Ratones expuestos a LPS intraperitoneales secretan exosomas en el líquido del lavado (BAL) Bronco-alveolar que se empaquetan con miRNAs. Utiliza un sistema de cocultivo, demostramos que los exosomas liberados en el líquido del BAL interrumpen la expresión de proteínas de Unión estrecha en células epiteliales bronquiales y aumentan la expresión de citoquinas pro-inflamatorias que acentúan la lesión pulmonar.
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Artículo de método
Lavado broncoalveolar exosomas en lesión pulmonar séptica inducida por lipopolisacárido
En este artículo
Resumen
Resumen
Lesión pulmonar aguda (ALI) y síndrome de dificultad respiratoria agudo (ARDS) representan un grupo heterogéneo de enfermedades pulmonares que sigue teniendo una alta morbilidad y mortalidad. La patogenia molecular de ALI está mejor definido; sin embargo, debido a la compleja naturaleza de la enfermedad terapias moleculares han desarrollado. Aquí utilizamos un modelo del ratón inducida por lipopolisacárido (LPS) de la lesión pulmonar aguda séptica para delinear el papel de los exosomas en la respuesta inflamatoria. Usando este modelo, hemos podido demostrar que ratones expuestos a LPS intraperitoneales secretan exosomas en el líquido del lavado (BAL) Bronco-alveolar de los pulmones que se empaquetan con miRNA y citoquinas que regulan la respuesta inflamatoria. Además utiliza un sistema de modelo de co-cultivo, mostramos que exosomas liberados de los macrófagos alteran la expresión de proteínas de Unión estrecha en células epiteliales bronquiales. Estos resultados sugieren que 1) diafonía entre células inmunes y estructurales innatas a través de la exosomal realizar trayectos contribuyen a la respuesta inflamatoria y alteración de la barrera estructural y 2) dirigidos a estos miRNAs puede proporcionar una nueva plataforma para tratar ALI y SDRA.
Introducción
LPA y el SDRA es las formas mortales de la insuficiencia respiratoria con hipoxemia severa causada por edema pulmonar no cardiogénico que afecta aproximadamente de 1 millón personas anualmente1. La etiología del SDRA incluye una lesión directa a los pulmones de las infecciones o aspiración y una variedad de insultos indirectos. En la última década ha habido una mayor comprensión de la patogenia molecular del SDRA, sin embargo, tratamientos específicos específicos para ARDS todavía ser desarrollado2,3.
Se han desarrollado varios modelos animales de lesión pulmonar aguda que proporcionan un puente para la traducción de terapias experimentales para los estudios en humanos4,5. Modelos comúnmente usados incluyen la instalación local de ácido oleico, bacterias, LPS y bleomicina. Otros métodos incluyen isquemia-reperfusión, punción cecal ligadura, lesión de estiramiento inducido por la ventilación mecánica, hiperoxia o la administración sistémica de bacterias y LPS5. Estos modelos proporcionan un sistema biológico útil para probar las hipótesis clínicas y para el desarrollo de terapias potenciales. Para simular el SDRA humano, modelos animales deben reproducir la inflamación y la lesión aguda a las células epiteliales y endoteliales con defectos en la función de barrera en los pulmones.
Exosomas son vesículas de membrana con 20 y 200 nm de diámetro, cuyo contenido molecular contiene proteínas, ADN, ARN y lípidos, y facilitan la comunicación inter celular en el microambiente del tejido mediante transferencia de composición molecular. Exosomas son secretadas por varios tipos de células, como células endoteliales, células epiteliales, las células musculares lisas y células del tumor y existen en el líquido de cuerpo humano. Estudios indican que los exosomas regulan entre las células inmunes y células del estroma durante enfermedades inflamatorias infecciosas y estériles, y su liberación anormal parece ser regulada por diversos estímulos naturales y experimentales durante fisiológico y procesos patológicos6. Dicha red de comunicación puede jugar un papel importante en la patogenesia de enfermedades pulmonares y puede afectar la progresión fisiopatológica7,8. 18-22 como nucleotide RNAs no codificantes, los miRNAs existen en tejidos y líquidos corporales, plasma, sueros y modulan la expresión del mRNA a poste-de translación nivel9,10.
