Medición de los niveles de ejercicio de Drosophila melanogaster utilizando la rotación ejercicio cuantificación sistema (requisitos)

Resumen

La rotación del ejercicio cuantificación sistema (requisitos) pueden inducir ejercicio en Drosophila melanogaster a través de la rotación mientras que simultáneamente mide la cantidad de actividad de los animales. Aquí, presentamos un protocolo de punto por punto detallando cómo medir los niveles de actividad de los animales experimentan tratamientos ejercicio rotacional usando los REQS.

Resumen

Drosophila melanogaster es un nuevo organismo modelo para estudios en Biología del ejercicio. Hasta la fecha, dos sistemas de ejercicio principal, la torre de la energía y la rueda se han descrito. Sin embargo, ha faltado un método para medir la cantidad de actividad animal adicional inducida por el tratamiento de ejercicio. La rotación del ejercicio cuantificación sistema (requisitos) llenan esta necesidad, proporcionando una medida de la actividad animal animales experimentan rotación ejercicio. Este protocolo detalla cómo utilizar los requisitos para evaluar actividad animal durante el ejercicio de rotación e ilustra el tipo de datos que se pueden generar. Aquí, demostramos cómo los requisitos se utilizan para medir diferencias específicas por sexo y tensión en actividad de ejercicio inducido. Los requisitos pueden utilizarse también para evaluar el impacto de varios otros parámetros experimentales tales como edad, dieta o la población tamaño ejercicio inducida por actividad. Además, puede utilizarse para comparar la eficacia de protocolos de entrenamiento de ejercicio diferente. Lo importante, proporciona una oportunidad para estandarizar tratamientos ejercicio entre cepas, lo que permite al investigador alcanzar cantidades iguales de actividad entre los grupos si es necesario. Así, los requisitos es un nuevo recurso notable para los biólogos de ejercicio trabaja con el sistema de modelo de Drosophila y complementa los sistemas existentes de ejercicio.

Introducción

Recientemente, los investigadores han comenzado a usar la mosca de la fruta Drosophila melanogaster para estudiar la biología del ejercicio. D. melanogaster ha sido un sistema de modelo genético para más de 100 años^1,2. Sin embargo, investigaciones de Drosophila ha contribuido no sólo genética, sino también a una variedad de otras disciplinas como la neurobiología, biología del comportamiento y fisiología³. En 2009, la torre de la energía, la primera máquina de ejercicio para Drosophila fue descrito⁴. La torre de la energía aprovecha respuesta geotaxis negativa de los animales. Cuando perturbada, Drosophila tienden a moverse a la parte superior de su recinto. Esta respuesta está bien establecida y es la base del ensayo popular "RING" (Geotaxis negativa iterativo rápido⁵) que se utiliza para estimar la capacidad o aptitud física en Drosophila. La torre de la energía utiliza un brazo mecánico conectado a una unidad de motor para levantar repetidamente un conjunto de animales dentro de sus recintos por varias pulgadas y dejarlos volver a la tierra para inducir la respuesta de geotaxis negativa (Tinkerhess et al 2012⁶ proporcionar un video que ilustra el uso de la torre de la energía). Tratamiento prolongado en la torre de la energía por lo tanto aumenta la cantidad de actividad física (correr o volar) los animales realizan en comparación a animales de control no tratados y más tiempo lleva a mejorar el rendimiento en el ensayo de anillo para aptitud física⁴. Así, este trabajo demostró la factibilidad del uso de Drosophila como modelo para la biología del ejercicio.

Para ampliar el repertorio de herramientas disponibles para la investigación del ejercicio de Drosophila, en 2016, Mendez y sus colegas describen una segunda máquina de ejercicio de Drosophila, la rueda⁷. Similar a la torre de la energía, la rueda explota la respuesta geotaxis negativa de Drosophila. Sin embargo, esta respuesta es inducida por la rotación continua de los recintos de animales, en lugar de levantar y caer como en la torre de la energía. Este método de inducción es más suave y permite un régimen de ejercicio orientado más resistencia que evita cualquier trauma físico que pudiera ocurrir durante el ejercicio en la torre de la energía (véase Katzenberger, R. J. et al. 2013⁸ impacto de repetido físico trauma en la salud de Drosophila). Similar a la torre de la energía⁴, tratamiento de animales en la rueda de ejercicio conduce a una variedad de respuestas fisiológicas, incluyendo cambios en la aptitud física, los niveles de triglicéridos y cuerpo peso⁷. Así, dos métodos complementarios están disponibles para los biólogos de Drosophila estudio de ejercicio.

