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Métodos para el estudio de la regeneración en Stentor

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DOI:

10.3791/57759

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13 de junio de 2018

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1Department of Biochemistry and Biophysics, University of California San Francisco

En este artículo

Resumen

El ciliado gigante, Stentor coeruleus, es un excelente sistema para estudiar la regeneración y cicatrización de heridas. Presentamos los procedimientos para establecer Stentor cultivos celulares de las células o fragmentos celulares, inducir la regeneración de las células de corte, químicamente inducir la regeneración de la banda membranellar y aparato bucal, proyección de imagen y análisis de células regeneración.

Resumen

Las células deben ser capaces de regenerar sus partes para recuperarse de perturbaciones externas. El unicelular ciliado Stentor coeruleus es un organismo modelo excelente para el estudio de la cicatrización y regeneración de la célula siguiente. El genoma de Stentor se convirtió recientemente, junto con métodos de biología molecular moderna, como RNAi. Estas herramientas hacen posible estudiar sola célula regeneración a nivel molecular. La primera sección del protocolo cubre Stentor establecer los cultivos celulares de las células o fragmentos celulares, junto con las directrices generales para mantener culturas de Stentor . Cultivo de Stentor en grandes cantidades permite el uso de herramientas valiosas como bioquímica, secuenciación y espectrometría de masas. Las secciones subsiguientes del protocolo cubren distintos métodos para inducir regeneración en Stentor. Cortar manualmente las células con una aguja de vidrio permite estudiar la regeneración de partes grandes de la célula, mientras que el tratamiento de células con sacarosa o urea permite estudiar la regeneración de estructuras específicas, situada en el extremo anterior de la célula. Se proporciona un método para proyección de imagen las células regeneración individuales, junto con una rúbrica de escenificando y analizar la dinámica de la regeneración. Todo el proceso de regeneración se divide en tres etapas. Al visualizar la dinámica de la progresión de una población de células a través de las etapas, se demuestra la heterogeneidad en el momento de la regeneración.

Introducción

Las células no son simples bolsas de enzimas, pero algo muy complejas máquinas cuyos componentes son cuidadosamente escala con el tamaño correcto y dispuestos en posiciones bien definidas. La morfogénesis de las células individuales representa un proceso clave en biología celular y del desarrollo, pero su mecanismo molecular es desconocido1,2. Mientras que algunas células cultivadas se asemejan a manchas, organismos unicelulares pueden han extremadamente complicado arquitecturas, ejemplificadas por los complejos patrones corticales en ciliados3,4.

Quizás el ejemplo más extremo de una célula altamente estructurado es Stentor coeruleus, un gigante heterotrichous ciliados distantemente relacionados con Tetrahymena y Paramecium. Stentor es 1 mm de largo y está cubierta con más de 100 bandas longitudinales de pigmento azul que se alternan con hileras de cilios organizados por paralelo pilas de cintas de microtúbulos que la longitud de toda la célula. La célula es trompeta en forma (figura 1), con una banda de membranellar y un aparato bucal (OA) en su extremo anterior y un holdfast que une la célula al sustrato en su extremo posterior. Además de la polaridad antero-posterior claro, la célula también muestra un patrón distintivo quiral, que espaciamiento entre hileras ciliares gradualmente aumenta en sentido horario. Esto se traduce en una discontinuidad donde la fila más estrecha se encuentra con la fila más amplia y en esta región de la superficie de la célula, conocido como el lugar geométrico del contraste de la raya, puede inducir la formación de la segunda serie de estructuras de extremo anterior cuando injertado en otro celular5, lo que es formalmente equivalente a organizador de Spemann. Por lo tanto, todos los procesos claves de la biología del desarrollo tienen sus análogos en Stentor: axiation, formación de patrones e inducción. En un embrión, estos procesos son conducidos por las diferencias de destino entre las diferentes células, pero en Stentor, debe ser conducidos por las diferencias de destino entre las diferentes regiones dentro de una sola célula. Lo que define las diferencias entre las regiones dentro de Stentor es un misterio.

Si cualquier parte de Stentor es cortado, la pieza que faltaba de la célula puede regenerar para producir una célula normal en cuestión de horas. Si una célula es cortar por la mitad, o incluso en piezas mucho más pequeñas, cada pieza se reorganiza en una célula de aspecto normal pero más pequeña y restaura la proporcionalidad adecuada entre partes de la célula6,7. Pequeñísimos fragmentos, 1/64th el tamaño de la célula original, son capaces de regenerarse en una celda pequeña pero normalmente proporcionada y luego crece al tamaño completo6. Stentor presenta así una oportunidad única para estudiar los mecanismos de organelo tamaño escalado y celular regulación del crecimiento mediante métodos quirúrgicos que se aplican generalmente a nivel de tejidos u organismos enteros.

Una de las propiedades de Stentor que le permite regenerarse de una amplia gama de intervenciones quirúrgicas es que contiene un macronucleus noduladas sola (figura 1) con unos 50.000 copias del genoma entero8. Como un fragmento de la célula contiene al menos un nodo macronuclear, tiene la capacidad de regenerar completamente. Otra propiedad subyace la capacidad de regeneración de Stentores su prodigiosa capacidad de cicatrización de heridas. Aunque muchos tipos de células son capaces de curar sus heridas9, Stentor es capaz de recuperarse de una extraordinaria gama de perturbaciones físicas. Un ejemplo de recuperación de Stentor de una perturbación drástica, junto con los métodos para la visualización de flujo citoplásmico en Stentor10 fueron divulgados previamente. Estos métodos permiten el estudio de cómo hería y subsecuente regeneración afectan el estado físico del citoplasma.