Envasados miRNAs en exosomas influyen en la diferenciación y función de múltiples tipos de células, y niveles excesivos están asociados con una variedad de enfermedades, incluyendo cáncer, enfermedades pulmonares, obesidad, diabetes y enfermedad cardiovascular11, 12,13,14,15,16. Entrada en las células del receptoras y realizar trayectos de miRNAs de exosomal facilitar la comunicación intercelular modificando la hemostasia del microambiente17,18. Lesión pulmonar aguda es un procesos complejos, que involucran a múltiples tipos de células con extensas comunicaciones intercelulares a través de exosomas8. miR-155 y miR-146a comparten el mecanismo de regulación transcripcional común y contribuyan a la respuesta inflamatoria y la tolerancia inmunológica19,20. Estudios recientes indican que ambos modulan la respuesta inflamatoria mediante exosomal miRNAs realizar la transición entre las células inmunes21. Sin embargo, todavía no están claros los mecanismos moleculares subyacentes a efectos moduladores de miRNAs exosomal alveolar respuesta a endotoxinas, sin lugar a dudas el potencial relevancia clínica y traslacional implicación mérito más investigación.
Modelos de cocultivo se están empleando para definir la interacción de los tipos de células específicas en el entorno complejo, como inflamación y cáncer22,23. Estas plataformas proporcionan una estrategia alternativa para interrogar entre tipos celulares especialmente para las células inmunes y estructurales.
Intra-traqueal, administración aerosolizada, intraperitoneal o sistémica de LPS son ampliamente utilizados para inducir lesiones de pulmón experimental24,25,26y han demostrado para inducir la permeabilidad endotelial y epitelial defectos. Aquí utilizamos LPS intraperitoneales para inducir un modelo séptico de lesión pulmonar aguda en ratones. Dentro de las 24 h de la administración intraperitoneal de LPS, defectos de la permeabilidad son inducidos en los pulmones con el reclutamiento de células inflamatorias. Además, demostramos que los exosomas de BAL contienen miRNA-155 y miR-146a, y exosomas de líquido del BAL inducen la expresión de citoquinas proinflamatorias en células epiteliales receptores, incluyendo IL-6 y TNF-α. Estos datos son los primeros en Mostrar exosomal miRNAs son secretadas en BAL en este modelo de lesión pulmonar aguda séptica.
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Protocolo
El protocolo general requiere de 2 días, incluyendo el primer día de la inducción de la sepsis y el aislamiento del líquido del BAL de la animal y el segundo día para aislamiento de exosomas de ratón BALF. Todos los procedimientos han sido revisados y aprobado por el cuidado institucional de animales y uso centro médico VA de Atlanta.
1. modelo de lesión pulmonar aguda séptica ratón
- Use 6-8 semanas - viejo tipo C57BL/6J ratones machos (20-22 g de peso) para el animal modelo y realizar todos los procedimientos utilizando instrumentos y técnicas asépticas. Autoclave de todos los instrumentos quirúrgicos como pinzas y tijeras por 20 min a 121 ° C.
- Distribuir aleatoriamente ratones en experimental y grupo control. Refrenar los ratones en una mesa quirúrgica. Tratamiento de ratones con Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS, 15 mg/kg) por vía intraperitoneal. Según el peso del cuerpo individual, diluir dosis de LPS correspondientes a 0,1 mL de PBS por el ratón, luego inyectar solución de LPS, utilizando una jeringa de 1 mL con aguja 27 G e inyectar un volumen equivalente de PBS a los animales control.
- Mantener los ratones en las instalaciones BSL2 animal, que consiste en jaulas limpias a temperatura adecuada.
- 24 horas más tarde, eutanasia ratones con inhalación de CO2 .