Una limitación de la torre y la rueda es la incapacidad para medir la cantidad de actividad inducida por el tratamiento de ejercicio. Análisis de grabaciones de video de la rueda demostró que había diferencias significativas entre las diferentes cepas de Drosophila en cómo responden al ejercicio tratamiento⁷. Concretamente, las cepas estudiaron diferenciaron en cuánto más actividad los animales cuando estimulado⁷. Esta observación nos llevó a desarrollar un tercer sistema de ejercicio, la rotación ejercicio cuantificación sistema (requisitos), que nos permite medir los niveles de actividad del animal durante el ejercicio inducido por la rotación⁹. Los requisitos utiliza una actividad comercialmente disponible de unidad que está instalado en un brazo giratorio para estimular el ejercicio a través de la rotación en la rueda de control. Trabajo inicial con los requisitos que confirma genéticamente diferentes cepas de Drosophila y sexos - pueden significativamente diferentes respuestas a la estimulación rotatoria y por lo tanto la cantidad de ejercicio inducida no es idéntica entre diferentes genotipos⁹ . Por lo tanto, los requisitos ahora permite a biólogos de Drosophila medir la cantidad de ejercicio inducido por el tratamiento, abriendo una variedad de nuevas vías de investigación en el campo de ejercicio.

Aquí describimos en detalle cómo utilizar los requisitos para la cuantificación del ejercicio rotatorio. Los requisitos induce rotación ejercicio y simultáneamente mide los niveles de actividad de los animales tratados. Los requisitos sean capaz de adaptarse a una variedad de programas de ejercicios, que van desde la simple 2 h régimen de ejercicio continuo demostrado aquí a métodos más complejos de entrenamiento de intervalo descrito por Méndez y colegas⁷y estimulación se puede ajustar mediante velocidad de rotación (entre aproximadamente 1 13 rotaciones por minuto). Dependiendo de la unidad del monitor de actividad utilizada para producir los requisitos, este método es adaptable para el análisis de las moscas individuales o grandes poblaciones de animales. Debido a esta versatilidad, los requisitos ofrece a los investigadores de Drosophila con una variedad de oportunidades para estudiar, por ejemplo, regímenes de ejercicio diferente, las intervenciones de la dieta o impacto de la densidad de población.

Protocolo

Los requisitos consiste en una unidad de Monitor de actividad de Drosophila (para obtener información de la fuente, véase Tabla de materiales) montado sobre un brazo giratorio que está controlado por una unidad motora (figura 1). El monitor de actividad determina la frecuencia en un lapso de tiempo determinado se perturba la matriz de rayos láser el centro del tubo de ensayo de disección. Para dibujos detallados y una caracterización detallada, consulte nuestra anterior publicación⁹. Mientras que nuestro sistema utiliza la unidad de LAM25H, los requisitos pueden ser modificado para dar cabida a otras unidades de Drosophila Activity Monitor también.

1. la configuración de los requisitos de la prueba

1. Prueba de carga vuele en tubos de muestra de vidrio de anestesiar los animales con CO₂ u otro método elegido para la manipulación, movimiento en los tubos de vacíos y tapado los tubos.
2. Inserte tubos de muestra de vidrio tapado en las ranuras de la unidad de monitor de actividad. Fije los tubos de goma O-rings (17-18 gauge) o bandas de goma en ambos lados de la unidad para asegurar los tubos no se mueven durante la rotación:
   1. Deslice una junta tórica sobre el tubo de muestra y colocar el anillo en o cerca de la mitad del tubo. Inserte el tubo de muestra en una ranura del monitor de actividad de la parte delantera y céntrela.
   2. Mueva la Junta según sea necesario y asegúrese de que una vez que el tubo de la muestra se centra, el anillo se deslice tan cerca de la unidad del monitor de actividad como sea posible. Fijar el tubo de espécimen deslizando una segunda junta tórica sobre el tubo de vidrio de la parte posterior, otra vez en movimiento la junta tórica como cerca de la unidad de monitor de actividad como sea posible.
3. Iniciar la rotación de los REQS poniendo el interruptor en la parte delantera de la unidad. Ajustar la velocidad de rotación con el dial en la parte frontal de la unidad a la velocidad deseada (4 rpm (rotaciones por minuto) en este ejemplo).
   Nota: La velocidad de giro en este ejemplo fue elegida para que coincida con un estudio previamente publicado⁷. Diferentes velocidades de rotación resultará en niveles de actividad diferentes de animales, cuando se inicia un nuevo estudio, optimización de velocidad de rotación para el montaje experimental específico (genotipo, duración de ejercicio pelea, etcetera.) puede ser necesario.
   Nota: Es importante asegurarse de que los tubos estén colocados correctamente para que no arrastre a lo largo de la parte inferior de la unidad de requisitos durante la rotación.
4. Pruebe la conexión para el sistema de recolección de datos proporcionado con la unidad del Monitor de actividad de Drosophila abriendo el software de DAMSystem308 y asegurar que la luz de conexión sigue siendo verde varias rotaciones. El software comenzará a grabar datos en un archivo de texto "monitorX" (X es el número de unidad si varios monitores están en uso) inmediatamente sobre la iniciación. Frecuencia de grabación se puede ajustar en la pestaña 'Preferencias'; normalmente grabamos en intervalos de 5 minutos.
5. Investigar el archivo de texto generado por el software de DAMSystem308 para asegurar que la conexión de datos está funcionando correctamente. Problemas con la conexión resultan en recortes, momentos donde se registra actividad 0 para todas las posiciones en los requisitos (véase Resultados de representante y tabla 2). Si se producen recortes, ajustar las conexiones de datos a la toma de teléfono giratorio, como durante la rotación, esta conexión puede ser suelto o trenzado. Encontramos que estabiliza la conexión con cinta ayuda a prevenir este problema.