Stentorde gran tamaño, capacidad de regeneración extraordinaria y el hecho que se manifiesta en muchos de los fenómenos del desarrollo en embriones multicelulares (como los organizadores, axiation y patrones) atrajeron a muchos biólogos del desarrollo durante la vuelta del siglo pasado, incluyendo Caza Morgan de Thomas7. Durante los años 50 y años 60, enfoques microquirúrgicos demostraron una variedad sorprendente de procesos regenerativos y morfogenéticos en este solo-celled organismo11. Sin embargo, Stentor ha sido desarrollado como un sistema modelo de biología molecular sólo recientemente. Durante los últimos años, el genoma de Stentor fue secuenciado y ensamblado8, y el método para perturbar la expresión génica mediante la alimentación de RNAi fue desarrollado12.

Una de las razones que Stentor fue convertido en un organismo modelo para la biología molecular moderna sólo recientemente fue la dificultad de crecimiento grandes culturas debido a su largo ciclo celular (3 a 5 días). Sin embargo, los métodos genómicos y proteómicos modernos requieren menos material que utilizaron a, y el volumen de una sola célula de Stentor es suficiente para estos métodos, incluso sin recurrir a métodos ultrasensibles que se desarrollaron para el análisis de solo células que son mucho más pequeñas que Stentor. Sección 1 del protocolo detalla el procedimiento para el establecimiento de una cultura grande de una sola célula de Stentor . El mismo enfoque puede utilizarse para establecer una cultura grande de un fragmento de células obtenida por corte de una célula. Sección 1 también proporciona las directrices para mantener cultivos sanos de Stentor durante largos períodos de tiempo. Sección 2 del protocolo proporciona la metodología para inducir la regeneración de la célula por las células de corte manualmente con una aguja de vidrio. Artículo 3 del Protocolo se dedica a dos métodos de inducir la regeneración de estructuras celulares específicas (membranellar banda y oral aparato): tratamiento de las células con sacarosa o urea conduce al vertimiento de estas estructuras, seguidas por su regeneración. Artículo 4 del protocolo detalla un método para la proyección de imagen de células regeneradoras durante largos períodos de tiempo. Sección 4 termina con la descripción de las etapas de la regeneración y sugerencias sobre el análisis de la dinámica de la regeneración.

Protocolo

1. cultivo de Stentor y establecer culturas de Stentor de las células o fragmentos celulares