- Seleccione el área quirúrgico en el centro del cuello del ratón. Hacer una pequeña incisión (5 mm aproximadamente) y separar suavemente los músculos para el acceso a la tráquea usando fórceps romos hasta que la tráquea quede expuesta.
- Retirar el líquido del BAL ratón con jeringa estéril de 10 mL con una aguja de 27 G. Primero, suavemente, inserte la aguja en la tráquea e inyectar lentamente 1 mL de PBS estéril en la tráquea, luego dibujar BALF en una jeringa desechable de 3 mL con una aguja de 27 G. Al finalizar el procedimiento, deseche las jeringas y agujas en el contenedor biológico.
- Tratar los instrumentos quirúrgicos con dióxido de cloro, como se describe anteriormente por Chauret et al. 27y luego esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos en autoclave durante 20 min a 121 ° C.
2. exosomas aislamiento-serie Ultra-centrifugación y caracterización
- Recoger el líquido del BAL ratón en tubos cónicos de 15 mL. Para cosechar las células alveolares, centrifugar las muestras durante 10 minutos a 1.000 g, a 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante a nuevos tubos cónicos de 15 mL y centrifugar las muestras durante 30 min a 4.000 x g a 4 ° C para eliminar restos celulares.
- Recoger el sobrenadante en tubos de ultracentrífuga y centrifugar las muestras durante 60 min a 10.000 x g a 4 ° C para eliminar las partículas más grandes de celulares.
- Transferir el sobrenadante a nuevos tubos cónicos y filtrar las muestras con jeringa-filtro de 0,2 μm para eliminar el remanente de las partículas más grandes.
- Recoger las muestras en tubos de ultracentrífuga y equilibrar los tubos. Centrifugar las muestras durante 2 h a 140.000 x g a 4° C para que sedimenten los exosomas.
Nota: El tamaño de exosomas varía de 20-200 nm. filtro de 0.2 μm se utiliza para quitar las partículas más grandes que son más de 200 nanómetro de tamaño. - Descartar el sobrenadante cuidadosamente. Disolver el precipitado con 100 μl PBS o solución de lisis y muestras de exosomas transferencia a tubos de 1,5 mL y guardar a-80 ° C hasta su uso.
Nota: Microscopio electrónico de transmisión se recomienda verificar exosomas aislado. - Siga la muestra TEM estándar protocolo28de procesamiento. Analizar muestras de exosomas utilizando microscopía electrónica de transmisión y tomar imágenes, escala bar 200 nm.
3. preparación de miRNA y escénicas miRNA-q-RT-PCR
Nota: miRNA-q-RT-PCR se recomienda analizar el nivel de expresión de miRNAs.
- Seguir protocolo de aislamiento estándar miRNAs y asegúrese de que utilizar una cantidad igual de RNAs purificados en la transcripción reversa del solo-filamento de24.
- Siga el protocolo estándar de PCR en tiempo real para detectar nivel de microARN exosomal en líquido del BAL. Uso de iniciadores específicos de PCR en tiempo real contra miR-155, miR-146a y SnRNA U6. Reacción de PCR con el aparato PCR cuantitativo y normalizar los valores de expresión para control interno U6 snRNA.
Nota: Cada grupo está formado por triplicado muestras24.
4. exosomas etiquetado y purificación
- Suspender exosomas sedimento con solución de suspensión de 100 μL en un tubo de polipropileno de 1.5 mL, luego agregar 0,4 μL de colorante de exosomas en el otro tubo con 100 μl de la solución de la suspensión.
- Rápidamente añadir exosomas en la solución a la solución de colorante y mezclar bien mediante pipeteo. Mantener las muestras durante 5 minutos a temperatura ambiente, proteger de la luz.
- Poner una columna de spin de exosomas en un tubo de 1,5 mL con elución. Transferir la mezcla de la solución para el centro de la columna de spin de exosomas.
- Girar la columna por 2 min a 800 x g a temperatura ambiente.
- Deseche el columna y almacenar las muestras eluídas a-20 ° C hasta su uso.