2. preparación de los animales

Nota: Todos los animales fueron planteados y probados bajo condiciones estándar en una incubadora (25 ° C, 60-70% de humedad, ciclo de 12 h luz/oscuridad) en melaza/harina de maíz media¹⁰.

1. Dos semanas antes del experimento planeado, establecer frascos con densidad controlada de animales para recoger las moscas experimentales por lo general hemos creado frascos con 7 machos y 10 hembras. Con una población sana, de un solo frasco, se pueden recoger sobre un período de 4 días aproximadamente 15 Virgen machos y 15 hembras. Ajustar el número de viales creado basado en el número de animales necesarios para el análisis; un típico análisis en nuestro laboratorio incluye 10 conjuntos de 10 Virgen machos y hembras por genotipo (100 varones y 100 mujeres).
   Nota: No Virgen moscas pueden utilizarse dependiendo de la pregunta experimental concreta. Si la realización de experimentos a largo plazo con animales no Virgen, larvas reptantes pueden interferir con monitoreo de la actividad precisa.
2. Eliminar las moscas de los padres una semana después de la creación de los viales.
3. A partir del día 10 después de la creación de los viales, recoger moscas vírgenes de los frascos y guardarlos separados por sexo.
4. Recoge suficientes animales para el experimento y la edad como sea necesario, 3 días en este ejemplo.
   Nota: Típicamente anestesiar los animales con CO₂ para la manipulación. CO₂ se sabe que afectan los niveles de actividad del animal durante largos períodos de tiempo después del tratamiento (por ejemplo, véase Bartolomé et al 2015¹¹). Si el CO₂ efecto interfiere con ensayos posteriores previstos o análisis, utilice un método de anestesia diferentes como anestesia de hielo.