  1. Preparación de Chlamydomonas reinhardtii cultura para ser utilizado como alimento de Stentor.
    1. Obtener células de Chlamydomonas reinhardtii de un proveedor comercial (Tabla de materiales).
    2. Establecer un cultivo líquido de 500 mL de Chlamydomonas reinhardtii en comercialmente disponibles medios de grifo usando una técnica estéril13.
    3. Mantener la cultura de Chlamydomonas bajo una lámpara en una concentración cerca de saturación (en el diámetro exterior de cerca de 1) por dilución con los medios de corriente dos veces a la semana.
      Nota: La cultura de Chlamydomonas se puede cultivar en una coctelera Boston.
    4. Compruebe regularmente si la cultura de Chlamydomonas es sana colocar una gota de cultivo en un portaobjetos, cubrirla con un cubreobjetos y comprobar bajo un microscopio a 40 aumentos.
      Nota: No utilice la cultura para Stentor de alimentación si está contaminado con bacterias o células de Chlamydomonas se agregan en racimos. Si ocurre cualquiera de estos problemas, inicie una nueva cultura de Chlamydomonas .
  2. Obtener Stentor coeruleus las células de un proveedor comercial (Tabla de materiales).
  3. Si las células Stentor se necesitan de su hábitat natural, recoger de un estanque, lago o río11.
    1. Para recoger Stentor de un estanque, lago o río, encontrar una zona con cierta vegetación donde el agua es relativamente tranquilo, sombrío y claro.
      Nota: Hay una mayor probabilidad de encontrar Stentor en los lugares donde crece la lenteja de agua.
    2. Recoger al menos 2 L de agua en un recipiente fácil de verter de.
    3. Después de detritos y partículas han colocado en la parte inferior del envase, suavemente llenar unos contenedores más pequeños para examinar de Stentor, esperando unos segundos después de cada colección de detritus en el recipiente grande.
    4. Una vez completada la recogida de muestras en un lugar, moverse a una ubicación nueva que por lo menos 10 metros de distancia y repetir la recolección de muestras se.
      Nota: No cada estanque tiene una población de Stentor , para que estanques múltiples pueden tener que ser muestreado.
    5. Volver con las muestras en el laboratorio y transferir el agua de los contenedores en los platos de Petri.
    6. En cada placa de Petri, buscar Stentor bajo un estereomicroscopio con luz oblicua con 5 aumentos. La transferencia de células individuales de Stentor con una pipeta de 1 mL en un pozo de una placa de puntos de cristal que contengan al menos 100 μl de agua pasteurizada disponible comercialmente (PSW).
      Nota: Stentor células tienen forma de trompeta cuando se unen a un sustrato (figura 1). Natación Stentor células están menos extendidas que las células atadas sustrato (Video 1).
    7. Lavar Stentor en PSW por lo menos 3 x. Realizar los lavados mediante la eliminación de cerca del 90% del agua del pozo, manteniendo las células Stentor en el pozo, seguido por agregar 500 μl de PSW en el pozo.
      Nota: Antes de manipular el Stentor utilizando pipetas con puntas de pipeta de 10 μl o más pequeños, cortar unos 0,5 mm del extremo de la punta de la pipeta con unas tijeras para evitar herir las células debido a fuerzas de cizalla que se generan como un grande de la célula atraviesa demasiado pequeño de un op de punta ening.
  4. Chlamydomonas se preparan antes de cada alimentación de Stentor.
    1. Transferir 1 mL de Chlamydomonas cultura preparada como en el paso 1.1 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugue a 2.095 x g durante 3 minutos.
    2. Quite el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 1 mL de PSW. Centrifugue a 2.095 x g durante 3 minutos Retire el sobrenadante y resuspender el precipitado en 500 μl de PSW.
      Nota: Por lo tanto, lavado y concentrado Chlamydomonas se referirá como «preparados Chlamydomonas» en los siguientes pasos. Grifo para los medios de comunicación son perjudicial para Stentor, así lavado Chlamydomonas antes de Stentor la alimentación es importante.
  5. Si es necesario un cultivo clonal de Stentor , la cultura a partir de una célula individual de Stentor o un fragmento de la célula.
    1. Puesto que las células Stentor no crecen bien en PSW, preparar media condicionada por filtro de esterilización 500 μl de medios de comunicación de una cultura de Stentor existente, saludable.
    2. Transferir 500 μl de medio condicionado a uno de los pozos de una placa de cristal de punto.
    3. Transferencia de un Stentor en el pozo de la placa punto de vidrio que contienen los medios condicionados. Utilizar como medio poco como sea posible para hacer la transferencia.
    4. Alimentar cada Stentor 5 μl de preparados Chlamydomonas cada 48 h. Cuando se dividen Stentor , contar el número de células en el pozo y añadir 5 μl de preparados Chlamydomonas por la célula.
    5. Mantenga Stentor en un lugar sombreado ya que las células son sensibles a la luz (por ejemplo, en cajas de plástico cubierto con toallas de papel).
    6. Cambio medio de Stentor en el pozo con medio fresco acondicionado cada 96 h.
      1. Preparar medios acondicionados frescos como en el paso 1.5.1.
      2. Hacer todas las células de Stentor separar desde el fondo del pozo, pipeteando suavemente el líquido hacia arriba y hacia abajo en el pozo.
      3. Aspirar cuidadosamente el líquido desde el pocillo con una pipeta de 1 mL, asegurándose de que todas las células quedan en el pozo. Agregar 500 μl de fresca media condicionada al pozo.
    7. Cuando el número de células en el pozo excede 20, hacia las células de un envase más grande, por ejemplo, un tarro de cristal de boca ancha.
      1. Añadir 20 mL de PSW en un tarro de cristal de boca ancha esterilizado.
        Nota: Autoclave de cristalería para Stentor puede ser sustituido con cuidadoso lavado y enjuague.
      2. Pipetee cuidadosamente los medios de comunicación hacia arriba y hacia abajo en el pozo para separar todas las células de la parte inferior del pozo. Recoge todas las células de Stentor utilizando una pipeta de 1 mL y transferirlas suavemente a la jarra de vidrio.
    8. No apriete las tapas de los frascos con las culturas de Stentor , para permitir el acceso suficiente al aire.
    9. Añadir PSW a la jarra cada 48 h para mantener la densidad de Stentor en alrededor de 20 células/mL. Estimar la densidad de las células por el ojo.
      Nota: Alternativamente, utilice una pipeta de 1 mL al aire de la burbuja en la jarra para hacer células despegar de las paredes, pipeta de 1 mL de la cultura y cuente el número de células en la punta de la pipeta.
    10. Cada 48 h, alimento preparado Chlamydomonas a culturas de Stentor en frascos (véase el paso 1.4). Comenzar con la alimentación de la cultura con 200 μL de preparados Chlamydomonas. A medida que aumenta el volumen de la cultura, poco a poco aumentar la cantidad de preparado Chlamydomonas utilizado para alimentar a 1 mL.
    11. Cuando el volumen de cultivo alcanza cerca del 90% de la capacidad de la jarra, transferencia de la cultura a un contenedor más grande.
      1. Pipetear la cultura dentro de la jarra, arriba y abajo, con una pipeta de 1 mL para separar Stentor del vidrio.
      2. Vierta todo el contenido de la jarra en un recipiente 2 tazas de vidrio.
      3. Enjuague el vaso con unos 25 mL de PSW en el recipiente 2 tazas de vidrio para recoger el resto Stentor.
  6. Mantener culturas saludables en envases de vidrio de 2 tazas.
    1. Stentor culturas 2 mL de preparado Chlamydomonas por 100 mL de la cultura de la alimentación cada 4-5 días. Añadir PSW para el envase de cristal cada 4-5 días para mantener la densidad de Stentor en alrededor de 20 células/mL.
      Nota: 450 mL es el volumen máximo que tiene un envase 2 tazas.
    2. Una vez por semana, inspeccione las culturas bajo un 5 X microscopio para rotíferos, hongos y otro crecimiento de disección. Para prolongar la salud de la cultura, eliminar microorganismos contaminantes junto con las células Stentor anormalmente formadas e incoloras con una pipeta de 1 mL.
    3. Cuando el envase de cristal es 90% completo, partido de la cultura.
      1. Añadir 25 mL de PSW para el envase de cristal. Utilizar una pipeta para pipeta de 25 mL hacia arriba y hacia abajo para soltar Stentor del vidrio. Movimiento alrededor del 50% de la cultura en un nuevo envase de vidrio de 2 tazas.
      2. Añadir 25 mL de PSW a ambas culturas y seguir manteniendo las dos culturas como se describe en esta sección del protocolo.
        Nota: Puesto que Stentor células son sensibles a la temperatura alta, mantener la temperatura igual o inferior a 25 ° C en la sala donde se guardan las culturas. Por otra parte, las culturas pueden ser guardadas en una incubadora. Consulte la tabla 1 para solución de problemas de cultivo de Stentor .