5. validación de exosomas de células receptores
- 1 x 104 12 MLE /cell en una diapositiva 8-pozo cámara y células en cultivo a 37 ° C, 5% CO2de la semilla.
- Añadir 10 μl marcado con fluorescente exosomas a las células. Incubar durante 1 h a 37 ° C.
- Quitar los medios de cultivo y lavar las células con PBS, luego fijar las células con paraformaldehído al 1% durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Monte la corredera en medio del Monte con DAPI.
- Analizar las muestras a través de un microscopio de fluorescencia y tomar imágenes, 40 aumentos.
6. verificación de la interacción entre células receptores y exosomas
- Semilla 2 x 105 MLE12/pozo de una placa de cultivo de 12 pozos conteniendo medio de cultivo apropiado y células en cultivo a 37 ° C, 5% CO2.
- Añadir 20 μg exosomas del líquido ratón BAL MLE12 células y configurar repeticiones por grupo experimental.
- 24 horas más tarde, lavar las células con PBS y añadir 600 μl de tampón de lisis en pozo. Homogeneizar la placa y recoger muestras de lisis en tubos de 1,5 mL con la pipeta.
- Seguir el protocolo de aislamiento de RNA total estándar y Protocolo de transcripción inversa de cDNA, completa la transcripción inversa single-strand cDNA del29.
- Siga el protocolo estándar de PCR en tiempo real para detectar el nivel de expresión de mRNA en células receptores29. Uso de iniciadores específicos de PCR en tiempo real contra el TNF-α, IL-6 y ZO-1. Reacciones de PCR con el aparato PCR cuantitativo y normalizar los valores de expresión para el control interno GAPDH.
Nota: Cada grupo está formado por las muestras por triplicado.
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Resultados
Para inducir lesión pulmonar séptico, los ratones fueron tratados con LPS intraperitoneales (15 mg/kg). Dentro de las 24 h de la administración de LPS, neutrophilic afluencia fue visto en los pulmones, como se muestra en la figura 1A. Líquido del BAL de ratón fue dibujado, seguido por el aislamiento y purificación de exosomas. Morfología de exosomas BALF fue confirmado por microscopia electrónica de transmisión (figura 1B).
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Discusión
Modelos murinos de enfermedades se utilizan comúnmente para evaluar la función fisiológica de genes específicos y reducir el costo de experimentación2. La lesión pulmonar aguda séptica descrita aquí imita la respuesta inflamatoria en los seres humanos con SDRA. Este modelo es pertinente para investigar la patogenesia molecular, desarrollo de biomarcadores y para probar terapias de nuevo potencial5.
Sistemas de co-cultivo son relevantes para los e...
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Divulgaciones
Este trabajo fue apoyado por VA mérito revisión 2I01BX001786-06A1 financiación a RS.
Agradecimientos
Los autores han declarado no hay conflicto de intereses.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| lipopolisacárido | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| kit de aislamiento de miARN mirVana | Thermo Fisher | 449774 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) imprimación | Thermo Fisher 4427975 | ||
| has-miR-146a (000468) cebador Thermo | Fisher | 4427975 | |
| U6snRNA cebador | Thermo Fisher | 4427975 | |
| TNF-α( Mm00443258_m1 ) imprimación | Thermo Fisher | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1 )imprimación | Thermo Fisher | 4331182 | |
| ZO-1 (Mm00493699_m1 )imprimación | Thermo Fisher | 4331182 | |
| medio esencial mínimo (MEM) | Thermo Fisher | 11095-072 | |
| Solución de trysin-EDTA (0,05%) | Thermo Fisher | 25300054 | |
| exosomas se marcaron con PKH67 a PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| (MW3000) | Ultracentrífuga Thermo Fisher | 4484449 | |
| Beckman Coulter Optima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Tubos de centrífuga ultratransparentes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Applied Biosystems 7500 Sistema de PCR rápido en tiempo real | Microscopios | ||
| (TEM) | JEOL Ltd | 120 kV TEM | |
| Microscopio Olympus BX41 | Olympus | BX41 |
Referencias
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