Ratones expuestos a LPS intraperitoneales secretan exosomas en el líquido del lavado (BAL) Bronco-alveolar que se empaquetan con miRNAs. Utiliza un sistema de cocultivo, demostramos que los exosomas liberados en el líquido del BAL interrumpen la expresión de proteínas de Unión estrecha en células epiteliales bronquiales y aumentan la expresión de citoquinas pro-inflamatorias que acentúan la lesión pulmonar.
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Artículo de método
Lavado broncoalveolar exosomas en lesión pulmonar séptica inducida por lipopolisacárido
En este artículo
Resumen
Resumen
Lesión pulmonar aguda (ALI) y síndrome de dificultad respiratoria agudo (ARDS) representan un grupo heterogéneo de enfermedades pulmonares que sigue teniendo una alta morbilidad y mortalidad. La patogenia molecular de ALI está mejor definido; sin embargo, debido a la compleja naturaleza de la enfermedad terapias moleculares han desarrollado. Aquí utilizamos un modelo del ratón inducida por lipopolisacárido (LPS) de la lesión pulmonar aguda séptica para delinear el papel de los exosomas en la respuesta inflamatoria. Usando este modelo, hemos podido demostrar que ratones expuestos a LPS intraperitoneales secretan exosomas en el líquido del lavado (BAL) Bronco-alveolar de los pulmones que se empaquetan con miRNA y citoquinas que regulan la respuesta inflamatoria. Además utiliza un sistema de modelo de co-cultivo, mostramos que exosomas liberados de los macrófagos alteran la expresión de proteínas de Unión estrecha en células epiteliales bronquiales. Estos resultados sugieren que 1) diafonía entre células inmunes y estructurales innatas a través de la exosomal realizar trayectos contribuyen a la respuesta inflamatoria y alteración de la barrera estructural y 2) dirigidos a estos miRNAs puede proporcionar una nueva plataforma para tratar ALI y SDRA.
Introducción
LPA y el SDRA es las formas mortales de la insuficiencia respiratoria con hipoxemia severa causada por edema pulmonar no cardiogénico que afecta aproximadamente de 1 millón personas anualmente1. La etiología del SDRA incluye una lesión directa a los pulmones de las infecciones o aspiración y una variedad de insultos indirectos. En la última década ha habido una mayor comprensión de la patogenia molecular del SDRA, sin embargo, tratamientos específicos específicos para ARDS todavía ser desarrollado2,3.
Se han desarrollado varios modelos animales de lesión pulm....
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Protocolo
El protocolo general requiere de 2 días, incluyendo el primer día de la inducción de la sepsis y el aislamiento del líquido del BAL de la animal y el segundo día para aislamiento de exosomas de ratón BALF. Todos los procedimientos han sido revisados y aprobado por el cuidado institucional de animales y uso centro médico VA de Atlanta.
1. modelo de lesión pulmonar aguda séptica ratón
- Use 6-8 semanas - viejo tipo C57BL/6J ratones machos (20-22 g de peso) para el animal modelo y realizar todos los procedimientos utilizando instrumentos y técnicas asépticas. Autoclave de todos los instrumentos quirúrgicos como pinzas y tijeras por 20 ....
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Resultados
Para inducir lesión pulmonar séptico, los ratones fueron tratados con LPS intraperitoneales (15 mg/kg). Dentro de las 24 h de la administración de LPS, neutrophilic afluencia fue visto en los pulmones, como se muestra en la figura 1A. Líquido del BAL de ratón fue dibujado, seguido por el aislamiento y purificación de exosomas. Morfología de exosomas BALF fue confirmado por microscopia electrónica de transmisión (figura 1B).
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Discusión
Modelos murinos de enfermedades se utilizan comúnmente para evaluar la función fisiológica de genes específicos y reducir el costo de experimentación2. La lesión pulmonar aguda séptica descrita aquí imita la respuesta inflamatoria en los seres humanos con SDRA. Este modelo es pertinente para investigar la patogenesia molecular, desarrollo de biomarcadores y para probar terapias de nuevo potencial5.
Sistemas de co-cultivo son relevantes para los e.......
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Divulgaciones
Este trabajo fue apoyado por VA mérito revisión 2I01BX001786-06A1 financiación a RS.
Agradecimientos
Los autores han declarado no hay conflicto de intereses.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| lipopolisacárido | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| kit de aislamiento de miARN mirVana | Thermo Fisher | 449774 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) imprimación | Thermo Fisher 4427975 | ||
| has-miR-146a (000468) cebador Thermo | Fisher | 4427975 | |
| U6snRNA cebador | Thermo Fisher | 4427975 | |
| TNF-α( Mm00443258_m1 ) imprimación | Thermo Fisher | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1 )imprimación | Thermo Fisher | 4331182 | |
| ZO-1 (Mm00493699_m1 )imprimación | Thermo Fisher | 4331182 | |
| medio esencial mínimo (MEM) | Thermo Fisher | 11095-072 | |
| Solución de trysin-EDTA (0,05%) | Thermo Fisher | 25300054 | |
| exosomas se marcaron con PKH67 a PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| (MW3000) | Ultracentrífuga Thermo Fisher | 4484449 | |
| Beckman Coulter Optima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Tubos de centrífuga ultratransparentes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Applied Biosystems 7500 Sistema de PCR rápido en tiempo real | Microscopios | ||
| (TEM) | JEOL Ltd | 120 kV TEM | |
| Microscopio Olympus BX41 | Olympus | BX41 |
Referencias
- Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. Epidemiology and outcomes of acute lung injury. Chest. 131, 554-562 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls.
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Reimpresiones y permisos