2. inducir la regeneración de las células de Stentor de corte

  1. Utilizar un extractor de agujas para hacer varias agujas de tubos capilares utilizando el programa como sigue: calor - 735, pull - 100, velocidad - tiempo, 110 - 150, presión - 400.
  2. Preparar una solución de metilcelulosa al 4% en 50 mL de PSW.
    1. Añadir 1 g de metilcelulosa (viscosidad: 1500 cP) a 50 mL de PSW.
    2. Incubar a 4 ° C durante al menos 8 h facilitar la disolución de la pastilla.
    3. Mantener la solución de metilcelulosa al 4% a temperatura ambiente.
  3. Preparar una placa de cristal de punto para guardar los fragmentos de la célula después de realizar los cortes.
    1. Filtro de esterilizar los medios de comunicación de una cultura saludable, 500 mL por placa punto de cristal bien necesaria.
    2. Transferencia de medios estériles en cada uno de los pocillos necesitados 500 mL.
  4. Recoger una saludable Stentor (tiene una forma definida de la trompeta, vibrante color azul verdoso y sin vacuolas grandes) en una gota de 2 μl y colóquela sobre un cubreobjetos o diapositiva. Añadir 2 μl de metilcelulosa al 4% (figura 2). Que Stentor despacio antes de cortar (Video 2).
  5. Sujete la aguja de vidrio como paralelo a la superficie de corte como sea posible para evitar romper la aguja.
  6. Usando un estéreo microscopio de disección, localizar la punta de la aguja de vidrio y más cercano a la célula (Figura 3A). Observar el contrato de Stentor al entrar en contacto con la aguja (figura 3B y C).
    Nota: Si la celda está en una orientación que permite separar el extremo anterior de la extremidad posterior difícil, gírelo suavemente con el lado de la aguja.
  7. Presione suavemente en el contratado Stentor con el lado de la aguja de vidrio para cortar en dos la celda (figura 3D y E Video 3). Mover los dos fragmentos separados que no haya ninguna conexión citoplasmática entre ellos, para evitar la fusión del fragmento (figura 3F).
  8. Comprobar si ambos fragmentos tienen al menos un nodo macronuclear examinando los fragmentos con un microscopio de disección con iluminación oblicua.
    Nota: Tener al menos un nodo macronuclear es esencial para la supervivencia de la célula. La célula puede arrojar su película (capa transparente) junto con el pigmento azul verdoso durante o después del corte. En la mayoría de los casos, esto no afectará la viabilidad a largo plazo de la célula.
  9. Mover los fragmentos en los pocillos de una placa de vidrio lugar preparado en el paso 2.3.
  10. Corte varias celdas porque una fracción de las células de corte no se regenerará.
  11. Realizar cortes múltiples en una sola sesión, reemplazar la aguja de vidrio cuando se convierte en fuertemente recubierta Stentor residuos o cuando se rompe la punta. Por otra parte, limpie la aguja frotándola suavemente en un trozo de separador de silicona.
    Nota: Las agujas de vidrio pueden utilizarse para múltiples sesiones de corte de la célula.
  12. Mantenga la placa punto con fragmentos de células en una cámara de humedad.
  13. Proceder a la sección 4 del protocolo para obtener detalles sobre la proyección de imagen e interpretación de los resultados de regeneración de Stentor .

3. inducir la regeneración de la banda Membranellar y aparato bucal por sacarosa o Urea tratamiento