3. recopilación con los requisitos

1. Anestesiar los animales para el estudio de cuantificación del ejercicio con CO₂ o cualquier otro método de anestesia. Divídalos en grupos según sea necesario y los grupos de animales de carga en los tubos de vacío vidrio del monitor de actividad; en este ejemplo, 10 animales de la misma edad se cargan por el tubo de vidrio, con 10 repeticiones para cada tipo de animal (sexo/genotipo). Asegúrese de que tenga en cuenta que tipo de animal se carga en cada tubo.
   Nota: Para más experimentos, alimentos pueden incluirse en los tubos de muestra. En este caso, es esencial que el alimento es seguro y no desplazarse durante la rotación.
2. Cargar los tubos de ensayo de vidrio en la unidad de requisitos y fijar con la goma O-rings. Si trabaja con más de un sexo/genotipo, utilizando un diseño de bloques al azar o aleatorización de la posición de los animales en los requisitos se eliminará cualquier efecto potencial de posición. La aleatorización se logra asignando cada frasco un número aleatorio, por ejemplo de un web basado en generador de números aleatorios (por ejemplo, https://www.randomizer.org/) o en una hoja de cálculo, y luego ordenar los frascos en función del número al azar.
3. Coloque los requisitos en la incubadora para temperatura constante, la humedad y la luz de las condiciones. Asegurar que los datos y poder cables están correctamente conectados.
4. Permitir a los animales para recuperarse de la anestesia y para aclimatarse al nuevo ambiente durante 1 hora.
5. Comenzar el experimento mediante el inicio de rotación de los requisitos a la velocidad deseada.
   Nota: Otra opción es primero recoger datos de actividad basal de los animales antes del inicio de la rotación, siguió registrando los niveles de actividad en respuesta a la estimulación rotatoria.
6. Iniciar la recolección de datos abriendo el software de DAMsystem308 (simplemente la recogida de datos de software inicia la abertura). Los datos se escriben en un archivo de texto en el intervalo (aquí, 5 min); Si es necesario, cambie la configuración de intervalo en la pestaña "Preferencias" (ver paso 1.4).
7. Para asegurar que los datos se transmiten con éxito a la computadora, abra el archivo de texto generado por el software de DAMsystem308 después de uno o dos intervalos de tiempo transcurrieron y confirman que se están escribiendo datos en el archivo. Cierre y vuelva a abrir este archivo para ver los datos de los puntos del tiempo adicional. Recopilar datos para la cantidad deseada de tiempo; en este ejemplo, 2 h.
   Nota: No abra la incubadora durante el período de ensayo, los animales son muy sensibles a cualquier alteración y es probable que responda con una mayor actividad.
8. Al final de la prueba de ejercicio, terminar la colección de datos cerrando el software DAMsystem308 y, a continuación, apague los REQS. Retire los tubos de ensayo de vidrio de los animales y limpiar los tubos. Los animales se pueden mover hacia atrás en los frascos de alimentos si son necesarias medidas a diferentes edades.
   Nota: Si las muertes se producen durante el régimen de ejercicio, se deben registrarse, como la presencia de moscas muertas puede afectar cuentas de actividad. En nuestra experiencia con el DGRP2 las líneas de mosca^12,13, ejercicio a 4 rpm 2 h no se produjo ninguna muerte, pero las cepas más débiles podrían responder diferentemente.

4. Análisis de datos

1. Abra el archivo .txt con la etiqueta "Supervisor1" producido por el software de DAMSystem308.
2. Examine el archivo de datos para cualquier problema que pueda haber ocurrido durante la adquisición de datos (puntos de perdida de tiempo, etc.; Tabla 1). Si es necesario, censurar el archivo quitando los puntos de datos al principio y al final de la grabación.
3. Utilizando el software estadístico de su elección (p. ej., R), analizar los datos recogidos. Generar estadísticas descriptivas y realizar análisis de varianza (ANOVA) para investigar efectos como sexo y genotipo, si los datos se distribuyen normalmente. Si los datos no se distribuyen normalmente, utilizar métodos no paramétricos, como las pruebas de Kruskal-Wallis, para comparar grupos. El análisis específicos requeridos dependerá de la pregunta científica específica y el diseño experimental.

Resultados

El resultado de una gestión individual con los requisitos es una tabla de datos producida por el software DAMSystem308, que será marcado "Monitor1.txt" por defecto (por un ejemplo suplementario 1 de archivo). Un fragmento de dicha tabla se muestra en la tabla 1. Cada columna contiene los datos de un tubo de ensayo individuales, mientras que las filas contienen la actividad medida en cada intervalo de tiempo desde el inicio del experimento (parte superior)...

Discusión

Como lo ilustran los resultados representativos, los requisitos es capaz de medir con precisión la actividad de ejercicio de Drosophila. Los requisitos es flexible y permite a los investigadores abordar una variedad de preguntas de investigación relacionadas con las intervenciones de ejercicio o ejercicio biología. Hay dos pasos críticos en el protocolo para resaltar. En primer lugar, es esencial para probar la configuración de los requisitos para garantizar que la transmisión de datos de los requisitos para la DAMSystem...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Monitor de actividad de Drosophila	Trikinetics	LAM25H	REQS
componente Cable telefónico Desenredante	Uvital	uv20170719	REQS componente Cierres de viales
(flugs)	Genesee Scientific	49-102	Drosophila cultivo
suministros Viales	Genesee Scientific	32-120 Suministros de	cultivo de Drosophila
Malla de cultivo de Drosophila	Carolina Biological Supply	173090	Suministros de cultivo de Drosophila
Harina de maíz	Pepsico	43375	Medios de Drosophila
Melaza	Barril Dorado	BLA-GAL Medios de	Drosophila
Agar	Apex Bioresearch	66-103 Medios de	Drosophila
Levadura seca inactiva	Genesee Scientific	62-106	Drosophila media
Tegosept	Apex Bioresearch	20-258	Drosophila media
Ácido propiónico	Genesee Scientific	20-271	Drosophila media