 25030081		Para la fabricación de medios de ensayo XF
Caballito de mar XFp Mito Kit de prueba de esfuerzo	Agilent	103010-100	Contiene oligomicina, FCCP, antimicina A/rotenona
CyQUANT Ensayo de proliferación celular directa	ThermoFisher	C35011	Para la cuantificación de células vivas y la normalización
de datosSeahorse XFp Analyzer	Agilent	S7802AEA	Para medir la función mitocondrial en células vivas
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (o cualquier instrumento que pueda cuantificar células fluorescentes en una placa)	BioTek	BTCYT5PV	Para la cuantificación de células vivas y la normalización de datos