  1. Membranellar banda y oral eliminación del aparato usando sacarosa
    1. Preparar una solución de 25% de sacarosa en PSW.
    2. Añadir 500 μl de sacarosa al 25% en PSW a un tubo de microcentrífuga con un casquillo rápido.
    3. Preparar 3 tubos de microcentrífuga con broche de presión con 1 mL de PSW en cada tubo para el lavado de las células después de tratamiento con sacarosa.
    4. Recoger 30-60 Stentor células en 1 mL de sus medios de cultivo en un tubo de microcentrífuga separado usando una pipeta de 1 mL (figura 4, flecha A).
    5. Recoge todas las células del tubo en el volumen final de 125 μl con pipeta 200 μL en un solo sorteo. Transferencia al tubo con 500 μl de sacarosa al 25% (preparada en el paso 3.1.2) para obtener 625 μl de solución de sacarosa al 20% (figura 4, flecha B). Poner en marcha un cronometro.
    6. Incubar Stentor en esta solución de sacarosa al 20% y flick-haga girar el tubo de microcentrífuga en rack para 1 minuto.
    7. Recoger todas las celdas en un solo sorteo (ajustar la pipeta a la capacidad máxima de 200 μL para la recolección más fácil).
    8. Mantener las células en la punta de la pipeta hasta que el cronómetro muestra 2 minutos de tratamiento con sacarosa.
    9. Expulsión de Stentor en uno de los tubos de microcentrífuga preparados en el paso 3.1.3 (figura 4, flecha C). Flick-haga girar el tubo en el bastidor.
    10. Lavan las células dos veces más, una vez en cada uno de los dos restantes tubos de microcentrífuga con PSW preparado en el paso 3.1.3 (figura 4, las flechas D y E).
      Nota: Solo sorteo celular colección técnica no es importante entre los lavados.
    11. Proceder a la sección 4 del protocolo para obtener detalles sobre la proyección de imagen e interpretación de la dinámica de regeneración de Stentor (figura 4, las flechas F y G).
  2. Membranellar banda y oral eliminación del aparato usando urea
    1. Preparar una solución de 4% de urea en PSW.
    2. Añadir 300 μL de 4% de urea en PSW a un tubo de microcentrífuga con un casquillo rápido.
    3. Preparar 3 tubos de microcentrífuga con snap caps que contiene 1 mL de PSW en cada tubo para el lavado de las células después del tratamiento de urea.
    4. Recoger 30-60 Stentor células en 1 mL de sus medios de cultivo en un tubo de microcentrífuga separado usando una pipeta de 1 mL (figura 4, flecha A).
    5. Recoge todas las células del tubo del volumen final de 300 μL utilizando una pipeta de 1 mL en un solo sorteo. Transferencia al tubo con 300 μL de 4% de urea (preparado en el paso 3.2.2) para obtener 600 μl de solución de urea 2% (figura 4, flecha B). Poner en marcha un cronometro.
    6. Incubar Stentor en esta solución al 2% urea y flick-haga girar el tubo de microcentrífuga en rack para 1 minuto.
    7. Recoge todas las celdas de un solo empate.
    8. Mantener las células en la punta de la pipeta hasta que el cronómetro muestra 2 minutos de tratamiento de urea.
    9. Expulsión de Stentor en uno de los tubos de microcentrífuga preparados en el paso 3.2.3 (figura 4, flecha C). Flick-haga girar el tubo en el bastidor.
    10. Lavan las células dos veces más, una vez en cada uno de los dos restantes tubos de microcentrífuga con PSW preparado en el paso 3.2.3 (figura 4, las flechas D y E).
      Nota: Solo sorteo celular colección técnica no es importante entre los lavados.
    11. Proceder a la sección 4 del protocolo para obtener detalles sobre la proyección de imagen e interpretación de la dinámica de regeneración de Stentor (figura 4, las flechas F y G).

4. la proyección de imagen y análisis de la regeneración celular

  1. Si usa un microscopio vertical, use el colgante método de la gota a la regeneración de la imagen de células individuales.
    1. Ponga 100 μl de PSW en un pozo de una placa de cristal de punto.
    2. Aislar 1 celda de Stentor en 4 μL de medios de cultivo (los medios de comunicación que estén), utilizando un 10 o 20 μl de pipeta. Depositar la gota en el centro del cubreobjetos 22 x 22 mm2 (figura 5).
      Nota: Si las células que son 1) insalubres (forma anormal o altamente vacuolated) o 2) todavía tienen bandas de membranellar o aparatos orales (para los experimentos de tratamiento químico), no utilice para la proyección de imagen.
    3. Coloque 4 gotas más de Stentor en los medios de cultivo alrededor de la gota anterior, dejando suficiente espacio entre las gotas.
    4. Invertir el cubreobjetos con gotitas y colóquela suavemente sobre el pozo de la placa punto a que PSW se agregó en el paso 4.1.
    5. Nota: El PSW en el pozo reducirá al mínimo la evaporación de las gotas (figura 5).
    6. Preparar las células restantes para la proyección de imagen siguiendo pasos 4.1.1 - 4.1.4.
    7. Imagen de las regeneración células bajo el microscopio con la resolución de tiempo deseado. Por otra parte, observar la regeneración con un estéreo microscopio de disección.
      Nota: Regeneración comenzará inmediatamente después del corte de la célula o el tratamiento con sacarosa o urea. Sin embargo, visibles nuevas estructuras orales forman aproximadamente 3 h después del inicio de la regeneración.
  2. Para cada punto del tiempo, una de las tres etapas de regeneración asignar a cada una de las células. Para ello, comparar cada celda a las imágenes representativas que ilustran las etapas (figura 4 y figura 6).
    1. Asignar etapa 1 a las células que no tienen todavía una banda de membranellar (figura 6A).
    2. Asignar 2 etapa a las células con una banda de membranellar.
      Nota: Una banda de membranellar aparece 3-6 h después del tratamiento (figura 4, Figura 6B). Al final de esta etapa, una curvatura adicional de la parte posterior de la banda de membranellar aparecerán justo antes de que aparezca un primordio oral.
    3. Asignar 3 etapa a las células con un primordio oral.
      Nota: Un primordio oral es una invaginación que aparecen 6-8 h después del tratamiento en el extremo posterior de la banda de membranellar (figura 4, figura 6 y 6 D). Regeneración se completa cuando las células tienen una banda de membranellar en su extremo anterior y la forma de la célula de la trompeta característico (figura 4, figura 6E). Mayoría de las células de Stentor se regenera completamente en 8-9 h desde el inicio de la regeneración.
  3. Representar el porcentaje de células en cada una de las etapas de regeneración para cada punto del tiempo en forma de un gráfico de cajas apiladas (figura 7).
    Nota: Este tipo de trama permite la visualización de la dinámica de regeneración en una población de células.

Resultados

Stentor culturas han establecido y mantenido de células individuales o fragmentos celulares utilizando la sección 1 del Protocolo de forma fiable. Un ejemplo representativo de una cultura saludable grande se muestra en el Video 1.

El curso del tiempo de la regeneración se midió en Stentor utilizando el método de tratamiento de sacarosa para iniciar la regeneración que se describe en el paso 3.1, combinado con la proyección de imagen y el método de análisis discutidos en la sección 4 (figura 7). Esta trama indica que hay una propagación de una hora de duración en el tiempo por la población de células para alcanzar cualquier etapa particular. Este tipo de análisis permite el estudio de la heterogeneidad temporal en el proceso de regeneración en una población de regenerar las células.

El siguiente es un resumen de la programación de regeneración que se ha observado hasta el momento después de decenas de tratamientos de sacarosa (figura 4 y figura 6). Fase 1 es cuando las células Stentor ven como gotas de lágrimas sin ninguna banda de membranellar (esta etapa comienza inmediatamente después de lavado de sacarosa). Esta etapa dura de 3-6 h. fase 2 es cuando una banda de membranellar aparece y crece (3-6 h después de tratamiento con sacarosa). Esta etapa dura de 3-4 h. 3 etapa es cuando un primordio oral aparece en la parte posterior de la banda de membranellar (6-8 h después de tratamiento con sacarosa), y ambas estructuras se mueven hacia el extremo anterior de la célula. Esta etapa dura 1-2 h. Cuando la banda de membranellar y el aparato bucal alcanza el extremo anterior de la célula, esto indica la terminación de la regeneración. La célula ha adoptado forma de trompeta-como característica de Stentor . Las células fueron totalmente regenerado 8-9 h después de tratamiento con sacarosa.

Diagrama de paramecio con banda membrallada, aparato oral, vacuola de alimentos, macronúcleo marcado.
Figura 1. Instantánea de Stentor. La banda de membranellar y el aparato bucal se muestra en el extremo anterior de la célula. La holdfast está en el extremo posterior de la célula. Macronucleus Stentor es noduladas. Un bien alimentados Stentor tiene vacuolas de alimentos verdes que contienen en su mayoría Chlamydomonas. Barra de escala es 0,5 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Configuración del microscopio de disección; portaobjetos de vidrio con espécimen de Stentor para observación en investigación biológica.
Figura 2. Instalación de corte de Stentor . Corte de la célula se realiza manipulando manualmente una aguja de vidrio mientras mira a la célula con un microscopio estéreo disección disponible comercialmente. El propósito del pañuelo de papel es proporcionar el fondo blanco para ver las células mejor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Secuencia de microscopía de células en división, etiquetada A-F, que muestra etapas en el proceso mitótico.
Figura 3. Instantáneas de Video ilustrando cómo cortar un Stentor con una aguja de cristal de 3. (A) A Stentor inmediatamente antes de que la aguja llegue a él. (B) un Stentor aprieta suavemente entre un portaobjetos de vidrio y aguja. (C) A había contratado Stentor reaccionan a la fuerza de la aguja. (D) A Stentor a cortar presionando suavemente en la pila con el lado de la aguja. (E) A Stentor ahora cortada en dos pero no separados. (F) dos fragmentos de Stentor . Barra de escala es 0,25 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama del proceso de regeneración de Stentor con pasos de choque de sacarosa/urea, tubos de centrífuga, etapas celulares.
Figura 4. Visualización esquemática de la sección 3 y sección 4 del Protocolo de. Se trata de un protocolo ilustrado para la realización de sacarosa o urea tratamiento y observación de la regeneración de la célula. El tiempo indicado en el panel inferior se mide desde el inicio de la máquina 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Configuración de microscopio de disección, placa puntual de 9 pocillos, análisis de reacción de microgotas, estudio óptico.
Figura 5. La configuración para la observación directa o proyección de imagen de la regeneración con un microscopio vertical. En cada gota de μl 4 cuelgan de cubreobjetos, hay una célula en regeneración. Agua en los pozos de la placa punto limita la evaporación de las gotitas. Esta configuración permite después de la regeneración de varias celdas en paralelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis de la estructura celular de la planta; imágenes de microscopio A-E; enfatizar las variaciones de la morfología celular.
Figura 6. Instantáneas de Stentor en cada etapa de la banda de membranellar y la regeneración del aparato oral. (A) etapa 1 se caracteriza por una forma de lágrima como celular y la ausencia de la banda de membranellar. (B) fase 2 se caracteriza por la aparición de la banda membranellar, una estructura de cilios que late continuamente. Bandas de Membranellar están marcados con líneas blancas discontinuas en paneles B - D. (C y D) etapa 3 es caracterizada por la aparición del primordio oral (marcado con una flecha). Primordio oral parece una invaginación en el extremo posterior de la banda de membranellar. El primordio oral entonces se moverá hacia arriba hacia la parte anterior de la célula para convertirse en el aparato bucal. (E) la regeneración se completa cuando la célula ha adoptado la característica Stentor con forma de trompeta, y el aparato bucal (marcado con una flecha) se ha ensanchado en el extremo anterior de la célula. Barra de escala es 0,25 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráfico de barras de distribución de etapas celulares, tiempo posterior al choque de sacarosa, que muestra cuatro etapas durante 9 horas.
Figura 7. Apilados que muestra diagrama de caja como proporciones de células en todas las etapas de la regeneración después de tratamiento con sacarosa cambia con el paso del tiempo. La trama muestra heterogeneidad en el tiempo de las etapas de la regeneración dentro de una población de células regeneradoras. "Fin de reg." indica la finalización de la regeneración. El número de células: 28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Vaso de precipitados con cultivo de algas verdes para estudio de fotosíntesis en experimento de laboratorio.
Video de 1. Ejemplo de una sana cultura de Stentor . Generalmente, si una cultura es concentrado, División de la cultura se recomienda. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Gota bajo microscopio; estudio de tensión superficial líquida; método de microscopía; análisis educativo.
Video 2. Desaceleración de Stentor con metilcelulosa. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Imagen microscópica de una configuración microfluídica, destacando la posición de las gotas en un alambre delgado.
Video 3. Corte Stentor. Células individuales pueden ser cortadas manualmente en pedazos múltiples bajo un estéreo microscopio de disección presionando una aguja de vidrio a través de la célula. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Problema con la culturaPosible soluciónPrevención de posibles
Cultura es abrumada por rotíferos u otros grandes organismos.Quitar tantos Stentor como sea posible en un nuevo plato de cultura. Luego lavar las células 3 veces.Lave bien Stentor cuando recibirlos, aun cuando compra de un proveedor comercial.
Cultura es abrumada por hongos y otros organismos pequeños.Identificar una esquina donde hay menos Stentor. En esa zona, eliminar tanto los medios como sea posible sin la eliminación de muchos Stentor y agregue nueva PSW. Mezclar suavemente pero profundamente a representar los organismos invasores. Omitir la siguiente alimentación y Stentor come.Observar el cultivo regularmente y eliminar contaminantes pequeños mediante el intercambio de los medios de comunicación para fresco PSW.
Stentor están poniendo encima de la otra.Partido de la cultura de modo que la concentración es de menos de 20 células/mL.Dividir las culturas más a menudo.
Células de Stentor de apareamiento.Alimentar cada 4 días, en vez de cada 5 días.
Cultura tiene un montón de material de desecho oscuro.Eliminar tanto el material oscuro, residuos de Stentor , como sea posible sin la eliminación de las células. Si Stentor se unen al material oscuro, pipeta hacia arriba y hacia abajo para liberar las células de Stentor de sus residuos y luego retire los medios de comunicación con los residuos sin la eliminación de las células. O, retire los Stentor y por consiguiente la alimentación menos.Alimentación Stentor 1 mL menos de alimento por cada 100 mL de la cultura.
Aspecto saludable (vacuolated, hinchados o redondeados) Stentor. Eliminar tanto los medios como sea posible sin la eliminación de muchas células de Stentor y Añadir nueva PSW.Intercambiar periódicamente los medios de comunicación.

Tabla 1. Guía para el cultivo de Stentor.

Discusión

Cultivo de Stentor presenta una serie de desafíos. En primer lugar, para realizar experimentos que requieren grandes cantidades de células, es necesario mantener un gran número de culturas de Stentor , como las culturas se vuelven insalubres cuando Stentor concentración excede 20 células/mL. En segundo lugar, los organismos que pueden contaminar cultivos Stentor a menudo dividen más rápido que Stentor y aplastar la cultura (un contaminante común es rotíferos). Por lo tanto, es necesario inspeccionar periódicamente la cultura bajo un microscopio y eliminar los contaminantes. En ocasiones, una nueva cultura debe iniciar a partir de un pequeño número de células manualmente rescatado de un cultivo contaminado. Esto aumenta el tiempo necesario para mantener cultivos sanos de Stentor . En tercer lugar, ampliar una sola celda en una cultura de 400 mL requiere al menos un mes porque el ciclo celular de Stentor es 3-5 días. En cuarto lugar, a diferencia de otros modelo ciliates, Stentor raramente en forma del quiste y se puede congelar.

Un aspecto importante del cultivo de Stentor es la selección de un organismo de alimento apropiado. Previamente fueron descritos varios métodos para el cultivo de Stentor . Uno de ellos sugiere para utilizar leche descremada para cultivar bacterias que se alimentan entonces Stentor. Esta técnica es eficaz en cultivo Stentor; sin embargo, la aplicación de técnicas genómicas requiere muestras puras para evitar confusión de Lee genómico de organismos de la comida indefinido. Utilizando el protocolo actual, Stentor pueden cultivarse en masa y porque su alimento, Chlamydomonas, se ha secuenciado, la presencia de contaminación genómica del organismo de alimentos puede ser detectada y controlada para. Por razones desconocidas, tártaro tenía que reponer sus stocks por regresar a donde él encontró Stentor antes. Con el protocolo actual, hemos podido mantener Stentor durante años.

Experimentos de regeneración con Stentor están generalmente sencillos, pero hay algunos detalles importantes a tener en cuenta. Con respecto a la sección 2, corte Stentor células a la mitad pueden ser dominadas en minutos. Dominar procedimientos de microcirugía más avanzados de Stentor puede requerir una semana de práctica. Mientras que realizar un tratamiento de sacarosa o urea (sección 3), si al principio de la proyección de imagen la mayoría de las células todavía tiene sus bandas membranellar, aumentar el tiempo de incubación de 10-30 s para cuando se realiza tratamiento de sacarosa a continuación. No aumentan el tiempo de tratamiento con sacarosa más allá de 3 minutos de incubación ya que resultará en la muerte celular.

Proyección de imagen de Stentor regeneración requiere métodos de imagen grandes células durante largos períodos de tiempo. El método de proyección de imagen detallado en la sección 4 puede ser utilizado con un microscopio vertical. Si en cambio se dispone de un microscopio invertido, las células pueden colocarse en un portaobjetos o cubreobjetos en pequeñas cámaras. Un método consiste en crear una cámara de vaselina y cubierta con otro cubreobjetos para evitar la evaporación. Alternativamente, se puede hacer una cámara de una célula individual haciendo un agujero con una perforadora de tamaño deseado en un 1 x 1 cm2 de espaciador de silicio (tabla de materiales), colocar el separador en un cubreobjetos, poner las células en la cámara de y que cubre la cámara con otro cubreobjetos. Cuando la proyección de imagen, si no en la orientación correcta para observar los rasgos característicos de cada etapa de la regeneración de Stentor , golpee la placa firmemente para hacer el contrato de la célula. Ver la célula extender para identificar la etapa de regeneración (extensión completa lleva unos 45 s). Si la celda está todavía en la orientación incorrecta, repita el tapping. Las imágenes que se muestra en la figura 1 y figura 6 fueron tomadas por un microscopio de estereo zoom; sin embargo, se pueden realizar todos los experimentos detallados con un 5 X estéreo microscopio de disección.

Otro desafío además de cultivo y proyección de imagen Stentor es el seguimiento de la regeneración, específicamente la cantidad de tiempo necesario para identificar las etapas. Si la regeneración celular es perfectamente orientado con la región del primordio oral claramente visible, la identificación de la etapa tarda unos segundos. A veces, sin embargo, la célula de Stentor es en una orientación de prevención de la asignación clara de la etapa de regeneración, teniendo así más tiempo para identificar. La importante cantidad de tiempo requerido para la etapa las células regeneración individuales podrían retrasar la cuantificación de todas las células regeneradoras, disminuyendo la precisión temporal de staging y requiriendo el observador esperar y volver a la imagen la celda después de que se ha trasladado a una nueva orientación. Por lo tanto, este experimento es tiempo y mano de obra. Por estas razones, sería altamente deseable para el desarrollo de métodos automatizados para detectar las células de Stentor y la asignación de las etapas de regeneración de datos de microscopia video. Estos también permitiría más experimentos reproducibles, aumenta el tamaño de la muestra, y la eliminación de los prejuicios humanos.

La aparición de métodos altamente sensibles de genómica y proteómica ha comenzado a poner los estudios de las células en alcance. Para tales análisis unicelular, el tamaño gigante de una célula de Stentor , es un tema de prueba conveniente para los experimentos de prueba de concepto. Para tales experimentos a ser posible, cultivo de Stentor es fundamental, y así los métodos descritos aquí deben desempeñar un papel en el desarrollo de las técnicas más avanzadas de unicelular.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH R01 GM113602 (WFM) y la NSF 1144247 (AL). Reconocemos Mark Slabodnick y Natalie Kirkland para el desarrollo de las versiones iniciales de algunos de estos protocolos y debates informativos. Agradecemos a Karina Perlaza y Greyson Lewis para la lectura crítica del manuscrito.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Stentor coeruleus cultivo vivoCarolina Biological Supply131598
Chlamydomonas reinhardtii en agarCarolina Biological Supply152040
Agua de manantial pasteurizada, botella de 1 cuarto de galónCarolina Biological Supply132458
Metilcelulosa, 1500 cPMillipore SigmaM0387
Placa de vidrio PyrexFisher Scientific13748B
Frasco de vidrio de boca ancha con tapón de rosca, 60 mLCarolina Biological Supply715740
Recipiente de vidrio de 2 tazas con tapa de vidrioPyrex1095600
Material de lámina de silicona CultureWell GraceBio Labs664475
KimwipesKimberly Clark34155
Tubo de microcentrífuga Posi-Click de 1,7 mlDenvilleC2170
Cubiertade vidrio Fisher finest12-548-B
TAP Medios de crecimiento, optimizados para cultivos ChlamydomonasThermoFisherA1379801
Espaciador de silicona, lámina de silicona CultureWell, 0,25 mm de grosor/13 cm x 18 cmGrace Bio Labs664475
Vaselina, vaselina, espectro blancoP1037
Tubos capilares de vidrio de borosilicato.
OD: 1,2 mm, ID: 0,9 mm, longitud: 10 cm.		Sutter InstrumentB120-90-10
Tirador de agujas P-87Sutter Instrument
Stemi 2000Zeiss
Axiozoom V16, microscopio estereoscópico con zoomZeiss
Microscopio estereoscópico

Referencias

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  4. Frankel, J. Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , Oxford University Press. Oxford. (1989).
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  8. Slabodnick, M. M., et al. The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell. Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).
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  10. Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus. Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848(2013).
  11. Tartar, V. Biology of Stentor. , Pergammon Press. Oxford. (1961).
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